王彥輝,楊彩英,馬永林,黃輝曄,郭成林,覃建林,馬躍峰
廣西甘蔗田馬唐對(duì)莠去津抗性水平檢測(cè)及機(jī)理初探
王彥輝1,2,楊彩英1,馬永林1,2,黃輝曄1,2,郭成林1,2,覃建林1,2,馬躍峰1,2
(1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,廣西南寧530007;2.廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530007)
【目的】開(kāi)展廣西甘蔗田間雜草馬唐(Digitaria sanguinalis)對(duì)莠去津的抗藥性及抗性機(jī)理的研究,為其科學(xué)防除和抗性治理提供參考?!痉椒ā坎捎门柙栽囼?yàn),利用整株法測(cè)定采集于廣西蔗區(qū)的25個(gè)馬唐種群對(duì)莠去津的抗性水平;采用生理生化和分子生物學(xué)等方法分析研究馬唐抗莠去津的機(jī)理?!窘Y(jié)果】供試馬唐種群中76%對(duì)莠去津產(chǎn)生抗性,其中貴港1號(hào)馬唐種群相對(duì)抗性水平最高,抗性指數(shù)為37.2。崇左4號(hào)為敏感品系,百色1號(hào)和柳州2號(hào)種群3 d后GSTs相對(duì)活力明顯高于敏感種群;對(duì)葉綠素上的D-1蛋白的編碼基因psbA基因進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)抗性種群psbA基因均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變,GSTs的活性增強(qiáng)與馬唐對(duì)莠去津的抗性相關(guān)?!窘Y(jié)論】廣西甘蔗種植區(qū)馬唐對(duì)莠去津抗性水平為低到中抗水平,GSTs酶活性的增強(qiáng)可能是產(chǎn)生抗性的主要原因之一。
馬唐;莠去津;抗性;GSTs;psbA
【研究意義】莠去津(Arazine)為三氮苯類除草劑,其作用機(jī)理是通過(guò)改變膜蛋白的空間構(gòu)型,干擾雜草的光合作用,導(dǎo)致雜草死亡,在我國(guó)主要用于甜高粱、甘蔗、高粱、玉米等作物田間除草。目前該類除草劑已成為產(chǎn)生抗性最為嚴(yán)重的除草劑之一[1]。馬唐(Digitaria sanguinalis)是我國(guó)分布廣泛的一種的農(nóng)田雜草,主要危害玉米、豆類、棉花、花生、甘蔗、蔬菜和果樹(shù)等作物。在廣西地區(qū)甘蔗田中常年(使用10年以上)使用莠去津進(jìn)行防除,單一使用該藥劑已經(jīng)造成田間防效下降,因此,研究馬唐對(duì)莠去津的抗藥性機(jī)制,對(duì)合理防控雜草,延緩具有除草劑的使用年限具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】廣西蔗區(qū)常用的除草劑使用較為單一,其中芽前除草劑主要為莠去津和乙草胺。除草劑莠去津在甘蔗地使用量大和年限長(zhǎng),對(duì)抗藥性研究較少。1970年Ryan等首次報(bào)道了千里光對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)抑制劑莠去津產(chǎn)生抗藥性,目前已經(jīng)超過(guò)了80多種雜草生物型對(duì)PSⅡ抑制劑(三唑酮、尿嘧啶和其他三氮苯除草劑)產(chǎn)生抗藥性[1-2]。有關(guān)研究認(rèn)為雜草抗PSⅡ抑制劑的機(jī)理主要是D-1蛋白psbA基因突變(靶標(biāo)位點(diǎn))和代謝能力增強(qiáng)(非靶標(biāo)位點(diǎn))[3-5]。大多數(shù)雜草對(duì)PSⅡ抑制劑的抗性是除草劑靶標(biāo)位點(diǎn)或者靶標(biāo)蛋白(D-1蛋白)改變、親和性下降引起的。Hirschberg和McIntosh首先報(bào)道了莧菜對(duì)莠去津的抗性機(jī)理,發(fā)現(xiàn)類囊體膜的D-1蛋白的228位上的一個(gè)絲氨酸被甘氨酸所取代,導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生[3]。三氮苯類除草劑通過(guò)氫鍵與Ser264的羥基和Phe265的氨基于氨基酸在PQ結(jié)合相互作用,同時(shí)與Phe255的苯環(huán)產(chǎn)生疏水反應(yīng)。氨基酸Ser264被Gly取代后三氮苯類除草劑在D-1蛋白上結(jié)合的氫鍵被移除,導(dǎo)致除草劑對(duì)D-1蛋白的親和力下降,從而降低除草劑的生物活性或產(chǎn)生抗性[6]。該突變也是造成其他PSⅡ抑制劑抗性原因,較多研究結(jié)果表明其為雜草對(duì)PSⅡ抑制劑三氮苯類除草劑產(chǎn)生抗藥性的分子機(jī)理[7-9]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)廣西甘蔗田馬唐對(duì)莠去津的抗性水平和抗性機(jī)理報(bào)道較少?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以廣西甘蔗區(qū)馬唐種群為研究對(duì)象,檢測(cè)其對(duì)莠去津的抗性水平,并對(duì)抗性機(jī)理進(jìn)行初探。厘清廣西甘蔗田馬唐抗性水平,初步探明研究馬唐對(duì)莠去津的抗性機(jī)理,為指導(dǎo)科學(xué)合理用藥和抗PSⅡ抑制劑類雜草的治理提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
于2014-2015年采集與廣西14個(gè)縣的甘蔗產(chǎn)區(qū),直接采集成熟的馬唐種子;在室內(nèi)自然風(fēng)干后,放入250 mL的棕色玻璃瓶中,置于種子儲(chǔ)存柜中保存。供試儀器設(shè)備為:種子存儲(chǔ)柜(杭州托普儀器有限公司);光照培養(yǎng)箱(寧波賽福有限公司); 3WPSH-500D型生測(cè)噴霧塔(農(nóng)業(yè)部南京農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所制);UV-1240型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);Z326K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)hemmer公司);梯度PCR儀(德國(guó)耶拿分析儀器股份公司)。供試試劑包括:80%敵草隆水分散粒劑(以色列馬克西姆阿甘工業(yè)公司);谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase,GSTs)酶活性測(cè)定試劑盒(南京建成公司);植物DNA提取試劑盒(Omega Biotek公司);Taq PCR StarMix試劑(北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司)等。
1.2.1 整株植物測(cè)定法[10]在溫室中將催芽后的30粒種子,均勻播種在直徑為12 cm(直徑)×10 cm(深)的塑料盆中,播種后馬唐種子覆蓋一層薄土,保證出苗率。試驗(yàn)時(shí)期溫度為25~35℃。待植株長(zhǎng)至2~3葉期間苗,保留長(zhǎng)勢(shì)基本一致的植株10株,3~4葉期間噴藥處理。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用配置一系列濃度,0、0.3125、0.625、1.250、2. 500、5.000、10.000和20.000 g/L。每個(gè)處理3次重復(fù),14 d后剪取地上部分,稱量鮮物質(zhì)質(zhì)量,數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件處理,計(jì)算抑制中量IC50。
1.2.2 GSTs活性測(cè)定植株前處理同 1.2.3的方法,選擇不同抗性種群進(jìn)行GST酶活性研究,在3~4葉期噴濃度為1.25 g/L的莠去津,藥后0、0.25、1、3、5、7 d采集馬唐葉片,立即冷凍到-80℃冰箱中待用;每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。莠去津處理后GSTs酶液提取參照吳進(jìn)才等的方法。稱取采集的莠去津樣品0.5 g,剪碎放入預(yù)冷后的研缽中,加入適量液氮快速研磨成細(xì)粉,再加入8 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L,pH 8.0,含還原型谷胱甘肽25mmol/L,5%聚乙烯吡咯烷酮),研磨勻漿,取上清液于14 000× g再離心10 min,上清液即為粗酶液。GSTs活性測(cè)定采用南寧建成有限公司生產(chǎn)的試劑盒。蛋白質(zhì)的含量測(cè)定采用Bradford的考馬斯亮藍(lán)G-250法,以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.3 靶標(biāo)基因突變檢測(cè) 在NCBI上下載馬唐psbA基因序列(KM453691.1)以及其他同源性高的psbA基因序列,設(shè)計(jì)上游引物為F1(5′-ATGACTGCAATTTTAGAGAGACGCGAAAG-3′),下游引物R3 (5′-AATAGGTAATCCTCTACCTTGAAGTTCTCGTCG-3′);葉片在4~5葉期收集,對(duì)psbA全長(zhǎng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。馬唐DNA提取采用Omega的植物提取試劑盒,按照說(shuō)明書操作。總反應(yīng)體系為20μl;正向引物與反向引物各1μl,模板DNA 1μl,Taq PCR Star-Max 10μl,ddH2O補(bǔ)足至20μl,PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃,5 min;35循環(huán):變性95℃,30 s;退火55℃,1 min;延伸72℃,1min;最終延伸72℃,10 min;4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后,取5μl PCR產(chǎn)物,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否有目的條帶,然后進(jìn)行膠回收測(cè)序。
從測(cè)定結(jié)果(表1)可以看出,不同馬唐生物型對(duì)莠去津的抗性水平差異較大,所測(cè)25個(gè)馬唐生物型對(duì)莠去津的抗性水平差異較大,以崇左4號(hào)為最敏感種群,其中5個(gè)生物型(河池1號(hào)、來(lái)賓2號(hào)、崇左1號(hào)、崇左3號(hào)、百色2號(hào)等)對(duì)莠去津較敏感;5個(gè)生物型(南寧1號(hào)、崇左2號(hào)、貴港3號(hào)、百色1號(hào)、崇左5號(hào))抗藥性水平較低,抗藥性指數(shù)為2~10;其余15個(gè)生物型對(duì)其抗性為中等水平,其中崇左1號(hào)抗藥性指數(shù)最高,為37.2,南寧2號(hào)和南寧3號(hào)對(duì)莠去津抗藥性指數(shù)也在30及上。
表1 馬唐對(duì)莠去津抗性水平測(cè)定Table 1 The resistance level of different Digitaria sanguinalis populations to atrazine
以崇左4號(hào)敏感種群,分別選取抗性種群百色1號(hào)、柳州2號(hào)和貴港1號(hào)測(cè)定GSTs活性,研究GSTs活性與抗性的關(guān)系。因不同的種群GSTs酶活性本底不同,本研究采用相對(duì)活性研究GSTs的變化。經(jīng)莠去津1.25 g/L處理后,所有種群GSTs相對(duì)活力開(kāi)始上升,敏感種群在第1天達(dá)到最大值,是對(duì)照的1.64倍,然后開(kāi)始下降,第5天之后趨于平緩。柳州2號(hào)和百色1號(hào)種群經(jīng)藥劑處理后,在第3 d達(dá)到最高值,為對(duì)照的1.73和1.55倍,之后下降,在第3天后的相對(duì)活性均高于敏感種群。然而貴港種群在藥劑處理后GSTs相對(duì)活性一直低于敏感種群和另外兩個(gè)種群,這說(shuō)明除GSTs酶參與抗性,可能還有其他抗性機(jī)制的存在(圖1)。
圖1 抗性及敏感馬唐種群莖葉組織GSTs活力變化Fig.1 The activity variation of GSTs in resistant and susceptible Digitaria sanguinalis
圖2 馬唐psbA基因DNA凝膠電泳檢測(cè)Fig.2 Identification of psbA gene from Digitaria sanguinalis on 1.0 %agarose gel
根據(jù)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,能很好的擴(kuò)增出1000 bp左右的基因,見(jiàn)圖2。通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析與NCBI提交的psbA基因序列相似度高于90%,證明該引物能很好的擴(kuò)增出psbA基因。與敏感性種群對(duì)比,抗性種群psbA基因并沒(méi)有發(fā)生突變,說(shuō)明馬唐對(duì)莠去津的抗性機(jī)制很可能是非靶標(biāo)抗性。
廣西是我國(guó)主要的甘蔗生產(chǎn)地之一,莠去津因除草效果好、性價(jià)比高,受到農(nóng)民的歡迎。然而使用年限較長(zhǎng),田間藥效試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)馬唐的防除效果明顯下降的現(xiàn)象。周青等[11]通過(guò)田間和室內(nèi)生物測(cè)定,發(fā)現(xiàn)河南安陽(yáng)地區(qū)玉米田的馬唐對(duì)阿特拉津、乙阿合劑產(chǎn)生抗性,田間用藥劑量為推薦劑量的1倍以上。王金信[1]也報(bào)道了山東地區(qū)的馬唐對(duì)莠去津產(chǎn)生了抗性。本研究結(jié)果證實(shí)了廣西甘蔗田馬唐對(duì)莠去津已經(jīng)產(chǎn)生不同程度的抗藥性,相對(duì)抗藥性倍數(shù)最高達(dá)37.2。造成廣西不同地點(diǎn)甘蔗田馬唐抗性程度差異較大的原因,也與當(dāng)?shù)氐挠盟帤v史、地理特征和作物種植方式有關(guān)。造成雜草抗性水平高低差異的原因還與其抗藥機(jī)制不同有關(guān)。
一些學(xué)者已經(jīng)證明雜草對(duì)莠去津的抗性主要機(jī)制是GSTs酶活性的增強(qiáng)和psbA靶標(biāo)基因發(fā)生突變。高等植物體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性和解毒能力增強(qiáng)是許多雜草對(duì)三氮苯類、脲類及酰胺類除草劑的一種重要解毒機(jī)制[12-13]。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是一個(gè)多功能酶家族,它催化谷胱甘肽與多種親電子和疏水底物相結(jié)合,使與之相結(jié)合的除草劑或者外源物排除體外從而達(dá)到解毒目的。玉米耐受三氮苯類除草劑是一個(gè)典型的例子,它因GSTs有較高的催化活性使三氮苯與谷胱甘肽軛合,因此玉米田能廣泛使用三氮苯除草劑。GSTs在玉米體內(nèi)的解毒機(jī)理已經(jīng)被很好的闡述,該類酶均為二聚體,通過(guò)不同的亞基組成不同的同工酶,通過(guò)酶解除莠去津毒害。事實(shí)也證明,抗性和敏感性苘麻生物型體內(nèi)類囊體均被莠去津相同程度地抑制,證明其抗藥性不是由于D-1蛋白敏感性降低,三氮苯類除草劑莠去津與谷胱甘肽軛合作用的增強(qiáng),提高了苘麻(Abutilon theophrasti)對(duì)除草劑的解毒能力,才是產(chǎn)生抗藥性的主要原因。
靶標(biāo)位點(diǎn)突變是導(dǎo)致雜草對(duì)PSII抑制劑抗性的另一個(gè)重要機(jī)制。目前已經(jīng)報(bào)道的突變位點(diǎn)主要包括Val219Ile[14-16],Phe255Ile[17],Ser264Thr[18],Asn266Thr[19],Ala251Val[20],Leu218Val和Ser264Gly[21]。不同的位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致不同的交互抗性。Val219Ile突變引起雜草對(duì)敵草隆、嗪草酮、利谷隆和丁噻隆等4種PSII抑制劑均能產(chǎn)生抗性。然而Ser264Gly突變僅能對(duì)三嗪類產(chǎn)生較高的抗性。為了預(yù)防雜草抗藥性突變以及控制抗藥性雜草的擴(kuò)散、蔓延,應(yīng)避免單一或同一作用機(jī)制除草劑;同時(shí),還應(yīng)及時(shí)診斷、鑒別,提供適應(yīng)于當(dāng)?shù)乜顾幮噪s草的防除技術(shù)措施,延緩雜草抗藥性的發(fā)生,從而延長(zhǎng)除草劑的使用壽命,保障雜草的有效治理和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
本研究結(jié)果表明,廣西大部分甘蔗種植區(qū)馬唐對(duì)莠去津產(chǎn)生抗性,抗性水平在低到中抗水平。選取不同抗性水平的3個(gè)種群對(duì)抗性機(jī)理進(jìn)行初探,并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)基因突變,GSTs酶活性的增強(qiáng)可能是抗性主要原因之一。
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(責(zé)任編輯 汪羽寧)
Resistance Level and M echanism s of Digitaria Sanguinalis to Atrazine in Sugarcane Field of Guangxi
WANG Yan-hui1,2,YANG Cai-ying1,MA Yong-lin1,2,HUANG Hui-ye1,2,GUO Cheng-lin1,2,QIN Jian-lin1,2,MA Yue-feng1,2
(1.Plant Protection Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Guangxi Nanning 530007,China;2.Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests,Guangxi Nanning 530007,China)
【Objective】The resistance and resistancemechanism ofweed crabgrass Digitaria sanguinalis to atrazine in Guangxisugarcane field were studied to provide references for scientific control and resistancemanagement.【Method】The resistance level of25 Digitaria sanguinalis population collected in Guangxi sugarcane area was determined by pot experiment and the whole plantmethod.The resistancemechanisms were studied by using physiologicalbiochemical andmolecular biologymethods.【Result】As to the resistance of76%to atrazine in the population,Guigang-1 was the highest,which resistance index(RI)was37.2.Chongzuo-4 wasa sensitive strain,the relative vigor of the GSTs of Baise-1 and Liuzhou 2 population were significantly higher than thatof the sensitive population after3 days,and the psbA gene of D-1 protein on chlorophyll was sequenced,and the psbA gene of the resistant population were found to have nomutation,and the activity of GSTs was increased with the resistance of Digitaria sanguinalis to Atrazine.【Conclusion】The resistance of Digitaria sanguinalis to atrazine in Guangxi sugarcane field is low tomedium level.The resistance of the resistant population to atrazinemay be related to the enhancement of GSTs activity.
Digitaria sanguinalis;Atrazine;Resistance;GSTs;PsbA
S566.1
A
1001-4829(2017)8-1790-05
10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.016
2017-03-29
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460479);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303031);廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(14-045-50-ST-08);廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(2015YT41)
王彥輝(1984-),男,河南開(kāi)封人,博士,副研究員,主要從事雜草抗藥性研究,E-mail:wangyanhui@gxaas.net。