余桂容，張 維，杜文平，宋 軍，陳 謙，徐利遠(yuǎn)*

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米外源基因ddPCR拷貝數(shù)分析

余桂容1，張 維2，杜文平1，宋 軍1，陳 謙1，徐利遠(yuǎn)1*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川成都 610066;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081)

【目的】本研究是從前期獲得的100余份轉(zhuǎn)基因抗除草劑草甘騰玉米品系中，挑選T抗-1等14個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)?！痉椒ā坎捎靡环N新型的拷貝數(shù)分析方法——微滴數(shù)字PCR技術(shù)(droplet digital PCR，簡(jiǎn)稱(chēng)ddPCR)，設(shè)計(jì)特異引物對(duì)外源抗草甘騰基因2mG2-epsps進(jìn)行絕對(duì)定量分析?！窘Y(jié)果】供試的14份轉(zhuǎn)基因材料中10份是單拷貝品系。同時(shí)，通過(guò)引物探針特異性試驗(yàn)、葉片基因組DNA的PCR抑制和濃度檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因2mG2-epsps的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)和基因組DNA的酶切等系列研究，建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因玉米拷貝數(shù)分析的ddPCR檢測(cè)體系?！窘Y(jié)論】微滴數(shù)字PCR技術(shù)為這批轉(zhuǎn)基因玉米的下一步轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)提供了重要參數(shù)，同時(shí)建立了轉(zhuǎn)基因玉米(geneticallymodified maize)外源基因拷貝數(shù)ddPCR分析方法。

轉(zhuǎn)基因玉米;草甘騰抗性;外源基因;拷貝數(shù);微滴數(shù)字PCR(ddPCR)

【研究意義】自1996年轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化種植20多年以來(lái)，全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積迅猛發(fā)展，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，如何準(zhǔn)確、精確地確定轉(zhuǎn)基因生物的外源基因拷貝數(shù)，已經(jīng)成為現(xiàn)今轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)研究的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)[1]。無(wú)論國(guó)際還是國(guó)內(nèi)在轉(zhuǎn)基因生物安全管理和安全評(píng)價(jià)過(guò)程中，外源基因拷貝數(shù)都是生物安全評(píng)價(jià)的重要評(píng)價(jià)參數(shù)。因?yàn)橥庠椿蛘线M(jìn)入作物受體基因組的方式(插入位點(diǎn)、拷貝數(shù)和旁側(cè)序列等)會(huì)影響目的基因和功能蛋白的表達(dá)以及外源基因在受體中的遺傳穩(wěn)定性，特別是整合的拷貝數(shù)多少影響尤為重要[2]。目前，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因方法都是隨機(jī)整合進(jìn)入受體基因組，而且大多數(shù)是以多拷貝的方式整合到受體基因組上。通常當(dāng)外源基因以1～2個(gè)低拷貝數(shù)整合到受體基因組時(shí)可以高效的表達(dá)，而多拷貝數(shù)的整合會(huì)造成不穩(wěn)定表達(dá)，甚至基因沉默[3]。因此，探明轉(zhuǎn)基因材料的外源基因拷貝數(shù)對(duì)于下一步的育種應(yīng)用顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年來(lái)興起的一種新的絕對(duì)定量技術(shù)，通過(guò)極度稀釋實(shí)現(xiàn)理論上的單分子擴(kuò)增，然后用終點(diǎn)法PCR和泊松分布計(jì)算出樣品的原始濃度[4]。將含有模板、引物/熒光探針、耐熱DNA復(fù)制酶及其緩沖液的熒光PCR反應(yīng)體系充分混勻之后等量均分為相互隔離的(大于10000個(gè))油包水微滴，使每個(gè)模板獨(dú)立隨機(jī)地分配至微滴中;所有微滴同時(shí)在相同的規(guī)定條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)之后，根據(jù)設(shè)定的熒光閾值判斷每個(gè)微反應(yīng)體系的擴(kuò)增結(jié)果;依據(jù)微滴的陽(yáng)性率和泊松分布公式計(jì)算得到ddPCR反應(yīng)體系中的模板濃度。依據(jù)樣品DNA溶液中的外源基因序列(exogenousgene sequence)和玉米特異性基因(Species specific gene)的模板濃度之比，得到樣品中外源基因拷貝數(shù)。姜羽[5]等利用ddPCR分析轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)表明，微滴數(shù)字PCR方法是一種經(jīng)濟(jì)、快速和準(zhǔn)確的外源基因拷貝數(shù)分析新方法，靈敏度和準(zhǔn)確性高，將會(huì)在拷貝數(shù)分析中廣泛應(yīng)用。潘廣[6]等應(yīng)用雙重?cái)?shù)字PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米成分進(jìn)行定量方法研究，建立了轉(zhuǎn)基因玉米T25雙重?cái)?shù)字微滴式PCR定量方法。姜志軍[7]等以微滴數(shù)字PCR技術(shù)簡(jiǎn)便快速的完成外源草甘膦抗性基因G23VEPSPS拷貝數(shù)的分析。同時(shí)，微滴數(shù)字PCR方法也在食品成分分析、臨床診斷、基因表達(dá)分析[8]、微生物檢測(cè)[9]、新一代測(cè)序驗(yàn)證[10]等領(lǐng)域具有巨大優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力。苗麗[11-12]等利用微滴數(shù)字PCR分析肉制品中豬源性、牛源性、羊源性成分分析，檢測(cè)顯示該方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出不同樣品中不同肉源的含量。耿娟[13]等利用數(shù)字PCR進(jìn)行產(chǎn)前診斷，可在介入性產(chǎn)前診斷及無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷胎兒非整倍體疾病和單基因疾病方面具有重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】ddPCR平臺(tái)已經(jīng)用于測(cè)量轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分的定量分析等[14]，但基于ddPCR平臺(tái)的轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)的分析工作報(bào)道較少。本研究基于ddPCR平臺(tái)，建立了轉(zhuǎn)基因玉米外源基因拷貝數(shù)分析方法。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究結(jié)果為為這批轉(zhuǎn)基因玉米的下一步轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)提供了重要參數(shù)，為這批材料的進(jìn)一步培育轉(zhuǎn)基因新品種奠定基礎(chǔ)，也為分析其他轉(zhuǎn)基因玉米品系外源基因拷貝數(shù)提供了新的方法和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以轉(zhuǎn)基因抗除草劑草甘膦玉米T抗-1等14個(gè)品系為研究對(duì)象，一個(gè)非轉(zhuǎn)基因玉米品系為陰性對(duì)照，共15份材料，樣品性質(zhì)為玉米葉片。

樣品來(lái)源:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所2016年春季大田種植121份轉(zhuǎn)基因抗除草劑草甘膦玉米品系，經(jīng)抗性篩選結(jié)合田間農(nóng)藝性狀的綜合表現(xiàn)，挑選14個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)，樣品編號(hào)見(jiàn)表1，外源基因都為2mG2-epsps，且使用同一載體。

抗除草劑草甘膦基因2mG2-epsps來(lái)源:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所林敏研究員課題組。

1.2 試劑與設(shè)備

ddPCRTMSupermix for probes，Droplet Generation Oil for Probes為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品;內(nèi)切酶為大連寶生物公司產(chǎn)品。其他常用試劑均是國(guó)產(chǎn)試劑;引物和探針由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

Bio-Rad QX200 ddPCR微滴生成儀和讀數(shù)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);7500 Real-Time PCR儀美國(guó)AB公司。高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);紫外分光光度計(jì)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.3 測(cè)試方法

1.3.1 葉片基因組DNA提取 DNA提取采用Murray和Thompson等的CTAB法，略做修改。

1.3.2 引物與探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)插入基因序列信息，為了使擴(kuò)增片段能代表完整可表達(dá)的2mG2-epsps基因，將引物探針設(shè)置在2mG2-epsps基因和前導(dǎo)肽的結(jié)合區(qū)，進(jìn)行同源序列比對(duì)，運(yùn)用Primer Express 5.0軟件設(shè)計(jì)數(shù)字PCR引物和探針。引物和探針序列見(jiàn)表2。

為了使擴(kuò)增片段能代表可完整可表達(dá)的2mG2-epsps基因，將引物探針設(shè)置在2mG2-epsps基因和前導(dǎo)肽的結(jié)合區(qū)。

玉米內(nèi)參基因引物和探針:根據(jù)文獻(xiàn)，玉米Hmg基因?yàn)閱慰截惢颍湟锖吞结樜恢萌缦滤?

表1 玉米葉片樣品編號(hào)Table 1 The number of corn leaf sample

表2 引物和探針序列Table 2 Primer and probe sequences for ddPCR assays

1.3.3 轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因?qū)崟r(shí)PCR檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25μl:ABI Taq man PCR mastermix 12.5μl，上、下游引物各1μl(10μmol)，探針1μl(10μmol)，DNA模板(10～100 ng/μl)5 μl，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:50℃/ 2 min;95℃/10 min;95℃/15s，60℃/1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.3.4 基因組DNA的酶切 經(jīng)對(duì)外源基因的分析，選擇Sal I對(duì)基因組進(jìn)行酶切，Sal I的酶切位點(diǎn)為:G/TCGAC。

酶切體系:Sal I(takara)1μl，10×Buffer 2μl，DNA 5μl，ddH2O 12μl，酶切條件:37℃60 min，95℃10 min。

1.3.5 Hmg基因和2mG2-epsps基因濃度的ddPCR檢測(cè) 采用玉米Hmg基因和轉(zhuǎn)基因2mG2-epsps的引物探針?lè)謩e擴(kuò)增玉米14個(gè)樣品酶切后DNA。

微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系為:ddPCRTMSupermix for Probes 10μl，上、下游引物各1μl(10μmol/ L)，探針1μl(10μmol/L)，DNA模板(10～100 ng/ μl)5μl，加雙蒸水補(bǔ)足總體積至20μl。

將生成的微滴全部轉(zhuǎn)入96孔熒光PCR反應(yīng)板中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。熒光PCR包括3個(gè)步驟:95℃預(yù)變性10 min;94℃變性30 s，60℃退火1 min，50個(gè)循環(huán);98℃固化微滴10 min。最后用微滴分析儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針特異性實(shí)驗(yàn)

采用轉(zhuǎn)基因玉米2mG2-epsps基因的引物/探針對(duì)陰性對(duì)照和14個(gè)樣品的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。陰性對(duì)照和陽(yáng)性樣品的擴(kuò)增結(jié)果顯示，2mG2-epsps基因的引物探針特異性良好，除陽(yáng)性樣品外，空白和陰性樣品均沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增(圖1)。以上結(jié)果說(shuō)明表2中的引物和探針均能有效擴(kuò)增靶基因。這些引物和探針可以用于后續(xù)的微滴式數(shù)字PCR定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

2.2 葉片基因組DNA的PCR抑制和濃度檢測(cè)

采用玉米內(nèi)參Hmg基因的ZM1引物/探針對(duì)陰性對(duì)照和14份樣品的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果表明，所有樣品DNA溶液沒(méi)有明顯擴(kuò)增抑制，濃度和純度適于后續(xù)ddPCR檢測(cè)(圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因2mG2-epsps的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

為了確定樣品中轉(zhuǎn)基因玉米2mG2-epsps基因的存在，采用2mG2-epsps基因的特異性引物/探針對(duì)14個(gè)樣品的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果顯示，樣品中存在靶基因，需進(jìn)行后續(xù)ddPCR測(cè)試(圖3，表3)。

圖1 2mG2-epsps基因的引物探針特異性試驗(yàn)Fig.1 Specific test of2mG2-epsps primer probe

圖2 玉米內(nèi)參Hmg基因的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Real-time PCR amplification of HMG gene in maize

圖3 轉(zhuǎn)基因玉米2mG2-epsps基因的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Real-timePCRamplificationof2mG2-epspsgeneintransgenic maize

2.4 基因組DNA的酶切

轉(zhuǎn)基因玉米樣品中外源基因可能存在串連重復(fù)現(xiàn)象，如不進(jìn)行酶切，可能將串連重復(fù)片段視為單個(gè)拷貝。為避免此問(wèn)題，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米樣品DNA進(jìn)行酶切消化。從圖4可見(jiàn)，玉米樣品DNA已消化完全，原液中的線粒體片段已消失不見(jiàn)。酶切溶液可用于后續(xù)ddPCR測(cè)試。

圖4 轉(zhuǎn)基因玉米樣品T抗-1的DNA的酶切電泳圖譜Fig.4 TheDNAenzymedigestionelectrophoresisofgeneticallymodifiedcornsamplesTkang-1

表3 玉米葉片樣品DNA的2mG2-epsps基因的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增Ct值Table3 Real-timePCRamplificationof2mG2-epspsgeneofDNAinleafsampleofmaize

表4 轉(zhuǎn)基因玉米DNA的Hmg/2mG2-epsps基因拷貝數(shù)的ddPCR檢測(cè)值單位(copies/μl)Table4 ThecopynumberofthegeneticallymodifiedmaizeHmgand2mG2-epspsgenebyddPCRunit(copies/μl)

表5 轉(zhuǎn)基因玉米DNA的Hmg/2mG2-epsps基因拷貝數(shù)比值Table5 TheratioofthecopynumberingeneticallymodifiedmaizeHmgand2mG2-epspsgene

圖5 玉米不同品系1Hmg基因和2mG2-epsps基因的ddPCR熱點(diǎn)圖(2mG2-epsps基因(左圖)和Hmg基因(右圖)的ddPCR熱點(diǎn)圖)Fig.5 The ddPCR heap map of1 Hmg gene and 2mG2-epsps gene in differentmaize lines The ddPCR heapmap of2mG2-epsps gene(left)and Hmg gene(right)

2.5 玉米樣品Hmg基因和2mG2-epsps基因拷貝數(shù)的ddPCR檢測(cè)

由表4轉(zhuǎn)基因玉米DNA的Hmg/2mG2-epsps基因拷貝數(shù)的ddPCR檢測(cè)值和表5基因拷貝數(shù)比值可見(jiàn)樣品重復(fù)度非常好，14個(gè)樣品中有10個(gè)是單拷貝。

采用QX200 ddPCR微滴生成儀和讀數(shù)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)及玉米Hmg基因和2mG2-epsps基因引物探針，對(duì)14個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性玉米樣品中Hmg/ 2mG2-epsps基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。微滴熒光檢測(cè)儀的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)ddPCR熱點(diǎn)圖(圖5)。

所有反應(yīng)的拷貝數(shù)在合理范圍內(nèi)(100～4000 copies/μl)，2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相近，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。從熱點(diǎn)圖中可分析，每個(gè)反應(yīng)的陰性微滴和陽(yáng)性微滴的熒光值區(qū)分明顯。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。

3 討 論

研究外源基因在受體基因組上的拷貝數(shù)的方法有多種，得到公認(rèn)的經(jīng)典方法是傳統(tǒng)的qRT-PCR、Southern blot，這2種方法已經(jīng)較成熟應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)的分析中，但這2種方法也存在一定缺陷。例如，Southern-blot方法分析時(shí)工作量大、周期長(zhǎng)、操作要求高、準(zhǔn)確性較差，特別是對(duì)于多拷貝基因的分析，結(jié)果容易偏小[15];qRT-PCR在分析外源基因拷貝數(shù)時(shí)必須依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)曲線和已知拷貝數(shù)的基因，只是一種相對(duì)定量方法，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量易受到DNA純度、引物和探針的濃度、反應(yīng)抑制因子等諸多因素影響[16]。相對(duì)來(lái)說(shuō)，本研究采用的ddPCR定量分析方法在特異性、靈敏度和重復(fù)性上面都優(yōu)于前兩者，而且受DNA純度影響小，受引物間相互干擾小，與擴(kuò)增效率無(wú)關(guān)，更節(jié)約時(shí)間、精力和實(shí)驗(yàn)藥品，是一個(gè)新興崛起的分析方法。

另外，本研究參考前人的研究，采用轉(zhuǎn)基因玉米T抗-1等葉片基因組DNA為模板，而不是用種子的基因組DNA，消除了因種子胚乳3倍體帶來(lái)的轉(zhuǎn)基因質(zhì)量百分比含量和計(jì)算含量的誤差，從而得以保證分析和比較ddPCR定量方法的準(zhǔn)確性[5]。

在拷貝數(shù)分析應(yīng)用方面，拷貝數(shù)研究需要極高的定量精度，以區(qū)別不同拷貝數(shù)之間的微小差異，而ddPCR具有高精確度的特點(diǎn)，通過(guò)精確計(jì)定量目標(biāo)基因與參照基因(拷貝數(shù)為1的基因)，并計(jì)算它們的比值，從而得到目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，對(duì)不同拷貝數(shù)的分辨精度遠(yuǎn)高于qPCR和測(cè)序[17]。

ddPCR是一個(gè)擁有巨大潛力的新興技術(shù)，由于其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景，近幾年來(lái)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展相當(dāng)迅速，應(yīng)用也越來(lái)越得到重視?？梢灶A(yù)見(jiàn)，在未來(lái)幾年內(nèi)，ddPCR技術(shù)將會(huì)進(jìn)一步發(fā)展與完善，應(yīng)用范圍也會(huì)大大擴(kuò)展，有望從一種小眾技術(shù)發(fā)展成為實(shí)驗(yàn)室中的標(biāo)準(zhǔn)工具。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)引物探針特異性試驗(yàn)、葉片基因組DNA的PCR抑制和濃度檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因2mG2-epsps的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)和基因組DNA的酶切等系列研究，建立穩(wěn)定的ddPCR體系，分析了轉(zhuǎn)基因玉米T抗-1等的2mG2-epsps基因，結(jié)果表明，所有供試的14個(gè)樣品中都檢出2mG2-epsps基因片段，其中10個(gè)樣品(T抗-1、2號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、74號(hào)、81號(hào)、85號(hào)、86號(hào)、106號(hào)、114號(hào))中2mG2-epsps基因和玉米內(nèi)源Hmg基因拷貝數(shù)相同，是單拷貝材料;另外4個(gè)樣品(80號(hào)、102號(hào)、109號(hào)、118號(hào))中玉米內(nèi)源Hmg基因拷貝數(shù)是2mG2-epsps基因的2倍，為非純合體。

本文在國(guó)內(nèi)首次建立了轉(zhuǎn)基因玉米品系T抗-1等微滴式數(shù)字PCR定量方法。而且多次重復(fù)研究顯示本研究所建立的玉米品系T抗-1等數(shù)字ddPCR定量方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果重復(fù)性好，不依賴(lài)任何外部標(biāo)準(zhǔn)、能夠有效節(jié)省試劑和樣品，是一種精確、靈敏的轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)分析新方法。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Estimation of Exogenous Genes Copy Number of Genetically M odified Glyphosate-Resistant M aize by Droplet Digital PCR

YU Gui-rong1，ZHANGWei2，DUWen-ping1，SONG Jun1，CHEN Qian1，XU Li-yuan1*
(1.Institute of Biotechnology and Nuclear Techniques，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China;2. Biotechnology Research Institute，China Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China)

【Objective】The exogenousgene copy number of Tkang-1 etc.14 wasestimated geneticallymodifiedmaize based on the early stage of the geneticallymodifiedmore than 100maize(Zeamays L.)materialswith higher resistance and better comprehensive agronomic characters，in order to pass through the transgenic biosafety evaluation and fit in with the needsof breeding new transgenicmaize varieties.【Method】A new kind of analysismethod was adopted for the exogenous gene copy number——the droplet digital PCR technology(droplet digital PCR，ddPCR).And specific primer of exogenousgene2mG2-epsps was designed to analyze the copy number by absolutely quantitativemethod.【Result】The analysis showed that10 of14 transgenicmaterialswere single copies.At the same time，a stable test system was established for analyzing the exogenous gene copy number of geneticallymodified maize by the studying of designing specific primer of exogenous gene 2mG2-epsps，testing the PCR inhibitor and concentration of leafgenome，real time PCR-testing for the exogenous gene of the transgenicmaize，restricting genome DNA and so on.【Conclusion】This paper provided important parameters for the further transgenic biosafety evaluation of transgenicmaize，laid a strong foundation for breeding new transgenicmaize varieties and established the genetic copy number analysismethod of geneticallymodified maize.

Geneticallymodified maize;Glyphosate resistance;Exogenous gene;Copy number;Droplet digital PCR(ddPCR)

S513

A

1001-4829(2017)8-1707-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.003

2017-02-24

四川省農(nóng)科院高新技術(shù)研究應(yīng)用專(zhuān)項(xiàng)(2016GXTZ-001)，轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX0800301B);四川省農(nóng)科院財(cái)政基因工程項(xiàng)目(2016ZYPZ-003)

余桂容(1971-)，女，四川榮縣人，副研究員，主要從事玉米基因工程育種，*為通訊作者:徐利遠(yuǎn)，研究員，主要從事農(nóng)作物遺傳育種研究，E-mail:yuguirong@163.com。