李果果，劉要鑫，柴利軍，葉俊麗，麥彩勝，歐智濤，陳香玲*

桂野生山金柑的倍性分析和SSR分子鑒定

李果果1，劉要鑫1，柴利軍2，葉俊麗2，麥彩勝3，歐智濤1，陳香玲1*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)部南寧南亞熱帶果樹科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣西南寧 530007;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070;3.東興市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣西東興 538100)

【目的】研究‘桂野生山金柑’的遺傳學(xué)特性，為柑橘種質(zhì)資源的鑒定及創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎帽缎苑治龊蚐SR標(biāo)記相結(jié)合，對(duì)‘桂野生山金柑’進(jìn)行遺傳鑒定分析?！窘Y(jié)果】倍性分析結(jié)果表明‘桂野生山金柑’是二倍體;從24對(duì)SSR引物中篩選出6對(duì)重復(fù)性好、條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)的核基因組引物，在供試材料中獲得等位基因條帶共30條，其中具有多樣性差異條帶25條，多態(tài)性比例為79.17%。聚類分析的結(jié)果表明不同供試材料的遺傳相似系數(shù)在0.600～0.802?！窘Y(jié)論】‘桂野生山金柑’具有遺傳特異性，不同于其他地區(qū)起源的山金柑或金柑，是一種新的柑橘種質(zhì)資源。

桂野生山金柑;倍性分析;SSR分子標(biāo)記;聚類分析

【研究意義】山金柑(Fortunella hindsii Swingle)為蕓香科金柑屬植物，別名山金豆、山金橘、山橘、香港金橘[1]，植株一年多次開花結(jié)果，果實(shí)成熟時(shí)金黃色，掛果期長，觀賞性高[2]。近年來隨著人類活動(dòng)的不斷擴(kuò)大和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重惡化，山金柑分布范圍、面積、數(shù)量、種類都銳減，部分地區(qū)物種已消失殆盡。山金柑資源中存在單胚性植株[1]、四倍體植株[2]和實(shí)生苗早花早果特性植株[3]，是柑橘雜交育種和基因組學(xué)研究的良好材料。因此，收集山金柑資源并從分子水平上進(jìn)行研究，對(duì)柑橘優(yōu)良品種的選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在許多果樹遺傳多樣性研究中得到了廣泛應(yīng)用[4-7]。SSR(simple sequence repeat)是一類由1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位序列組成的串聯(lián)重復(fù)序列，其標(biāo)記需要的DNA量少，對(duì)DNA質(zhì)量要求不高，具有共顯性、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好和檢測簡單等優(yōu)點(diǎn)[8]。國內(nèi)外研究人員利用SSR標(biāo)記對(duì)柑橘屬及金柑屬植物的遺傳多樣性與親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，如:Ferrante等[9]通過SSR分子標(biāo)記精確檢測了8個(gè)柑橘四倍體雜種的等位基因并探討其起源問題;Amar等[10]用61對(duì)SSR引物對(duì)24個(gè)柑橘及其近緣屬植物的多態(tài)性和識(shí)別能力進(jìn)行了評(píng)價(jià);張連峰等[11]選取了22對(duì)柑橘屬SSR引物，其中有14對(duì)能在金柑屬植物中擴(kuò)增出帶紋，表明柑橘屬SSR引物在金柑屬植物上具有一定的通用性;陳鵬等[12]對(duì)我國野生山金柑資源的形態(tài)特征和遺傳多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，使用60對(duì)SSR引物分析了48份不同地區(qū)的樣品，研究表明所有的樣品遺傳距離在0.37以內(nèi)，親緣關(guān)系都很近，為SSR分子標(biāo)記在柑橘品種改良上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。【本研究切入點(diǎn)】廣西被農(nóng)業(yè)部規(guī)劃為我國柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的優(yōu)勢區(qū)域[13]，蘊(yùn)含了豐富的柑橘種質(zhì)資源，但有關(guān)廣西柑橘地方種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究相對(duì)較少。目前為止，在分子水平對(duì)廣西野生山金柑資源的相關(guān)研究還處于空白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以‘桂野生山金柑'為試材，對(duì)其倍性進(jìn)行分析，并以其他地區(qū)的6份山金柑材料為參照，利用已公開發(fā)表的柑橘屬及其近緣屬SSR引物，采用分子標(biāo)記技術(shù)研究供試材料的遺傳多樣性，以期了解廣西野生山金柑種質(zhì)資源并對(duì)其進(jìn)行科學(xué)保護(hù)和創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從2013年開始對(duì)廣西東興市發(fā)現(xiàn)的野生山金柑進(jìn)行種質(zhì)資源調(diào)查和樣品采集，并將其嫁接保存于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所柑橘資源圃內(nèi)。通過3年的實(shí)地調(diào)查和研究，筆者發(fā)現(xiàn)該山金柑具有自己獨(dú)特的植物學(xué)和生物學(xué)特性，并將其命名為‘桂野生山金柑'，于2015年通過了廣西壯族自治區(qū)種子管理局的品種登記認(rèn)證(桂登【果】2015021號(hào))。本研究取2株‘桂野生山金柑'為供試材料。

SSR分子標(biāo)記所用的其它6份種質(zhì)資源材料分別是江西省贛州市多胚山金柑、浙江省臺(tái)州市多胚山金柑、湖南省郴州市多胚山金柑、福建省龍巖市單胚山金柑1、福建省龍巖市單胚山金柑2、重慶市北碚區(qū)瀏陽金柑;均采集于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘資源圃，通過資源搜集與保存獲得。供試材料嫁接成活后，選取健康幼嫩葉片提取DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 倍性分析

參照張俊娥等[14]的檢測方法，采用流式細(xì)胞儀(型號(hào):PA-I，Partec公司，德國)對(duì)‘桂野生山金柑'的倍性進(jìn)行檢測，選取二倍體‘早花檸檬'的葉片作為對(duì)照，操作過程為:選取約0.5 cm2的幼嫩葉片于塑料皿中，加入400μl HR-A核裂解液，用刀片切碎葉片放置30 s，通過20～50μl的微孔濾膜將樣品過濾到小試管里，加入1.6 mL HR-B DAPI染色液，染色30～60 s，然后上樣品檢測。Partec倍性分析儀測定樣品中單個(gè)細(xì)胞核的DNA總量，DNA含量的分布曲線由儀器自動(dòng)生成[15]。

1.3 DNA提取與PCR擴(kuò)增

采用CTAB改良法提取柑橘葉片核基因組DNA[16]，具體方法稍作改動(dòng)。DNA提取后用超微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)檢測質(zhì)量及濃度，并以高濃度保存于-80℃超低溫冰箱。從24對(duì)引物中共篩選出6對(duì)多態(tài)性較好的引物，對(duì)7份山金柑材料(‘桂野生山金柑'重復(fù)2次)和1份金柑材料的DNA樣品進(jìn)行分析，6對(duì)引物組合即F10、Ma3-1047、BES-36、M2-14、F78和Ma2-1825(表1)。引物委托上海生工生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增體系總體積為20μl，反應(yīng)液含有的組分和終濃度為:DNA模板100 ng，1×PCR buffer，dNTP 200μmol ·L-1，MgCl21.5 mmol·L-1，1 Uit Taq酶，正反向引物各0.1μmol·L-1，其余為滅菌超純水;擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，4℃20 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測，染色，拍照，用銀染法得到被擴(kuò)增的DNA譜帶[17]。

表1 SSR分子標(biāo)記所采用的擴(kuò)增引物序列Table 1 Sequences of amplification primers used in the SSRmolecularmakers

1.4 聚類分析

每對(duì)SSR引物視為1個(gè)位點(diǎn)，每條多態(tài)性條帶為1個(gè)等位基因。根據(jù)聚丙烯酰氨凝膠電泳后分子標(biāo)記擴(kuò)增條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶的記為1，沒有條帶記為0，構(gòu)建(0，1)矩陣。構(gòu)建的矩陣應(yīng)用NTSYS-pc 2.10e軟件采用簡單匹配系數(shù)(Simplematching coefficient，SM)計(jì)算遺傳相似系數(shù)，由此得到相似性系數(shù)矩陣，并根據(jù)SM相似性矩陣進(jìn)一步進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建親緣關(guān)系樹圖[18-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 倍性分析

從圖1可以看出，流式細(xì)胞儀倍性分析結(jié)果表明‘桂野生山金柑'相同于對(duì)照‘早花檸檬'，為二倍體樣本。

2.2 SSR擴(kuò)增的多態(tài)性分析

從24條SSR引物中篩選出6條重復(fù)性好、條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物(表2)，利用這6條引物擴(kuò)增到30個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)25個(gè)，平均多態(tài)性比率為79.17%。不同引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)量為2～7條，平均每個(gè)引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶數(shù)量為4.17條，多態(tài)性比率較高，說明本研究中的樣品間存在的遺傳差異較大，且‘桂野生山金柑'在遺傳性上明顯有別于其他試驗(yàn)材料，具有遺傳特異性。6條引物的擴(kuò)增結(jié)果譜帶見圖2。

2.3 聚類分析

8份柑橘種質(zhì)的SSR聚類樹形圖3顯示，不同品種或資源材料遺傳相似系數(shù)在0.600～0.802。以遺傳相似系數(shù)0.600為閾值，供試材料可劃分為2組，其中‘桂野生山金柑'和江西省贛州市多胚山金柑材料為一個(gè)類群，浙江省臺(tái)州市多胚山金柑材料、湖南省郴州市多胚山金柑、福建省龍巖市的2

圖1 ‘桂野生山金柑'的倍性分析Fig.1 Ploidy analysis of GuiWild Shanjingan

份單胚山金柑材料和重慶市中柑所的瀏陽金柑為一個(gè)類群。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.802時(shí)，桂野生山金柑和江西省贛州市多胚山金柑材料即可分為不同的類別，浙江省臺(tái)州市多胚山金柑和湖南省郴州市多胚山金柑相似系數(shù)為0.802，福建省龍巖市的2個(gè)單胚山金柑材料的相似系數(shù)為0.702，瀏陽金柑和其他幾種材料的遺傳距離較遠(yuǎn)。由此可知，‘桂野生山金柑'與其他地區(qū)的山金柑、金柑資源遺傳差異較大，具有自己的獨(dú)特性。

3 討 論

‘桂野生山金柑'除了和江西省贛州市多胚山金柑在遺傳相似系數(shù)為0.802時(shí)可聚在一起，和其他地區(qū)山金柑及金柑材料的遺傳距離為0.600，表明桂野生山金柑和其他材料均有較大的遺傳差異，說明地理因素對(duì)親緣關(guān)系也有很大的影響，這與前人的研究結(jié)果相類似[18-19]。陳鵬等[12]在進(jìn)行中國野生山金柑資源調(diào)查以及分析遺傳多樣性時(shí)共收集到江西、湖南、福建、廣東和浙江的野生山金柑樣品275份，采用SSR標(biāo)記后的聚類分析結(jié)果表明基本上各省的樣品都聚在一起，部分地理位置相距較近的樣品則聚在一起。本研究未能大范圍驗(yàn)證桂野生山金柑的遺傳背景與地理因素的關(guān)系，但主要是為驗(yàn)證‘桂野生山金柑'的遺傳特異性，SSR分析樣本的取樣地點(diǎn)數(shù)量有限，在柑橘眾多的類群中，枳屬、金柑屬、柑橘屬中的多數(shù)種類均原產(chǎn)中國，在中國有著悠久的栽培歷史[20]，現(xiàn)已查明廣西擁有枳屬、金柑屬、柑橘屬3個(gè)屬的235個(gè)品種(系)[23]。柑橘童期長，多數(shù)品種為多胚，遺傳背景復(fù)雜，這些特性給柑橘育種及遺傳轉(zhuǎn)化等研究帶來了一定困難。前人研究表明，山金柑實(shí)生苗童期短，播種后一至兩年便可開花結(jié)果，能夠達(dá)到早開花、早結(jié)果、雜種后代品種早鑒定的目的[3，22]。筆者團(tuán)隊(duì)經(jīng)過3年的實(shí)地調(diào)查和采樣觀察，明確在廣西東興收集的‘桂野生山金柑'材料為單胚性類型，一年內(nèi)可多次開花、結(jié)果。單胚類型的山金柑材料，可以克服珠心胚障礙，如果用組織培養(yǎng)等技術(shù)將其加以培養(yǎng)，獲得純合系，不僅可為柑橘常規(guī)育種提供材料，還可用于功能基因組及遺傳圖譜構(gòu)建等方面的研究。除此之外，利用童期較短的山金柑作為遺傳轉(zhuǎn)化材料，建立并優(yōu)化其高效再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系，將使山金柑有望成為果樹中的模式植物。而‘桂野生山金柑'可較好的符合這些特性，有待進(jìn)一步挖掘其在柑橘育種和基因組學(xué)研究中的潛在價(jià)值。

表2 SSR引物擴(kuò)增結(jié)果Table 2 The amplification results of SSR primers

圖2 不同材料的SSR擴(kuò)增譜帶Fig.2 SSR profiles of different samples

圖3 SSR標(biāo)記不同材料的UPGMA聚類分析Fig.3 UPGMA dendrogram of different samples based on SSRmarkers

野生資源和地方種質(zhì)具有十分豐富的遺傳多樣性，對(duì)于評(píng)價(jià)品種資源間的關(guān)系具有重要意義[23-24]?！鹨吧浇鸶?是廣西為數(shù)不多的野生山金柑資源，是區(qū)域氣候條件下形成的特色柑橘資源，蘊(yùn)含特異基因資源，對(duì)于研究廣西金柑屬植物的演化歷史及關(guān)系等具有重要意義。作者在實(shí)地調(diào)查采樣中了解到，當(dāng)?shù)厝杂幸恍┮吧Y源由于環(huán)境惡化和人為破壞而逐漸消失，因此必須進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)野生資源和地方種質(zhì)的保護(hù)、研究和開發(fā)利用，為柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

4 結(jié) 論

‘桂野生山金柑'為二倍體，通過對(duì)篩選出的6對(duì)條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)的SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明‘桂野生山金柑'具有遺傳特異性，明顯區(qū)別于其他地區(qū)起源的山金柑或金柑，是一種新的種質(zhì)資源。

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(責(zé)任編輯 汪羽寧)

Ploidy Analysis and SSR M olecular Identification of GuiW ild Shanjingan

LIGuo-guo1，LIU Yao-xin1，CHAILi-jun2，YE Jun-li2，MAICai-sheng3，OU Zhi-tao1，CHEN Xiang-ling1*
(1.Horticulture Research Institute，Guangxi Academy of Agriculture Sciences/Nanning Investigation&Experiment Station of South Subtropical Fruit Trees，Ministry of Agriculture，Guangxi Nanning 530007，China;2.College of Horticulture&Forestry Sciences，Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology，Ministry of Education，Hubei Wuhan 430070，China;3.Agricultural Technology Extension Center of Dongxing City，Guangxi Dongxing 538100，China)

【Objective】In order to provide a theoretical basis for the identification and utilization of GuiWild Shanjingan，its genetic characteristics was studied【Methods】Using ploidy analysis and SSR molecular marker to analyze the genetic diversity of GuiWild Shanjingan.【Results】The ploidy analysis result showed thatGuiWild Shanjingan was diploid.6 pairs of SSR primerswith good repeatability，high polymorphism and clear bands were screened from the 24 pairs of SSR primers.A total of 30 allele stripes were successfully observed，among them，25 bands were polymorphism.The polymorphic rate was 79.17%.Genetic similarities caculated by cluster analysis ranged from 0. 600-0.802.【Conclusion】GuiWild Shanjingan was significant different from Shanjingan or Jingan originated from other origions，itwas a new cultivar with genetic specificity.

GuiWild Shanjingan;Ploidy analysis;SSR molecularmarker;Cluster analysis

S666

A

1001-4829(2017)8-1872-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.030

2017-04-21

廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(桂農(nóng)科2016YM 44，桂農(nóng)科2015YT51，桂農(nóng)科2015JZ101);廣西農(nóng)業(yè)廳重點(diǎn)科技項(xiàng)目(201307);國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(柑橘)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)桂中南柑橘綜合試驗(yàn)站(CARS-27)

李果果(1987-)，女，河南寶豐人，碩士，助理研究員，主要研究方向?yàn)楦涕倨贩N選育和栽培技術(shù)推廣，*為通訊作者，E-mail:cxl@gxaas.net。