王 娜，李 鋼，鄒輝琴，溫 靜，陳 松，張皓然，茍興華*

豬β-防御素cDNA在枯草芽抱桿菌中的高效表達(dá)

王 娜1，李 鋼2，鄒輝琴2，溫 靜2，陳 松2，張皓然2，茍興華1*

(1.成都大學(xué)，四川成都 610106;2.四川華德生物工程有限公司，四川成都 610063)

【目的】豬β-防御素(β-defensin)是豬自身分泌的一種能夠殺菌、調(diào)節(jié)免疫功能的小分子抗菌肽，是豬生長(zhǎng)繁殖不可缺少的蛋白質(zhì)?！痉椒ā扛鶕?jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的豬防御素cDNA序列，人工合成該基因序列，同時(shí)引入相關(guān)調(diào)控序列及適當(dāng)酶切位點(diǎn)。酶切該人工合成的DNA后，連接到表達(dá)載體pHT43中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α，獲得的轉(zhuǎn)化子用于篩選重組表達(dá)質(zhì)粒。將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pHT43-SS-BD轉(zhuǎn)化到枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)WB800N中，獲得基因工程菌株。使用蔗糖誘導(dǎo)基因工程菌表達(dá)豬β-防御素，SDS-PAGE鑒定其分子量大小，抑菌試驗(yàn)測(cè)定其抑菌活性。【結(jié)果】SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在蔗糖誘導(dǎo)后得到約5 KDa的目的蛋白條帶;平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖誘導(dǎo)后的上清液對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有抑菌效果，而沒(méi)加蔗糖的對(duì)照組上清液無(wú)抑菌效果?！窘Y(jié)論】該研究實(shí)現(xiàn)豬β-防御素cDNA在枯草芽抱桿菌中的高效表達(dá)，為解決抗菌肽來(lái)源限制及枯草芽抱桿菌的生產(chǎn)應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

豬β-防御素;基因表達(dá);活性檢測(cè);枯草芽抱桿菌

【研究意義】當(dāng)今世界人們的經(jīng)濟(jì)水平提高，對(duì)食物的品質(zhì)要求也提高，豬肉已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ畋夭豢缮俚氖澄?。由此可?jiàn)，豬肉具有巨大的市場(chǎng)。在養(yǎng)豬的過(guò)程中，防止其感染、生病以避免造成經(jīng)濟(jì)損失，控制豬的死亡率是非常重要的。通常人們?cè)陴B(yǎng)殖過(guò)程中會(huì)對(duì)豬注射抗生素，但是由于抗生素的濫用造成的微生物的耐藥性問(wèn)題令科學(xué)家頭痛不已。因此，開發(fā)或?qū)ふ姨娲股氐漠a(chǎn)品已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)藥業(yè)、畜牧業(yè)的熱點(diǎn)。防御素是生物體自身合成的一類多肽，由6個(gè)半胱氨形成3對(duì)二硫鍵。1972年由瑞典科學(xué)家首次從果蠅中分離出來(lái)并證明其具有抗菌效果[1]。動(dòng)物種類分析顯示防御素在動(dòng)物基因復(fù)制發(fā)生物種特異性擴(kuò)張，目前在豬的身上發(fā)現(xiàn)只含有β-防御素是可以解釋的[2]。β-防御素是特異性免疫因子，功能有:細(xì)胞信號(hào)、化學(xué)引誘物、免疫、再生等[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，研究表明，β-防御素幾乎存在所有生物類群體內(nèi)，是生物體長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中與病原微生物斗爭(zhēng)的產(chǎn)物，對(duì)部分真菌、原蟲、病毒甚至是癌細(xì)胞都有明顯的殺傷作用，同時(shí)參與脊椎動(dòng)物的特異性和非特性免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有溶血活性[4]。對(duì)于動(dòng)物來(lái)說(shuō)，自身組織器官產(chǎn)生的防御素非常重要，特別是對(duì)免疫缺陷或低的動(dòng)物，可以提高其存活率[5]。到目前為止，很少發(fā)現(xiàn)防御素有誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株的情況，是一類具有重要潛在應(yīng)用價(jià)值的活性物質(zhì)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù)，將豬的β-防御素克隆到枯草芽孢桿菌中，通過(guò)發(fā)酵得到基因工程防御素，并測(cè)定其分子量及對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌活性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】β-防御素基因能夠在枯草芽孢桿菌中正常表達(dá)且具有抗菌活性同時(shí)不對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生毒性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 SS-BD、pHT43、E.Coli DH5α、B.subtilis WB800N。

1.1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)試劑耗材 限制性內(nèi)切酶Bam H I和Kpn I，ligation試劑盒，PCR片段純化試劑盒均購(gòu)置于Takara;氨芐青霉素和氯霉素購(gòu)自AMRESCO公司;質(zhì)粒DNA小抽試劑盒購(gòu)置于QIAUGEN。其它化學(xué)試刻均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 DNA電泳儀、PCR儀、凝膠成像儀、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、溫控?fù)u床、蛋白電泳系統(tǒng)、脫色搖床、恒溫水浴鍋和紫外分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取已知豬防御素(BD)序列 序列如下所示:1 GACCACTACA TATGTGCCAA GAAAGGGGGG ACCTGCAACT TCTCCCCCTG CCCG CTCTTC 61 AACAGGATTG AAGGGACCTG TTACAGTGGC AAGGCCAAGTGCTGCATCCG CTGA。

1.2.2 目的基因序列的設(shè)計(jì) 在豬防御素基因(Accession No:214442)前面加上Sac B和Samy Q序列，Sac B作為蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以使宿主菌通過(guò)蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白。Samy Q作為一種信號(hào)肽基因可以使宿主菌表達(dá)的目的蛋白分泌到胞外。并在兩端加入Kpn I和Bam HⅠ識(shí)別位點(diǎn)后直接由Invitrogen合成。

1.2.3 重組質(zhì)粒的連接 用Kpn I和Bam HⅠ對(duì)目的基因及pHT43進(jìn)行雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證，將驗(yàn)證完成的陽(yáng)性克隆挑選幾個(gè)送檢測(cè)序，待序列完全吻合以后獲得重組質(zhì)粒pHT-BD提取質(zhì)粒備用。

1.2.4 枯草芽抱桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

根據(jù)MoBiTec提供的《枯草芽孢桿菌表達(dá)載體》的參考方法說(shuō)明，將重組質(zhì)粒pHT43-BD轉(zhuǎn)入感受態(tài)枯草芽孢桿菌WB800N中。涂含5μg/mL的氯霉素平板，置于37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。

1.2.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將轉(zhuǎn)化板上新鮮單克隆分別接種于5 mL體積LB培養(yǎng)基中(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，5μg/mL氯霉素，pH自然)，置于搖床，37℃，180 r/min，過(guò)夜培養(yǎng)。按1%的接種量將上述過(guò)夜的一級(jí)培養(yǎng)液分別接種于50 mL新鮮LB培養(yǎng)基中(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，5μg/mL氯霉素，pH自然)，置于搖床，37℃，225 r/min條件下培養(yǎng)。當(dāng)OD600達(dá)到0.8左右時(shí)加入蔗糖至終濃度10 mM，在37℃誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間24 h。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌懸液留樣備用。以不加蔗糖的作為陰性對(duì)照，處理?xiàng)l件同上，培養(yǎng)完成后收集菌懸液備用。

1.2.6 目的蛋白的的活性檢測(cè) 將菌懸液12 000 r/min，離心10 min收集上清液，通過(guò)真空冷凍干燥將上清液濃縮成粉劑以后，用無(wú)菌蒸餾水將粉劑按照0.2 g/mL的濃度配置成樣液，然后通過(guò)平板擴(kuò)散法活性檢測(cè)，指示菌:大腸桿菌;金黃色葡萄球菌。A和A2陽(yáng)性對(duì)照:針對(duì)不同指示菌的2種抗生素。B2供試樣品:經(jīng)蔗糖誘導(dǎo)的真空冷凍干燥的上清液粉劑。C陰性對(duì)照:未經(jīng)蔗糖誘導(dǎo)的真空冷凍干燥的上清液粉劑。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬β-防御素基因的PCR鑒定

隨機(jī)挑選菌落，以目的基因的上下游為引物進(jìn)行菌落PCR后，跑核酸電泳。結(jié)果為:1、9泳道都為DNA Marker，2～8號(hào)泳道都是挑取進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，2～8號(hào)泳道在含有500 bp左右的目的基因片段，說(shuō)明所挑選的菌落中含有pHT43-SSBD質(zhì)粒(圖1)。

2.2 重組豬β-防御素的SDS-PAGE鑒定

含有豬β-防御素基因的枯草芽孢桿菌，需要通過(guò)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)適宜時(shí)間后，蔗糖誘導(dǎo)，取菌液上清液，對(duì)比不添加蔗糖的陽(yáng)性枯草芽孢桿菌培養(yǎng)后的菌液上清液。進(jìn)行SDS-PAGE電泳結(jié)果為:1號(hào)泳道為蛋白Marker，在4 kDa處2～5號(hào)泳道(蔗糖誘導(dǎo)后的陽(yáng)性枯草芽孢桿菌菌液)有清晰可見(jiàn)的條帶，而6號(hào)(未添加蔗糖的陽(yáng)性枯草芽孢桿菌)沒(méi)有可見(jiàn)條帶，說(shuō)明豬β-防御素已經(jīng)被成功誘導(dǎo)分泌表達(dá)(圖2)。

圖1 豬β-防御素基因的檢測(cè)Fig.1 Detection of porcineβ-defensin genes

圖2 蛋白電泳結(jié)果Fig.2 Result of SDS-PAGE

2.3 平板抑菌實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步檢測(cè)防御素是否在枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)，通過(guò)豬β-防御素對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌活性的性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。其間需要用對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑菌活性的抗生素為正對(duì)照，沒(méi)經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的菌液為負(fù)對(duì)照。從圖3可以看出，2種抗生素分別抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，含豬β-防御素的菌液B2對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都具備抑菌效果，而沒(méi)經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的菌液則對(duì)2種指示菌都沒(méi)有抑菌效果。菌液沒(méi)有抗生素的抑菌效果好是因?yàn)闆](méi)有進(jìn)行純化，濃縮，活性單位不夠高導(dǎo)致的。

3 討 論

圖3 豬β-防御素活性檢測(cè)Fig.3 Detection of porcineβ-defensin activity

通過(guò)密碼偏愛(ài)性設(shè)計(jì)豬β-防御素基因在大腸桿菌中表達(dá)，比沒(méi)有偏愛(ài)性設(shè)計(jì)的活性高了4～5倍，但作者并沒(méi)有詳細(xì)介紹其產(chǎn)量及活性[6]。同樣也有在畢赤酵母中表達(dá)豬β-防御素，但是表達(dá)周期太長(zhǎng)，需要140 h左右，時(shí)間成本過(guò)大[7]。在動(dòng)物方面，轉(zhuǎn)基因豬過(guò)表達(dá)豬β-防御素能抵御胸膜肺炎防線桿菌的感染[8]。本研究用枯草芽孢桿菌WB800N作為宿主，其缺少自身分泌的8種蛋白酶可以減小β-防御素被降解的概率[9-11]?？莶菅挎邨U菌作為宿主菌與大腸桿菌比較有很多優(yōu)點(diǎn):大腸桿菌有熱源性脂多糖、易致病;有噬菌體和質(zhì)粒合適于用作克隆載體;分泌蛋白能力強(qiáng)，大大縮短提取目的蛋白的過(guò)程;具有良好發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)。近十年來(lái)，枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)不斷被發(fā)展和完善，許多外源蛋白獲得高效表達(dá)[12]。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的sac B基因編碼的蛋白為分泌型的蔗糖果聚糖酶，此酶能催化蔗糖水解產(chǎn)生葡萄糖和果聚糖[13]。Sac B基因賦予細(xì)胞的蔗糖敏感特性作為一種陰性篩選克隆的標(biāo)記，在生物研究中特別是在基因克隆等遺傳操作中有著廣泛的應(yīng)用[14-16]。Samy Q作為一種信號(hào)肽基因可以使宿主菌表達(dá)的目的蛋白分泌到胞外，減少提取工藝?？莶菅挎邨U菌作為飼料添加劑以內(nèi)生孢子形式存在于飼料中，能耐高溫、耐酸、耐膽鹽。研究表明，枯草芽孢桿菌進(jìn)入動(dòng)物腸道能迅速萌發(fā)成具有新陳代謝作用的營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高飼料利用率、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力，從而提高動(dòng)物的健康水平[17]。

所有脊椎動(dòng)物防御素(α-防御素、β-防御素、θ-防御素)有不同結(jié)構(gòu)和不同的抗菌活性。人體存在α-防御素，pH會(huì)影響其活性[18];β-防御素一般在上皮組織表達(dá)[19]，在牛舌中第一次發(fā)現(xiàn)他的存在，人、猿、牛、齒類動(dòng)物都有，豬和鳥體內(nèi)只表達(dá)β-防御素[20]。豬體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)β-防御素都是通過(guò)基因序列分析，除了豬β-防御素1[21]。θ-防御素是防御素家族中唯一有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的多豬β-防御素2對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌有很好的抑菌效果，對(duì)從病禽體內(nèi)分離出來(lái)的多重耐藥菌也有抑制作用[22]。

β-防御素通過(guò)6個(gè)半胱氨酸序列鑒定出來(lái)，CX6-C-X4-C-X9-C-X6-C-C，X代表任何氨基酸殘基，活性中心的氨基酸序列也是鑒別方法之一。豬β-防御素由30～45個(gè)氨基酸構(gòu)成，5～12個(gè)帶正電荷氨基酸殘基如賴氨酸和精氨酸。典型的豬β-防御素包含一個(gè)α-螺旋和3個(gè)β-折疊[23]。該結(jié)構(gòu)雖然沒(méi)有證明是否對(duì)其活性有影響，但是可以維持其穩(wěn)定性防止被其他酶水解。許多假設(shè)認(rèn)為影響β-防御素活性的是帶正電荷和其等電點(diǎn)，這樣就可以和細(xì)菌細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的脂多糖和磷脂相互作用增強(qiáng)細(xì)胞膜滲透性造成細(xì)菌死亡，也可以進(jìn)入細(xì)胞和DNA、RNA結(jié)合來(lái)殺死細(xì)胞。雖然豬β-防御素在動(dòng)物體內(nèi)免疫機(jī)理不是很明顯，但是國(guó)內(nèi)已經(jīng)有人著手研究抗豬β-防御素的抗體，因抗體的特異性和靈敏度來(lái)研究豬β-防御素在豬體內(nèi)的表達(dá)及一些機(jī)理[21]。

目前豬β-防御素的最新研究主要有:用精氨酸或賴氨酸代替豬β-防御素的個(gè)別氨基酸，來(lái)研究正電荷對(duì)豬β-防御素的抗菌活性影響[24]。Zn2+和L-異亮氨酸加入表達(dá)β-防御素的IPEC-J2細(xì)胞12 h后，表達(dá)β-防御素的mRNA和β-防御素含量明顯提高，在100μmol/mL Zn2SO4和25μg/mL L-異亮氨酸表達(dá)量達(dá)到最高[25]。比較眉山本地豬和雜交豬不同組織表達(dá)β-防御素的量，大多器官中眉山豬表達(dá)量要，所以其免疫力要高一些[26]。在畢赤酵母中表達(dá)豬β-防御素，但是表達(dá)量不高，活性屏蔽[27]。從最新研究進(jìn)展中可以得出:雖然有大腸桿菌做宿主但是活性并沒(méi)有多理想，而畢赤酵母的生長(zhǎng)周期太長(zhǎng)、活性低，所以豬β-防御素在枯草芽孢桿菌中表達(dá)很有前景。未來(lái)對(duì)β-防御素的研究方向可以在基因組添加適宜的精氨酸或賴氨酸基因序列來(lái)提高其活性;在培養(yǎng)基中添加Zn2+和L-異亮氨酸來(lái)提高其表達(dá)量，為以后對(duì)其在體內(nèi)的作用機(jī)制提供研究。

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(責(zé)任編輯 陳 虹)

High Expression of Porcineβ-defense in Bacillus subtilis

WANG Na1，LIGang2，ZOU Hui-qin2，WEN Jing2，CHEN Song2，ZHANG Hao-ran2，GOU Xing-hua1*
(1.Chengdu University，Sichuan Chengdu 610106，China;2.Sichuan Rota Bioengineering Company，Sichuan Chengdu 610063，China)

【Objective】Porcineβ-defensin(beta-defensin)is secreted by pig，and it is a smallmolecule antibacterial peptidewhich can sterilizemicrobe and regulate immunity，and also it is indispensable in pig's growth and reproduction.【Method】In this study，the orcineβ-defensin cDNA sequence based on NCBI database was synthesized，and the regulatory sequences and restriction sites were also added to the synthesized sequence.The cDNA was digested by restriction enzyme and then inserted into expression vector pHT43 for ligation，and the production of ligation was transformed into Escherichia coli DH5αfor screening of the positive expression plasmid.The pHT43-SS-BD was selected by colony PCR and gene sequencing.The recombinant plasimid was transformed into Bacillus subtilis WB800N.When recombinant strain was induced by sucrose，themolecular size of the production of inducing was identified by SDS-PAGE，and the antibacterial activity from the inducing production was determinated by inhibition test.【Result】SDS-PAGE electrophoresis results showed that the interest protein was5 KDa.Inhibition test indicated that the supernatant from the induced genetic engineering strain had antibacterial effect on both gram positive bacteria and gram negative bacteria.【Conclusion】The study achieved the high expression of porcineβ-defense in Bacillus subtilis and paved the way for overcoming source restrictions of antibacterial peptide and for application of B.subtilis.

Porcineβ-defensin;Gene expression;Antibacterial activity;Bacillus subtilis

S828

A

1001-4829(2017)8-1910-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.037

2017-01-20

成都市科技惠民技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目(2015-HM01-00176-SF)

王 娜(1992-)，女，四川南充人，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锱c生化藥學(xué)，E-mail:865003651@qq.com，Tel: 18215525177，*為通訊作者:茍興華，E-mail:641615043@qq. com。