王 帥，賈琦珍，張 玲，王連群，陳根元

和田羊睪丸支持細胞的體外培養(yǎng)與分離鑒定

王 帥，賈琦珍，張 玲，王連群，陳根元*

(塔里木大學動物科學學院/新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

【目的】研究和田羊睪丸支持細胞的體外培養(yǎng)特性。【方法】取新生和田羊睪丸組織，利用兩步酶消化后，采用差速貼壁法純化細胞進行體外培養(yǎng)，并通過形態(tài)學觀察、HE染色、AKP染色、油紅O染色、吖啶橙染色、羅丹明123染色、免疫組化染色、RTPCR和MTT法檢測細胞活性及純度?！窘Y果】培養(yǎng)基中加入2.00%血清濃度的DMEM/F-12可提高支持細胞純度，在體外培養(yǎng)傳至20代的和田羊睪丸支持細胞形態(tài)和核型均為正常;所培養(yǎng)的細胞內波形蛋白表達及標志基因SCF和GDNF的表達均為陽性?！窘Y論】本試驗成功建立了和田羊睪丸支持細胞體外培養(yǎng)模型。

和田羊;睪丸;支持細胞;體外培養(yǎng);鑒定

【研究意義】和田羊是新疆南疆地區(qū)和田、阿克蘇等地的主要放牧品種，具有耐粗飼、適應性強、抗病力強等特點，目前已被農業(yè)部列入《國家級畜禽遺傳資源保護名錄》[1]。和田羊的羊毛具有較好的彈性和光澤度，是本區(qū)維吾爾優(yōu)質地毯的主要原料[2]。【前人研究進展】目前新疆南疆地區(qū)因牲畜數(shù)量增長、過度放牧、缺水等原因，導致本地草甸、草場嚴重退化，豆科黃芪屬和棘豆屬等瘋草植物大量蔓延。近年來，和田羊因采食瘋草而導致大量中毒，目前已嚴重影響了南疆地區(qū)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。王帥等[4]研究發(fā)現(xiàn)，和田羊采食瘋草中毒的主要表現(xiàn)為繁殖系統(tǒng)損傷，其中和田羊公羊性欲降低、精子數(shù)量減少、無配種能力，嚴重時甚至死亡?！颈狙芯壳腥朦c】睪丸支持細胞是曲精細管的組成部分，分布于各期生精細胞中。支持細胞是生精上皮中的唯一體細胞，可分泌必要的營養(yǎng)成分，并作為生精細胞的支架，起到營養(yǎng)、支持及保護生精細胞的作用，使精原細胞可順利分化為精子[5]。瘋草中毒和田羊臨床表現(xiàn)為精子數(shù)量減少，可能與瘋草毒性物質導致的生精細胞、支持細胞損傷有關?！緮M解決的關鍵問題】本研究以新生24 h雄性和田羊羊羔為研究對象，通過分離其睪丸支持細胞并進行體外培養(yǎng)，優(yōu)化和田羊睪丸支持細胞的培養(yǎng)條件，以期得到純度高、活性強的和田羊睪丸支持細胞，為探討瘋草毒性成分對雄性和田羊繁殖系統(tǒng)損傷的機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗新生24 h雄性和田羊羊羔由塔里木大學動物科學學院實驗基地提供。

DMIL-PH1型倒置相差顯微鏡，DMI4000B型倒置熒光顯微鏡，德國Leica;GELDOC-1T型凝膠成像分析儀，美國UVP;PRO 250型組織勻漿儀，美國Pro Scientific;3110型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo;5480R型高速冷凍離心機、5331型PCR儀、Realplex2型實時熒光定量PCR儀，德國Eppendorf。

胰蛋白酶、膠原酶、羅丹明123、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、β-巰基乙醇、蘇木精染液、絲裂霉素-C、EDTA、吖啶橙染料、油紅O染料均購自Sigma公司，胎牛血清、DMEM/F12和小牛血清均購自GIBCO公司，試驗所用抗體購自Santacruz公司，RNA提取試劑盒、Taq酶、dNTPs和反轉錄試劑盒等均購自TAKARA寶生物工程(大連)公司，AKP試劑盒購自華美生物工程有限公司。

1.2 新生和田羊睪丸支持細胞的分離及培養(yǎng)

參考前人[5-8]研究，75.00%酒精消毒后，于無菌條件下將新生24 h和田羊羊羔斷頭處死，將睪丸組織剝離白膜和血管后，浸于雙抗液+pH 7.20的磷酸緩沖液中浸洗3次，剪碎。把剪碎的組織800 r/min離心2 min后棄上清，依次用10倍體積的0. 15%膠原酶和0.25%胰蛋白酶進行兩步法消化，添加少量pH 7.20的磷酸緩沖液800 r/min離心1 min，收集上清，100μm濾網(wǎng)過濾后的細胞懸液以1000 r/min離心10 min，將細胞使用含10.00%胎牛血清的髙糖DMEM培養(yǎng)基進行懸浮，調整細胞至接種密度，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)基DMEM/F12，并除去死亡細胞，每48 h更換2/3的培養(yǎng)基，之后根據(jù)細胞生長情況進行傳代培養(yǎng)。

1.3 和田羊睪丸支持細胞的傳代培養(yǎng)

從細胞培養(yǎng)瓶中吸取和田羊睪丸支持細胞培養(yǎng)液，用pH 7.20的磷酸緩沖液清洗數(shù)次以去除死亡的睪丸支持細胞。加入適量0.25%胰蛋白酶液于培養(yǎng)瓶中，鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中出現(xiàn)細胞突起縮回、間隙增大、近乎縮成圓形時終止消化，通過吸管吹打脫落和田羊睪丸支持細胞。然后使用含10.00 %胎牛血清的髙糖DMEM培養(yǎng)基重新懸浮細胞，調整細胞密度至1×106個/mL，接種后在37℃、5 %CO2的條件下培養(yǎng)。每24 h觀察，每48 h更換2/3的培養(yǎng)基。

1.4 和田羊睪丸支持細胞的鑒定

根據(jù)睪丸支持細胞的特性，參考Aumuller G[9]、Allard E K[10]和Aponte PM[11]的研究，對培養(yǎng)得到的和田羊睪丸支持細胞進行形態(tài)學染色(HE染色)、特征性染色(AKP染色、羅丹明123染色、油紅O染色和吖啶橙染色)及免疫組化染色。并參照RNA提取試劑盒說明書提取和田羊睪丸支持細胞總RNA，將合格RNA利用gDNA Eraser去除基因組DNA，反應條件:42℃，2min。然后采用兩步法進行反轉錄以檢測支持細胞標志基因SCF和GDNF，反應體系為Prime Script?Buffer 5×4.00μl，Prime Script?RT Enzyme MixⅠ1.00μl，RT Primer Mix 1. 00μl，RNA提取液10.00μl，RNase Free dH2O 4.00 μl;反應條件:37℃15 min，85℃5 s。引物序列見表1，由TAKARA寶生物工程(大連)公司合成。

1.5 和田羊睪丸支持細胞的活性測定

將培養(yǎng)的和田羊睪丸支持細胞懸液濃度調整為1×105個/mL，然后接種于96孔細胞板中，每2 d更換1/2的細胞培養(yǎng)液。參考賈琦珍等[3]的研究，于培養(yǎng)的第1、2、3、4、5、6、7、8天對培養(yǎng)細胞進行MTT檢測，每組設置6個重復。確定培養(yǎng)的和田羊睪丸支持細胞活性最強的時間段以進行下一步實驗。

表1 引物序列信息Table1 The nucleotide sequence of primers

圖1 和田羊睪丸支持細胞的體外培養(yǎng)Fig.1 The culture of testis sertoli cells in Hetian sheep in vitro

1.6 和田羊睪丸支持細胞染色體的制備

將培養(yǎng)的和田羊睪丸支持細胞懸液濃度調整為1×106個/mL濃度后接種于細胞培養(yǎng)基中，然后向細胞培養(yǎng)基中加入0.20 mg/L的秋水仙素溶液，孵育4 h后1000 r/min離心10 min收集細胞。0.075 mol/L KCl溶液處理，固定液(V(甲醇)∶V(冰乙酸) =3∶1)預處理3 min，然后正式固定20 min，重復3次。染色后鏡檢觀察其核型，并進行計數(shù)。

2 結果與分析

2.1 新生和田羊睪丸支持細胞的體外培養(yǎng)特性

鏡檢發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)過程(圖1)中，新分離的和田羊睪丸支持細胞為圓形，以均一的單細胞態(tài)存在;生長試驗表明和田羊睪丸支持細胞貼壁速度快于和田羊睪丸精原細胞，約0.5 h時和田羊睪丸支持細胞即有突起貼壁長出，2 h時80%以上的和田羊睪丸支持細胞已貼壁，4 h后可觀察到部分貼壁細胞具胞體伸展現(xiàn)象。培養(yǎng)24 h后，和田羊睪丸支持細胞數(shù)量增多、體積變大，細胞兩側具多個突起;培養(yǎng)48 h后，和田羊睪丸支持細胞基本以單層鋪在瓶底，試驗表明培養(yǎng)3～4 d和田羊睪丸支持細胞即可鋪滿瓶底。新生和田羊睪丸支持細胞傳代后約2 d即可增殖1代，但傳至6代以后速度明顯減緩，傳代時間間隔延長，部分細胞的細胞質出現(xiàn)空泡，而且細胞邊緣多呈現(xiàn)為拉絲狀。傳至第20代時需14～15 d左右才能鋪滿培養(yǎng)皿底壁，而且傳代后的細胞基本不增殖，部分細胞死亡并懸浮于培養(yǎng)液中。

圖2 和田羊睪丸支持細胞的鑒定Fig.2 The identification of testis sertoli cells in Hetian sheep in vitro

圖3 支持細胞中標志基因的表達檢測Fig.3 Marker gene expression detection of sertoli cells

2.2 新生和田羊睪丸支持細胞的鑒定

HE染色結果表明新生和田羊睪丸支持細胞胞核位于胞質中央或偏位，染色較深，而細胞質染色不明顯(圖2-A);AKP染色鑒定發(fā)現(xiàn)新生和田羊睪丸支持細胞不著色，為AKP陰性(圖2-B);油紅O染色鑒定發(fā)現(xiàn)新生和田羊睪丸支持細胞中油滴被染為紅色，細胞核被染為淡藍色，并可見雙極小體(圖2-C);吖啶橙染色鑒定發(fā)現(xiàn)新生和田羊睪丸支持細胞細胞質被染為桔紅色，而胞核被染為綠色(圖2-D);羅丹明123染色鑒定發(fā)現(xiàn)新生和田羊睪丸支持細胞細胞質在熒光顯微鏡下可見發(fā)綠色熒光的線粒體(圖2-E)。免疫組化結果表明培養(yǎng)的新生和田羊睪丸支持細胞內波形蛋白表達明顯(圖2-F)。RTPCR結果表明培養(yǎng)的新生和田羊睪丸支持細胞中SCF和GDNF基因均顯著表達(圖3)。

2.3 新生和田羊睪丸支持細胞的活性測定結果

由MTT法檢測(圖4)可知，培養(yǎng)前5 d時新生和田羊睪丸支持細胞活性呈上升趨勢，第5天時其檢測值最高，之后開始下降。表明培養(yǎng)第5天時的新生和田羊睪丸支持細胞的活力最強，可用于下一步試驗。

圖4 MTT法檢測不同培養(yǎng)時間睪丸支持細胞的活性Fig.4 The viabilitymeasurement of testis sertoli cells at various culturing time by MTT assay

圖5 和田羊睪丸支持細胞核型分析Fig.5 The karyotype analysis of testis sertoli cells in Hetian sheep

2.4 新生和田羊睪丸支持細胞染色體核型分析

如圖5所示，體外培養(yǎng)至第5天的新生和田羊睪丸支持細胞內均含有正常的二倍體核型，計數(shù)可得新生和田羊睪丸支持細胞中共有42條染色體。

3 討 論

支持細胞是動物睪丸曲精上皮中唯一的體細胞，可通過分泌多種蛋白質，促進局部免疫豁免而參與精子的發(fā)生過程。睪丸支持細胞不僅為精子的發(fā)生提供有利的微環(huán)境，還可清除凋亡的精子細胞，優(yōu)化精子質量，目前已被廣泛應用于繁殖細胞發(fā)育研究。胚胎動物具有細胞分化程度低、體外生存能力強等優(yōu)點，使用新生動物體外培養(yǎng)可獲得高活率的睪丸組織細胞。蛋白酶消化法因其對細胞的損害程度較輕，已成為國內外學者[6，12]采用較多的方法。本試驗采用兩步酶消化法，先用膠原酶去除曲精細管間的間質細胞和管周細胞，然后再用胰蛋白酶釋放出曲精細管中的支持細胞。結果表明，該方法獲得的睪丸支持細胞純度較高。與Bucci等[12]和張學明等[13]的研究相比，本試驗以短時間的胰蛋白酶消化取代透明質酸酶和脫氧核糖核酸酶作用，既避免了長時間的酶作用對細胞的損傷，又得到了較好的分離效果，說明胰蛋白酶的選擇和兩步酶消化法的確定有利于新生和田羊睪丸組織的消化分離。

研究表明，睪丸管周細胞為AKP染色陽性，而睪丸支持細胞為AKP染色陰性;油紅O染色可用來鑒定細胞中是否含有油滴，而雙極小體和油滴是睪丸支持細胞所特有;吖啶橙染色顯示細胞質被染成桔紅色，細胞核被染成綠色，與睪丸支持細胞中胞質富含RNA，胞核富含DNA的特性一致;羅丹明123可對睪丸支持細胞中富含的線粒體膜電位進行染色鑒定;波形蛋白可用于區(qū)分精原干細胞和睪丸支持細胞，GDNF和SCF均為鑒定睪丸支持細胞的特征性基因。本試驗通過對新生和田羊睪丸支持細胞進行體外培養(yǎng)試驗，并利用形態(tài)學方法、相關染色、免疫組化染色及分子生物學技術進行了相應的鑒定。結果表明，本試驗獲得了純度較高的睪丸支持細胞。MTT法具有成本低、靈敏度高等特點，是現(xiàn)代分子生物學和細胞生物學的常用分析方法[3，14]。本研究結果表明，體外培養(yǎng)的新生和田羊睪丸支持細胞在前5 d為活性上升期，第5天活性最強;核型分析表明培養(yǎng)的睪丸支持細胞具有正常的二倍體構型，即本試驗成功培養(yǎng)出活性正常的和田羊睪丸支持細胞，培養(yǎng)第5天的細胞可用于外源毒性物質對細胞結構、功能的影響研究。

血清是動物細胞培養(yǎng)基中重要的組成部分，可為細胞培養(yǎng)提供必要的營養(yǎng)成分，從而促進細胞的生長;又可通過內含的生長調節(jié)因子與激素抑制細胞的過速生長，從而對細胞生長的過程進行調節(jié)。本試驗結果表明，含有2.00%濃度血清的細胞培養(yǎng)基可促進新生和田羊睪丸支持細胞的體外生長速率，該研究結果對和田羊睪丸支持細胞的馴化和篩選均具有一定的研究意義。

4 結 論

本試驗利用膠原酶和胰蛋白酶進行兩步法消化新生和田羊睪丸組織，然后采用差速貼壁法純化細胞進行體外培養(yǎng)。鏡檢及染色結果表明，培養(yǎng)基中加入2%血清濃度的DMEM/F-12可提高支持細胞純度，在體外培養(yǎng)傳至20代的和田羊睪丸支持細胞形態(tài)和核型均為正常，所培養(yǎng)的細胞內波形蛋白表達及標志基因SCF和GDNF的表達均為陽性，MTT法測定第5天時細胞活性最強。通過試驗建立了穩(wěn)定的和田羊睪丸支持細胞體外培養(yǎng)模型。

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(責任編輯 李山云)

Culture and Identification of Testis Sertoli Cells in Hetian Sheep in vitro

WANG Shuai，JIA Qi-zhen，ZHANG Ling，WANG Lian-qun，CHEN Gen-yuan*
(College of Animal Science，Tarim University/Key laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology，XinJiang Production& Construction Corps，Xinjiang Alar 843300，China)

【Objective】The aim of this study was to explore the cultural characteristics of testis sertoli cells in Hetian sheep in vitro.【Method】The experimental testis sertoli cellswere obtained from Hetian sheep lamb in 24 h by two-step enzymatic digestion，then the adhesion method was used to purify testis sertoli cells.To observe the testis sertoli cells growth and purity withmorphologicmethod，HE staining detection，AKP staining detection，ORO staining detection，acridine orange staining detection，rhodamine123 staining detection，immunohistochemical staining detection，RT-PCR，cell counting MTT assay.【Result】The results showed that2.00%fetal bovine serum in DMEM/ F-12 medium could be good to culture testis sertoli cells in vitro，the sertoli cells which obtained from Hetian sheep lamb in 24 h could be passaged to 20th generation，the testis sertolicells contained normal cellmorphous and diploid karyotype，the testis sertoli cells expressed vimentin by immunohistochemical staining，RT-PCR result indicated that the SCF gene and GDNF gene expressed in testis sertoli cells.【Conclusion】These results demonstrated thatwe successed to establish themodle of testis sertoli cells in Hetian sheep.

Hetian sheep;Testis;Sertoli cell;Culture in vitro;Identification

S823.3

A

1001-4829(2017)8-1918-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.039

2016-10-02

國家自然科學基金(31460678);國家星火計劃項目(2015GA891015);兵團塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題(HS201409)

王 帥(1984-)，男，山西長治人，高級實驗師，碩士，主要從事動物中毒病及毒理學方面的研究，E-mail:wangshuaidky@126.com，*為通訊作者。