王春麗，張衡，李金華，陳志寶

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.中國(guó)科學(xué)院地質(zhì)與地球物理研究所）

大慶黑魚(yú)湖秋季趨磁細(xì)菌多樣性分析

王春麗1，張衡1，李金華2，陳志寶1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.中國(guó)科學(xué)院地質(zhì)與地球物理研究所）

為研究大慶市黑魚(yú)湖秋季沉積物中趨磁細(xì)菌的多樣性，了解趨磁細(xì)菌分布。采用光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡（TEM）觀察，擴(kuò)增趨磁細(xì)菌16S rRNA基因的方法進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域趨磁細(xì)菌絕大多數(shù)為球菌。磁小體形狀單一，皆為六面體棱柱，成分為Fe3O4，排列方式多樣，分別為單鏈、散鏈和碎鏈。測(cè)序得到了30個(gè)趨磁細(xì)菌序列，分屬7個(gè)OTU。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,都屬于α-變形菌綱。5個(gè)OTU與已知趨磁細(xì)菌序列的相似性等于95%,代表了趨磁細(xì)菌的5個(gè)新種。說(shuō)明該區(qū)域存在可觀的趨磁細(xì)菌資源。

黑魚(yú)湖；趨磁細(xì)菌；多樣性；16S rRNA基因；磁小體

趨磁細(xì)菌（magnetotactic bacteria）是一類(lèi)沿著地球磁力線(xiàn)方向運(yùn)動(dòng)具有趨磁能力的革蘭氏陰性細(xì)菌[1]。在細(xì)胞內(nèi)可以礦化合成納米級(jí)（35～120 nm）的磁小體，其主要成分是磁鐵礦（Fe3O4）或膠黃鐵礦（Fe3S4）[2]，廣泛分布于淡水、?？诤秃Ｑ蟮拳h(huán)境中[1]。趨磁細(xì)菌有許多形態(tài)類(lèi)型，包括螺旋形、弧形、桿形、球形、卵球形和多細(xì)胞聚集體[3]。趨磁細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)屬于變形菌門(mén)下的α-變形菌綱、?-變形菌綱、TM-變形菌綱、硝化螺旋菌門(mén)、Omnitrophica門(mén)（暫定分類(lèi)單元OP3）和Latescibacteria門(mén)（暫定分類(lèi)單元WS3）[4]。其中大部分趨磁細(xì)菌屬于α-變形菌綱。趨磁細(xì)菌在20世紀(jì)中葉被人們發(fā)現(xiàn)[5]，德國(guó)學(xué)者最早對(duì)巴伐利亞地區(qū)基姆湖（Chiemsee）中的趨磁細(xì)菌群落進(jìn)行了系統(tǒng)的研究[6]。此后,對(duì)趨磁細(xì)菌多樣性的研究主要集中在美國(guó)、德國(guó)和日本等國(guó)[7]。趨磁細(xì)菌多樣性研究工作在我國(guó)開(kāi)展較晚[8]。對(duì)于大慶這種高緯度鹽堿濕地湖泊的趨磁細(xì)菌多樣性研究還未曾報(bào)道，趨磁細(xì)菌及其合成的磁小體在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)、工業(yè)發(fā)展、元素地球生物化學(xué)循環(huán)、納米磁性技術(shù)和生物礦化等方面有重要的應(yīng)用價(jià)值和研究意義[9]。因此，研究大慶地區(qū)趨磁細(xì)菌的多樣性是十分必要的。

我們選取黑魚(yú)湖作為研究地點(diǎn)，從形態(tài)多樣性和系統(tǒng)發(fā)育多樣性?xún)煞矫鎸?duì)趨磁細(xì)菌的生物多樣性進(jìn)行研究，旨在了解黑魚(yú)湖環(huán)境中趨磁細(xì)菌的多樣性分布，進(jìn)一步對(duì)大慶趨磁細(xì)菌的地理分布提供理論基礎(chǔ)，促進(jìn)對(duì)趨磁細(xì)菌資源及微生物礦化的認(rèn)識(shí)，對(duì)未來(lái)趨磁細(xì)菌的種類(lèi)、磁小體鏈數(shù)目差異和環(huán)境理化因子間作用關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

黑魚(yú)湖沉積物待檢樣品，DH5a感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化公司，DreamTaq master mix、Thermolyne液氮罐購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Gel Extraction Kit購(gòu)自美國(guó)OMEGA bio-tek公司，載體試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，PCR通用引物購(gòu)自北京華大基因公司，BX-51熒光顯微鏡（OLYMPUS）購(gòu)自日本，JEOL JEM2010透射電子顯微鏡（JEOL）購(gòu)自日本，5452 Y微型高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，F(xiàn)A1204B電子分析天平（雷磁）購(gòu)自上海圖新電子科技有限公司，SH-4C磁力攪拌器（JOAN LAB）購(gòu)自寧波鄞州群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，BSC-1300 IIB2超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沉積物樣品的采集

2016年9月在大慶市黑魚(yú)湖采集沉積物樣品,利用實(shí)驗(yàn)室自制采樣裝置收集黑魚(yú)湖表層沉積物，裝到樣品瓶中,每個(gè)樣品瓶中約含泥樣200～300 mL，水樣100～200 mL，22℃暗處放置3周。

1.2.2 孔隙水pH測(cè)定

將沉積物樣品1 000×g離心20 min，分離其中的孔隙水，測(cè)定pH。

1.2.3 趨磁細(xì)菌光學(xué)顯微鏡觀察和磁收集

用塑料滴管從樣品中取一滴，滴在蓋玻片上，倒置放在載玻片的O型圈上，在載玻片左側(cè)放一塊小型條形磁鐵，懸滴15 min左右。倒置顯微鏡觀察，選出菌量適宜、狀態(tài)較好的樣品拍照記錄，對(duì)這些樣品進(jìn)行標(biāo)記，以備后續(xù)收集。

裝有趨磁細(xì)菌沉積物樣品的毛細(xì)管在外加磁場(chǎng)作用下放置1.5 h，將菌液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中備用。1.2.4透射電子顯微鏡觀察

取1 μl菌液滴于銅網(wǎng)中心位置，放在25℃培養(yǎng)箱中干燥，將干燥好的銅網(wǎng)用無(wú)菌水清洗3～4次后繼續(xù)干燥，銅網(wǎng)干燥后用JEOL JEM2010透射電子顯微鏡（中國(guó)科學(xué)院地球物理研究所電鏡室）對(duì)樣品中菌體與磁小體進(jìn)行觀察（包括趨磁細(xì)菌菌體形態(tài)和大小，磁小體形態(tài)、排列方式、大小及數(shù)目）。

1.2.5 趨磁細(xì)菌遺傳多樣性分析

1.2.5.1 PCR特異性擴(kuò)增趨磁細(xì)菌的16S rRNA基因

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27f（5'-AGAGTYTGATCCTGGCTCAG-3'）與1392r（5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3'）擴(kuò)增，引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增序列長(zhǎng)度約1 364 bp，體系總體積為50 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min；（95℃，1 min；50℃，1 min 30 s；72℃，1 min 30 s）共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。利用濃度為0.1 g·L-1的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。再將其與載體pMD19-T連接，用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α中，涂布到含有氨芐青霉素的Luria-Bertani平板上，構(gòu)建趨磁細(xì)菌的16S rRNA基因克隆文庫(kù)。

1.2.5.2 基因測(cè)序、序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育及多樣性分析

隨機(jī)選取樣品中的菌落直接進(jìn)行測(cè)序。利用軟件去除序列中的質(zhì)粒基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，將序列按照相似性97%的標(biāo)準(zhǔn)劃分分類(lèi)操作單位OTU，選取每個(gè)OTU中具有代表性的序列利用MEGA軟件進(jìn)行ClastalW比對(duì)，切除不匹配序列，利用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 孔隙水pH值

大慶市黑魚(yú)湖孔隙水pH值為8.05。

2.2 趨磁細(xì)菌的形態(tài)

透射電子顯微鏡（TEM）觀察發(fā)現(xiàn)大慶市黑魚(yú)湖趨磁細(xì)菌絕大多數(shù)為球形，但并不是規(guī)則球形，菌體大小為（1.20±0.22）μm×（0.95±0.15）μm，寬長(zhǎng)比為0.78±0.09 μm。

2.3 磁小體的多樣性與成分

通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）觀察，發(fā)現(xiàn)大慶市黑魚(yú)湖趨磁細(xì)菌的磁小體大小、個(gè)數(shù)存在差別，磁小體鏈排列方式多樣。如圖1所示，黑魚(yú)湖趨磁細(xì)菌的磁小體有單鏈、散鏈以及碎鏈三種分布類(lèi)型。磁小體均是六面體棱柱，成分為Fe3O4。每個(gè)趨磁細(xì)菌所含磁小體個(gè)數(shù)不等,一個(gè)趨磁細(xì)菌中磁小體最多可達(dá)25個(gè)，最少5個(gè)，平均每個(gè)趨磁細(xì)菌含有15個(gè)磁小體，其中單鏈的磁小體大小不一，可觀察到兩種直鏈。單鏈磁小體中最大的為148×122 nm，最小的為53×30 nm。散鏈中磁小體大小為（83±20 nm）×（49±20 nm），碎鏈中磁小體大小為（88±20 nm）×（46±20 nm）。

圖1 透射電子顯微鏡下趨磁細(xì)菌的形態(tài)Fig.1Images showing the morphology of magnetotactic bacteria using transmission electron microscopy

2.4 趨磁細(xì)菌遺傳多樣性分析

2.4.1 趨磁細(xì)菌16S rRNA基因序列測(cè)定

對(duì)65個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序比對(duì)分析,其中屬于趨磁細(xì)菌的序列有30條，分屬7個(gè)OTU（相似性＜97%）,分別為clone H-1、clone H-2、clone H-3、clone H-4、clone H-5、clone H-6、clone H-7。其中有19條序列屬于OTU（clone H-3）占總序列的63%。其中OTU（clone H-2）有3條序列占總序列的10%，其他OTU都是一條序列。

2.4.2 趨磁細(xì)菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析及發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast的比對(duì)結(jié)果，結(jié)合在BioEdit軟件中進(jìn)行比對(duì)得到的相似性，將得到的7個(gè)OTU序列與其相似性最高的序列以及已獲得純培養(yǎng)的趨磁細(xì)菌序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

結(jié)果如表1顯示，其中OTU（clone H-3）與數(shù)據(jù)庫(kù)中clone OTU2和clone LM4相似度高達(dá)98%～99%，OTU（clone H-1）與clone XCQD4-20相似度95%，OTU（clone H-2）與clone7相似度95%，OTU（clone H-4）與clone OTU8相似度99%，OTU（clone H-5）與clone OTU2相似度95%，OTU（clone H-6）與clone TVG1-B7相似度95%，OTU（clone H-7）與clone 7相似度95%。

表1 GeneBank中與本實(shí)驗(yàn)所發(fā)現(xiàn)的OTU最相似的序列Table 1The most similar sequences in GenBank to OTUs this study discovered

在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上（如圖2），7個(gè)OTU皆屬于α-變形菌綱。根據(jù)Stackebrandt等[10]認(rèn)為16S rRNA基因相似性大于97%屬于一個(gè)種，小于93%～95%屬于不同的屬。對(duì)7個(gè)OTU相似性分析表明，其中有2個(gè)OTU（clone H-3、clone H-4）與已知最接近序列的相似性大于97%，可能是與相似序列是一個(gè)種；其中，有5個(gè)OTU（clone H-1、clone H-2、clone H-5、clone H-6、clone H-7）與已知最接近的序列的相似性等于95%，可能是5個(gè)新的種。

圖2 趨磁細(xì)菌16S rRNA基因序列的遺傳發(fā)育樹(shù)（加粗的是本實(shí)驗(yàn)所獲得的序列）Fig.2Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence analysis.（The sequences determined in this study are shown in bold）

3 討論

黑魚(yú)湖位于黑龍江省大慶市薩爾圖區(qū)北30 km，松遼盆地成油區(qū)與北部林甸地?zé)崽锏倪^(guò)渡地帶，蘊(yùn)藏著豐富的中低溫地?zé)豳Y源[11]，是大慶地區(qū)比較著名的國(guó)家AAA景區(qū)，屬于典型的濕地湖泊，存在特殊的湖泊環(huán)境，我們推測(cè)黑魚(yú)湖可能有豐富的趨磁細(xì)菌資源。在多次富集的樣品中，光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察α-變形菌綱趨磁球菌在秋季的黑魚(yú)湖表層沉積物中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),這一結(jié)果與之前研究結(jié)論：“無(wú)論是淡水還是海洋環(huán)境中，趨磁球菌都在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)”一致[12]。分子生物學(xué)16S rRNA基因序列分析結(jié)果顯示黑魚(yú)湖趨磁細(xì)菌具有較高的多樣性。

與林巍等[12]昆明湖、元大都和密云水庫(kù)進(jìn)行的趨磁細(xì)菌多樣性研究結(jié)果比較，昆明湖有5個(gè)OTU，與黑魚(yú)湖序列比對(duì)相似度最高為95%，最低為84%。元大都1個(gè)OTU，相似度最高92%，最低為82%。密云水庫(kù)分為16個(gè)OTU其中有13個(gè)OTU都是趨磁球菌，OTU相似度最高為94%，最低為79%，黑魚(yú)湖與三個(gè)淡水湖泊序列相似度較低。昆明湖和元大都都是有著悠久歷史的淡水湖泊，與黑魚(yú)湖相比OTU稍少，可能是后期人工修繕時(shí)對(duì)湖泊的環(huán)境有所影響，黑魚(yú)湖與這兩個(gè)淡水湖相比有更加原始和古環(huán)境保護(hù)性較好的優(yōu)勢(shì)，這也可能是造成趨磁細(xì)菌多樣性豐富的原因之一，并且黑魚(yú)湖遠(yuǎn)離市區(qū)，人類(lèi)活動(dòng)影響小，元大都遺址位置在街區(qū)邊，人類(lèi)的長(zhǎng)期活動(dòng)也會(huì)影響趨磁細(xì)菌分布，造成趨磁細(xì)菌種類(lèi)單一。黑魚(yú)湖和密云水庫(kù)構(gòu)建發(fā)育樹(shù)分析（圖3），兩個(gè)湖泊雖然都是淡水湖泊，但趨磁細(xì)菌群落構(gòu)成差異較大，這可能受兩個(gè)地區(qū)環(huán)境影響。第一，密云水庫(kù)擔(dān)負(fù)著向北京、天津兩大城市供應(yīng)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活用水的任務(wù)，水庫(kù)的水質(zhì)受?chē)?guó)家保護(hù)[13]，黑魚(yú)湖與密云水庫(kù)都屬于旅游風(fēng)景區(qū)但是黑魚(yú)湖屬于堿性環(huán)境，水質(zhì)也遠(yuǎn)不如密云水庫(kù)。第二，黑魚(yú)湖又名黑魚(yú)泡，因盛產(chǎn)黑魚(yú)而得名，而密云水庫(kù)魚(yú)類(lèi)多為人工養(yǎng)殖，湖泊群落中不同的生物形成不同的食物鏈關(guān)系可能影響趨磁細(xì)菌群落分布。第三，季節(jié)因素同樣影響趨磁細(xì)菌生存，F(xiàn)lies等[6]發(fā)現(xiàn)趨磁細(xì)菌的多樣性隨時(shí)間表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化，密云水庫(kù)沉積物的采集時(shí)間是春季3、4月份，而黑魚(yú)湖沉積物的采集時(shí)間是秋季9月份。趨磁細(xì)菌的生長(zhǎng)、磁小體形態(tài)以及成分與外部生長(zhǎng)環(huán)境有一定的關(guān)系[14-15]，黑魚(yú)湖的高緯度和堿性環(huán)境可能是造成大慶黑魚(yú)湖趨磁細(xì)菌發(fā)現(xiàn)新種的主要原因。

綜上所述，秋季黑魚(yú)湖趨磁細(xì)菌多樣性研究為趨磁細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)提供資源。復(fù)雜的環(huán)境和季節(jié)變化造成趨磁細(xì)菌群落差異，影響趨磁細(xì)菌多樣性的微環(huán)境理化性質(zhì)和生物因素有待于更全面的分析。

圖3 黑魚(yú)湖與密云水庫(kù)趨磁細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（加粗的是本實(shí)驗(yàn)所獲得的序列）Fig.3Phylogenetic tree of magnetotactic bacteria in Lake HeiYu and Lake Miyun based on 16S rRNA gene sequence analysis（The sequences determined in this study is shown in bold）

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Analysis of Autumn Magnetotactic Bacteria Diversity in Heiyu Lake of Daqing City

Wang Chunli1，Zhang Heng1，Li Jinhua2，Chen Zhibao1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319；2.Institute of Geology and Geophysics，Chinese Academy of Sciences）

To investigate the diversity of magnetotactic bacteria in autumn sediment of Heiyu lake in Daqing and realize its distribution，the light microscope and transmission electron microscope（TEM）were utilized to observe magnetotactic bacteria，and it’s sequence was analyzed after 16S rRNA gene amplification.The results showed that most of the MTB were magnetotactic cocci and containing magnetosomes，which were hexahedral prismatic mineral crystals.All the magnetosomes were magnetite，most of which were organized in single，hash，and miscellaneous chain.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences revealed that 30 sequences of MTB belonged to 7 OTUs and were affiliated to Alphaproteobacteria.Five OTUs shared equal to 95%16S rRNA gene sequence similarity with already known sequences，which suggested 5 new species.These results indicated the resourceful MTB of Heiyu lake.

Heiyu lake；Magnetotactic bacteria；diversity；16s rRNA gene；magnetosome

X172

A

1002-2090（2017）04-0082-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.018

2017-03-20

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生科研創(chuàng)新資助項(xiàng)目（YJSCX2016-Y46）。

王春麗（1993-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2015級(jí)碩士研究生。

陳志寶，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chenzhibao@byau.edu.cn；李金華，男，副研究員，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：lijinhua@mail.iggcas.ac.cn。