路志芳 張超

（安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽 455000）

·農(nóng)產(chǎn)品加工·

橘皮提取液抑菌作用研究

路志芳 張超

（安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽 455000）

本試驗(yàn)以柑橘副產(chǎn)品橘皮為原料，烘干后分別用無水乙醇和乙醚提取橘皮中活性成分，濃度分別稀釋為1%、5%、9%、13%，用濾紙片法測定橘皮提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌的抑制作用，同時測定最低抑菌濃度和生長曲線。對比兩種不同橘皮提取液的抑菌效果差異，分析橘皮提取液作為防腐劑的可行性。試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同條件下，橘皮乙醇提取液抑菌效果明顯強(qiáng)于橘皮乙醚提取液，更適于做食品防腐劑。

橘皮；提取液；抑菌作用

橘皮，又稱為陳皮，為蕓香科植物橘及其栽培變種的成熟果皮。橘皮具有良好的抑菌作用，研究發(fā)現(xiàn)，柑橘皮渣對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、青霉、根霉、啤酒酵母等都有抑制作用。本試驗(yàn)在現(xiàn)有防腐劑基礎(chǔ)上，研究了橘皮提取液提取方法及其抑菌作用，以滿足企業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展以及消費(fèi)者對食品安全的需求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為柑橘，食用級，市售；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌，安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；無水乙醇，分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司提供；乙醚，分析純，山東檸檬生化有限公司提供；牛肉膏，生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限公司提供；蛋白胨，生化試劑，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠提供；NaCL、瓊脂粉，生化試劑，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司提供。試驗(yàn)設(shè)備為隔水式恒溫培養(yǎng)箱，型號GHP-9050N，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；數(shù)顯恒溫水浴鍋，型號HH-4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，型號DGG-970B，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)；高壓滅菌鍋，型號GT7C720，廣州市番禹力豐食品機(jī)械廠生產(chǎn)；電子天平，型號JA21002，上海精天儀器有限公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，型號YRE-301，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；冰箱，型號BCD-230，青島海爾股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 橘皮提取液對各指示菌種的敏感性測試

用接種環(huán)挑取少量活化菌種，置于滅菌后的生理鹽水中，充分震蕩混勻，制成菌懸液。取出經(jīng)高壓蒸汽滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿。培養(yǎng)基冷卻凝固前，在無菌操作臺上迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)。培養(yǎng)基凝固后，用移液槍吸取菌懸液200μL注入平板，用平板涂布器均勻涂布。取充分蘸取各濃度橘皮提取液的濾紙片放入平板，每個培養(yǎng)皿中放3～5個，距離適中。37℃培養(yǎng)1d后，取其抑菌圈的平均直徑，即為該提取液對此菌種的抑菌結(jié)果。

1.2.2 橘皮提取液對各指示菌種的最低抑菌濃度（MIC）［1］

觀察并測量橘皮提取液對菌種敏感性測試的結(jié)果，順濃度梯度查看，第一個起抑菌作用的橘皮提取液濃度即是此菌種最低抑菌濃度。確定不同溶劑橘皮提取液的最低抑菌濃度。

1.2.3 橘皮提取液對指示菌種生長的影響

選用橘皮乙醇提取液，用濃度為各指示菌的最低抑菌濃度1倍的濃度去作用3種指示菌種。通過比較各指示菌生長曲線的變化，觀察各橘皮提取液對指示菌生長周期的影響。用大腸桿菌為例來加以說明，取20支經(jīng)高壓蒸汽滅菌的試管，每支試管分別倒入5mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，每管接種1mL大腸桿菌菌懸液。然后分成2組（每組10管），1組用來測定15h內(nèi)大腸桿菌的的正常生長曲線，2組用來測定15h內(nèi)加橘皮提取液后大腸桿菌的生長曲線。每隔1h取樣測定其OD540值，繪制正常生長曲線和橘皮提取液作用后的生長曲線。

1.2.4 試驗(yàn)過程

（1）橘皮提取液提?。哼x取市售新鮮柑橘2kg，用清水洗凈后剝?nèi)ネ馄?，將剝下來的外皮放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥，干燥溫度60℃、時間24h。干燥完畢后放于通風(fēng)處1h，再用粉碎機(jī)充分粉碎，得到橘皮粉。將橘皮粉密封避光保存?zhèn)溆?。稱取20g橘皮粉放入2個500mL容量瓶中，容量瓶中分別加入200mL無水乙醇和乙醚，瓶上分別貼上標(biāo)簽，浸泡過夜。小心將容量瓶中的上部分液體倒出，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑，即得油狀物。貼標(biāo)簽后放入冰箱4℃條件下密封避光保存。（2）培養(yǎng)基的制備：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方為牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCL 5g、瓊脂15～20g、水1000mL，pH值7.4～7.6。（3）培養(yǎng)基滅菌：將濾紙片放在需要滅菌的培養(yǎng)皿中，用報紙包裹培養(yǎng)皿，實(shí)驗(yàn)所需試管也用報紙包好，用繩扎緊。將放置培養(yǎng)基的三角瓶、實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)皿、直徑6mm的濾紙片和若干干凈試管放入滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度121℃、時間15min，滅菌完畢后取出待用。（4）菌懸液的制備：大腸桿菌1管，金黃色葡萄球菌1管，青霉菌1管。在無菌工作臺上用接種環(huán)在酒精燈上燒烤后，打開菌種試管塞，從活化后的斜面菌種上刮少量菌，置于裝有10mL無菌生理鹽水的試管中，充分搖勻，最后貼上標(biāo)簽，備用。（5）橘皮提取液抑菌：在無菌工作臺上，將還未冷卻的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每個約20mL。待培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基冷卻、凝固后，用移液槍準(zhǔn)確量取200μL菌懸液放于固體培養(yǎng)基上，用涂布棒均勻涂布，置于37℃恒溫箱中15min后取出，使得瓊脂表面干燥，備用。用無菌鑷子夾取滅菌的濾紙片，分別充分蘸取已稀釋1%、5%、9%、13%的乙醇提取液和乙醚提取液，放在上述各含菌培養(yǎng)皿上。每種濃度的濾紙在培養(yǎng)皿內(nèi)間隔一定的距離放3片。每個培養(yǎng)皿上都要貼上標(biāo)簽，標(biāo)明溶劑類別和濃度。將培養(yǎng)皿倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，觀察各菌種的生長情況，并測定最低抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 橘皮乙醇提取液的抑菌效果

由表1可知，橘皮乙醇提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果較明顯，對青霉菌的抑菌效果不明顯。提取液濃度達(dá)到5%時，橘皮乙醇提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌開始起抑菌作用，提取液濃度達(dá)到13%時對青霉菌開始起抑菌作用。提取液濃度為9%時，對大腸桿菌表現(xiàn)出抑制作用；提取液濃度為13%時，對金黃色葡萄球菌起抑制作用。

表1 各濃度橘皮乙醇提取液的抑菌效果

2.2 橘皮乙醚提取液的抑菌效果

由表2可知，橘皮乙醚提取液對3種供試菌的抑制作用不明顯，提取液濃度為9%時才對大腸桿菌起抑菌效果，濃度為13%時才對金黃色葡萄球菌起抑菌效果，而對青霉菌未表現(xiàn)出抑制作用。

表2 各濃度橘皮乙醚提取液的抑菌效果

2.3 最低抑菌濃度

由表1可知，本試驗(yàn)橘皮乙醇提取液濃度為5%時，大腸桿菌平板中開始有抑菌圈，5%乙醇橘皮提取液為大腸桿菌最低抑菌濃度；橘皮乙醇提取液濃度為5%時，金黃色葡萄球菌平板中開始有抑菌圈出現(xiàn)，5%乙醇橘皮提取液為金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度；橘皮乙醇提取液濃度為13%時，青霉菌平板中開始有抑菌圈出現(xiàn)，13%乙醇橘皮提取液為青霉菌最低抑菌濃度。由表2可知，本試驗(yàn)橘皮乙醚提取液濃度為9%時，大腸桿菌平板中開始有抑菌圈，9%乙醚橘皮提取液為大腸桿菌最低抑菌濃度；橘皮乙醚提取液濃度為13%時，金黃色葡萄球菌平板中開始有抑菌圈，13%乙醚橘皮提取液為金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度；而試驗(yàn)所測濃度范圍內(nèi)，橘皮乙醚提取液對青霉菌無抑菌效果。

2.4 橘皮乙醇提取液對菌種生長曲線的影響

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌的正常生長曲線為對照，加入各菌種1倍最低抑菌濃度的橘皮乙醇提取液后，除青霉菌外，其它菌種生長曲線皆發(fā)生明顯變化。柑橘皮提取液作用大腸桿菌7h后活菌數(shù)開始明顯下降；12h后折線開始向下，進(jìn)入衰亡期，沒有達(dá)到正常的生長高峰。在柑橘皮提取物作用金黃色葡萄球菌6h或7h后，明顯可以看到有活菌下降現(xiàn)象，11～12h后進(jìn)入衰亡期。這些數(shù)據(jù)表明，柑橘皮提取液主要抑制了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在對數(shù)生長期的菌體分裂。

3 小結(jié)

兩種有機(jī)溶劑提取液相同濃度相同菌種抑菌效果對比下，橘皮乙醇提取液抑菌效果明顯強(qiáng)于乙醚提取液。不同濃度的橘皮提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有一定抑制效果，抑制效果與濃度成正相關(guān)。試驗(yàn)范圍內(nèi)，各濃度橘皮提取液對青霉菌基本沒有效果。大腸桿菌的最低抑菌濃度最低，說明該指示菌對橘皮提取液最敏感。從試驗(yàn)結(jié)果來看，橘皮提取液具有一定抑菌效果。由于我國柑橘資源豐富，廉價易得，從天然防腐劑取代人工防腐劑趨勢來看，柑橘具有較好的利用價值。從植物中提取天然防腐劑是現(xiàn)代食品防腐劑發(fā)展的新方向，是消費(fèi)者對天然防腐劑的需求，具有很高的研究價值和開發(fā)前景。且柑橘中各物質(zhì)的提取工藝相對簡單，具有橙香氣，根據(jù)其對微生物的抑制作用，可制成新型的食品防腐劑。

［1］陳濤.蘆薈與常見食品防腐劑的抑菌效果比較［J］.山西化工，2009，29（5）：20～22.