劉永波，舒相華，白華毅，陶 楊，謝相悅，吳常月，張 雪，李 鑫，凌萬旭，何 錦，宋春蓮

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.昆明偉牧得生物科技有限公司，昆明，650201）

云南10種中草藥水煎劑對豬源大腸桿菌體外抑菌實驗

劉永波1，舒相華1，白華毅1，陶 楊1，謝相悅1，吳常月1，張 雪1，李 鑫1，凌萬旭2，何 錦2，宋春蓮1

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.昆明偉牧得生物科技有限公司，昆明，650201）

為了研究云南省10種中草藥水煎劑對豬源大腸桿菌的體外抑菌作用，用兩次煎煮法將黃芩、黃連、黃柏、當(dāng)歸、板藍(lán)根、燈盞花、馬蹄香、茯苓、白頭翁、巖坨等10種云南主產(chǎn)中藥材制成生藥濃度為1g/ml的水煎液，用牛津杯法測定抑菌圈，試管法測定最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果顯示當(dāng)歸、黃連、黃芩、白頭翁水煎劑體外抑菌效果較好，抑菌圈分別為18、17、16、12cm；MIC分別為250mg/ml、62.5mg/ml、125mg/ml、500mg/ml。該實驗所選10種中藥材除茯苓和馬蹄香外，其余中藥材水煎液對豬源大腸桿菌皆有不同程度的體外抑菌效果。該研究對臨床應(yīng)用中草藥防治豬大腸桿菌病及篩選效果良好的抑菌中草藥物進行抗菌獸藥研發(fā)有一定的指導(dǎo)意義。

中草藥；水煎劑；豬源大腸桿菌；抑菌圈；最小抑菌濃度

大腸桿菌（Escherichia coli），又名大腸埃希氏菌，是腸桿菌科(Ecnterobacteriaceae)埃希氏菌屬(Escherichia)的代表菌，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，是人和動物腸道中的正常棲居菌，在一定條件下可引起腸道外感染。某些血清型菌株的致病性強，引起腹瀉，統(tǒng)稱致病性大腸桿菌[1]。豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的豬的一種傳染病。主要表現(xiàn)為腸炎、腸毒血癥等多種臨床癥狀。豬場飼養(yǎng)環(huán)境不良、消毒不規(guī)范及豬自身的免疫力低下是誘發(fā)該病的重要因素。豬大腸桿菌病主要表現(xiàn)為仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病[2]。大腸桿菌的血清型眾多，疫苗免疫效果不佳，臨床多采用抗菌藥物進行治療，由于近年來抗菌藥物的大量不規(guī)范應(yīng)用，該病的抗藥性問題日漸嚴(yán)重[3]，研發(fā)新型非化學(xué)抗菌藥物迫在眉睫。

中草藥具有副作用小、價格低廉、低耐藥性、低殘留等優(yōu)點，應(yīng)用中草藥研發(fā)新型抗菌獸藥及飼料添加劑成為近年的來熱門研究課題[4]。云南地形地貌復(fù)雜，氣候多樣，中草藥資源豐富，素有“植物王國、藥材之鄉(xiāng)”的美稱[5]。本研究通過對黃芩、黃連、黃柏、當(dāng)歸、板藍(lán)根、燈盞花、馬蹄香、茯苓、白頭翁、巖坨等10種云南省主產(chǎn)中草藥水煎劑對豬源大腸桿菌進行體外抑菌試驗，測定抑菌圈和最小抑菌濃度(MIC)，為獸醫(yī)臨床合理使用中草藥防治豬大腸桿菌病和篩中草藥進一步研發(fā)抗菌獸藥提供理論和實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 供試藥品

供試中草藥為：黃連(澄江)、黃芩(昆明)、黃柏(瀘西)、當(dāng)歸(曲靖)、茯苓(瀘西)、燈盞花(騰沖)、馬蹄香(保山)、板藍(lán)根(瀘西)、巖陀(大理)、白頭翁(昆明)，各藥材均為實地采購，括號內(nèi)備注為采購地點。供試菌為豬大腸桿菌ATCC29522，購于廣東省菌種保藏中心

1.2 實驗試劑、耗材

LB液體培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、平板技術(shù)培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、革蘭氏染色試劑盒、細(xì)菌復(fù)蘇液、一次性無菌平皿(90mm)、牛津杯(6*8*10mm)、一次性移液管(10ml)、一次性吸管(1ml)、離心管(4ml)

1.3 實驗儀器

超凈工作臺 （SW-CJ-1F，蘇凈集團安泰公司）、恒溫水浴鍋 (HH-2，邦西儀器科技有限公司)、恒溫氣浴振蕩器(CHA-S，常州智博瑞儀器制造有限公司)、電子天平(HTP312,上?；ǔ彪娮觾x器有限公司)、恒溫生化培養(yǎng)箱(SPX-150，上海申賢恒溫設(shè)備廠)、立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-30KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)、電熱恒溫干燥箱(DHG-9240A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、電冰箱(BCD-222HE3B，美菱股份有限公司綿陽冰箱制造廠)

2 實驗方法

2.1 中草藥水煎液的制備

分別稱取上述十種中藥各50g于1000ml砂鍋中，加500ml蒸餾水，浸泡2h，先大火加熱至沸騰，后文火煎煮1h，紗布過濾至100ml燒杯中；再加入300ml蒸餾水，煎煮方法同上，合并兩次煎煮液，于電熱恒溫干燥箱干燥至50ml。將中藥水煎液移至 100ml規(guī)格錐形瓶中，121℃滅菌20min，用已滅菌的蒸餾水重新定容至50ml，即得生藥濃度為1g/ml中藥水煎液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?/p>

2.2 供試菌液的制備

2.2.1 向凍干菌種加入復(fù)蘇液，制成細(xì)菌懸浮液，用已滅菌生理鹽水50倍稀釋，用一次性滴管吸取適量均勻涂布于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h

2.1.2 挑取單個菌落在麥康凱培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng) 16h，

2.1.3 挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基試管，置于恒溫氣浴振蕩器37℃培養(yǎng)10h，4℃冰箱保存?zhèn)溆?/p>

2.3 中藥水煎液抑菌圈測定

2.3.1 配制普通營養(yǎng)瓊脂于兩個藍(lán)口瓶，分別編號為1和2。121℃高壓滅菌20min，置于45℃水浴鍋，用一次性10ml規(guī)格移液管于1號藍(lán)口瓶中分兩次共吸取20ml至每個平板，冷卻凝固。(該步驟在無菌室按照無菌操作規(guī)程完成)

2.3.2 用2號藍(lán)口瓶中的普通營養(yǎng)瓊脂稀釋供試菌液濃度至105-106CFU/mL，用5mL一次性移液管分別吸取5mL菌液于已冷卻的普通營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，冷卻凝固

2.3.3 將已滅菌的牛津杯用鑷子均勻地置于已凝固的普通營養(yǎng)瓊脂平板上，每個平板放4個牛津杯。

2.3.4 用一次性吸管吸取各中藥水煎液于牛津杯中，每個平板設(shè)兩孔陰性對照，將已高壓滅菌的LB液體培養(yǎng)基用一次性吸管加至陰性對照孔，兩對照孔和兩中藥水煎液孔分別呈對角設(shè)置。

2.3.5 將平板置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，每個平板抑菌圈大小為兩孔抑菌圈之和的均值。抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑小于10mm為耐藥，10-15 mm為中度敏感，大于15 mm為高度敏感[6]。實驗設(shè)3個重復(fù)。

2.3.6 分別在抑菌圈內(nèi)及圈外挑菌進行革蘭氏染色。

2.4 中藥水煎液MIC測定

2.4.1 依據(jù)各中藥水煎液抑菌圈檢測結(jié)果，選取黃連、當(dāng)歸、黃芩、白頭翁做MIC測定

2.4.2 按無菌操作規(guī)程分別將黃連、當(dāng)歸、黃芩、白頭 翁 配 制 成 500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml、62.5mg/ml、31.25mg/m濃度的水煎劑

2.4.3 將已稀釋好的各中藥不同濃度的水煎劑各取1ml于4ml規(guī)格已滅菌離心管內(nèi)，各中藥水煎劑分別設(shè)一孔陰性對照，加1ml已滅菌LB普通液體培養(yǎng)基

2.4.4 向每個離心管內(nèi)加50ul細(xì)菌濃度為105-106CFU/ml的豬大腸桿菌菌液

2.4.5 將離心管置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。分別觀察各離心管細(xì)菌的生長狀況。以不顯示渾濁，管內(nèi)液體清亮的為無菌落生長，該試管的藥液稀釋度為該中藥水煎液對豬大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)。每種中藥水煎劑實驗設(shè)置3個重復(fù)。

3 實驗結(jié)果

3.1 中藥水煎液抑菌圈實驗結(jié)果

表1 牛津杯法測定各中草藥水煎劑對豬大腸桿菌抑菌圈結(jié)果Table1 The bacteriostatic circle of Chinese herbal medicine Water Decoction against swine Escherichia coli which was determined bythe oxford cup method

由表1可知，當(dāng)歸水煎液對豬大腸桿菌具有明顯的抑制作用，其次為黃連、黃芩、白頭翁水煎液。挑取抑菌圈內(nèi)進行革蘭氏染色，顯微鏡下視野可見無菌或幾個零星散在菌落，表明抑菌圈內(nèi)藥物可以抑制豬大腸桿菌的生長繁殖。茯苓水煎三個重復(fù)實驗組平板上皆未出現(xiàn)明顯的抑菌圈，表明該藥物水煎液對豬大腸桿菌無抑殺作用，即豬大腸桿菌對其耐藥。黃柏、板藍(lán)根、巖坨、馬蹄香、燈盞花水煎液抑菌圈內(nèi)雖然革蘭氏染色為無菌，但抑菌圈直徑皆小于10ml，可判定為對豬大腸桿菌耐藥。據(jù)上結(jié)果，選取當(dāng)歸、黃連、黃芩、白頭翁進行MIC測定。

3.2 中藥水煎液MIC實驗結(jié)果

表2 各中藥水煎劑對豬大腸桿菌M IC測定結(jié)果Table1 Determination result of Escherichia coli MIC in Escherichia coli by Decoction of various Chinese herbal medicines

由表2可知，黃連水煎劑對大腸桿菌抑菌效果最顯著，其MIC為62.5mg/ml，其次為黃芩和白頭翁，分別為125mg/ml和250mg/ml，當(dāng)歸的抑菌效果最不明顯，為500mg/ml，該結(jié)果與抑菌圈測定結(jié)果不一致。

4 討論

4.1 本實驗所用10種中藥材皆為實地購買，這就避免了因在中藥市場所購藥材導(dǎo)致的質(zhì)量瑕疵及產(chǎn)地有誤等因素。所選10種中藥材皆為云南省主產(chǎn)藥材，其中黃芩、黃連、白頭翁在臨床上已被廣泛應(yīng)用于抗菌藥或抗菌飼料添加劑，尤其是黃芩近年來被廣泛用作飼料添加劑用于防治細(xì)菌性疾病，且已有大量報道黃芩臨床抗菌效果切實有效[7]。

4.2 中藥水煎劑為我國最傳統(tǒng)，使用最廣泛，且最早的藥物劑型，因其制備簡單、奏效迅速，尤其適應(yīng)于中醫(yī)辨證治療原則，能夠根據(jù)患畜臨床需要配伍藥方或加減藥量，進而起到增強藥效的作用，為我國中獸醫(yī)寶貴的經(jīng)驗財富。但是傳統(tǒng)的煎煮方法，沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而且中藥煎煮涉及到藥材的浸泡、加水量、火候控制、煎煮時間、煎煮容器等因素的影響，操作雖然簡單，在實際應(yīng)用過程中常出現(xiàn)水煎劑溶解不充分、藥效不穩(wěn)定等缺點[8]。

4.3 用牛津杯法測定中藥水煎劑對豬大腸桿菌的抑菌圈，水煎劑為生藥濃度1g/ml時，當(dāng)歸水煎劑的抑菌圈可達(dá)到17mm，說明該濃度下當(dāng)歸水煎液對豬大腸桿菌體外有很強的抑殺作用，其對大腸桿菌的抑菌效果顯著高于黃芩、黃連、白頭翁及其他中草藥水煎劑。而測定當(dāng)歸水煎液對豬大腸桿菌MIC卻顯示3個實驗重復(fù)結(jié)果皆為500mg/ml，其對大腸桿菌的抑殺效果低于黃芩和黃連水煎液，該結(jié)果與牛津杯法測定抑菌圈的結(jié)果不一致。可能因為各中藥水煎液在平板上的擴散能力強弱不同，當(dāng)歸水煎液在平板上擴散能力較強，且在其擴散范圍內(nèi)能抑制細(xì)菌的生長，所以可形成較大的抑菌圈，且圈內(nèi)革蘭氏染色顯示無菌。雖然黃芩、黃連的水煎液對豬大腸桿菌的抑殺作用可能高于當(dāng)歸水煎液，但其在平板上的擴散能力低于當(dāng)歸水煎液，所以其形成的抑菌圈小于當(dāng)歸水煎液。該實驗結(jié)果提示，不能僅以單一的牛津杯法、打孔法在平板上形成的抑菌圈大小來直接判定某種中藥材水煎液或其他有效成分的體外抑菌效果，還需結(jié)合其他方法加以判定。

4.4 本試驗所選的10種中草藥除馬蹄香、茯苓和板藍(lán)根3中草藥水煎液對大腸桿菌體外抑菌效果不理想外，其他7種中草藥水煎劑對豬大腸桿菌都有不同程度的抑制作用，尤其是黃連、黃芩、當(dāng)歸和白頭翁對豬源大腸桿菌有較強的體外的抑菌作用。該結(jié)果對臨床應(yīng)用中草藥防治豬大腸桿菌病及篩選效果良好的抑菌中草藥物進行抗菌獸藥研發(fā)有一定的指導(dǎo)意義。但本實驗所用水煎液都經(jīng)過高壓滅菌，高溫可能對中藥有效成分有較大影響，且中草藥成分復(fù)雜[9]，抗菌機制尚不清楚，抑菌有效成分復(fù)雜，而且中草藥受體外與體內(nèi)環(huán)境的影響較大，中藥體內(nèi)抑菌作用也可能是通過提高機體免疫力達(dá)到抑菌目的，而不是直接的抑殺作用，因此選擇中草藥進行獸藥研發(fā)時不能單單依據(jù)體外抑菌實驗結(jié)果進行篩選[10]。

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S853.71

B

1003-8655（2017）04-0013-03

云南省重點新產(chǎn)品開發(fā)專項《云南地區(qū)主產(chǎn)中藥材豬用中獸藥飼料添加劑研發(fā)及應(yīng)用》(2016BC014)；

劉永波(1989-)，河南人，男，在讀碩士研究生，研究方向為動物疫病防控及中藥免疫學(xué)，757259269@qq.com.

宋春蓮(1972-)，云南晉寧人，女，講師，博士，研究方向為動物組織胚胎學(xué)及疫病防控技術(shù)，Tel:13888001944，E-mai1:466569879@qq.com.