王鳳華 ，孔海軍，孔令生，黃 玲 ，李趙越

(1.新疆師范大學(xué)體育學(xué)院，烏魯木齊 830054； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250031；3.濟(jì)南艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心，濟(jì)南 250031)

α-生育酚琥珀酸酯對過度運(yùn)動小鼠NK細(xì)胞平衡及ApoE基因表達(dá)影響研究

王鳳華1，孔海軍1，孔令生2，黃 玲3，李趙越1

(1.新疆師范大學(xué)體育學(xué)院，烏魯木齊 830054； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250031；3.濟(jì)南艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心，濟(jì)南 250031)

通過α-生育酚琥珀酸酯作用于過度運(yùn)動小鼠，觀察其對小鼠NK細(xì)胞平衡及ApoE基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明：α-生育酚琥珀酸酯對于克服過度運(yùn)動小鼠免疫抑制現(xiàn)象具有顯著作用，主要表現(xiàn)為CD3+、CD16+、CD56+細(xì)胞因子極顯著下降(P<0.01)；ApoE mRNA及ApoE蛋白表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)。不同劑量α-生育酚琥珀酸酯作用效果有一定差別，高劑量組NK細(xì)胞平衡及ApoE表達(dá)顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。

α-生育酚琥珀酸酯；過度運(yùn)動；NK細(xì)胞；ApoE基因

α-生育酚琥珀酸酯(α-TOS)是α-生育酚的一種酯化衍生物，而α-生育酚則是VE的主要成分。VE是理想的天然抗氧化劑，其抗氧化作用已經(jīng)得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛認(rèn)可[1]。由于VE強(qiáng)烈的抗氧化作用，在其運(yùn)輸與儲存過程中極易被氧化，因而其酯化衍生物α-TOS應(yīng)運(yùn)而生，α-TOS結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，不易被氧化，因此α-TOS是VE理想的替代物。

自然殺傷細(xì)胞(NK cell)是除T細(xì)胞和B細(xì)胞之外的另一重要免疫細(xì)胞，具有識別免疫靶細(xì)胞、殺傷炎性介質(zhì)的作用[2]。前期研究表明，NK細(xì)胞與機(jī)體的抗腫瘤、免疫應(yīng)答具有密切關(guān)聯(lián)。NK細(xì)胞按功能不同可分為CD16+、CD56+等分型，通過機(jī)體內(nèi)不同分型NK細(xì)胞的表達(dá)量可以反應(yīng)NK細(xì)胞反應(yīng)系統(tǒng)的工作狀態(tài)[3]。本文旨在探討不同劑量α-生育酚琥珀酸酯對過度運(yùn)動小鼠NK細(xì)胞平衡及ApoE基因表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及試劑

4周齡雄性昆明小鼠40只(購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SCXX(新)2011-0003)，體重(32.7±2.4)g。

α-生育酚琥珀酸酯(α-TOS，純度98%)：上海榕柏生物技術(shù)有限公司； ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒：南京建成生物公司；DP405 TRNzol總RNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司；ApoE mRNA引物：生工生物工程(上海)股份有限公司；一抗、二抗：上海榕柏生物技術(shù)有限公司；脫脂奶粉：市售；蛋白抽提試劑盒：上海榕柏生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒、麗春紅染色液、硝酸纖維素膜、Quick block封閉液(TBS)、Quick block封閉液(TBST)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、TMB顯色液、顯影定影試劑盒均購自于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器及設(shè)備

5810R高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；PCR基因擴(kuò)增儀：G3000德國Biometra公司；揚(yáng)天M-6000N凝膠成像系統(tǒng)：美國Alpha Innotech公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀：賽默飛世爾科技有限公司；PT-350酶標(biāo)儀；XSC小鼠恒溫泳池；DYY-10C水平電泳儀；DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物基本情況

實驗動物隨機(jī)分為4組，每組10只，4組分別為運(yùn)動對照組、運(yùn)動+低α-TOS組(20 μg/mL)、運(yùn)動+高α-TOS組(40 μg/mL)、空白對照組，以下分別簡稱Mc組、T1組、T2組、Rc組。動物統(tǒng)一使用營養(yǎng)飼料飼喂，鼠籠置于23～25℃常溫條件下，濕度50%～55%、光照12 h/12 h。Mc組、T1組、T2組小鼠進(jìn)行6周力竭游泳運(yùn)動訓(xùn)練，每日進(jìn)行1次，水溫23～25℃，水深35 cm[4]。將小鼠投入恒溫泳池內(nèi)，并在小鼠尾部懸掛10 g重鉛垂，使小鼠于溫水中進(jìn)行自由游泳運(yùn)動，實驗者在泳池旁觀察，待小鼠出現(xiàn)沉底且沉底超過3次后將其撈起，使用吹風(fēng)機(jī)吹干，避免影響實驗動物免疫平衡[5-6]。每次游泳運(yùn)動前，Mc組、T1組、T2組均進(jìn)行人工灌胃，灌胃量均為0.2 mL，灌胃藥物劑量依次為: 0.75%生理鹽水、20 μg/mLα-TOS、40 μg/mLα-TOS。

1.2.2 檢驗方法

第6周最后一次游泳運(yùn)動后，即刻摘眼球取血，血液立即離心，取血清，4℃保存?zhèn)溆?；取小鼠脾臟，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.1 細(xì)胞標(biāo)記法檢驗細(xì)胞因子水平

分別使用CD3+、CD16+、CD56+標(biāo)記NK細(xì)胞，使用ELISA 酶聯(lián)免疫試劑盒及酶標(biāo)儀進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實驗，檢測上述細(xì)胞因子水平。

1.2.2.2 ApoE mRNA表達(dá)檢測

取0.2 mL小鼠新鮮全血加入1 mL TRNzol,充分振蕩混勻，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，加0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min。4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20 min。4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，使用75%乙醇洗滌沉淀，室溫晾干，備用[7]。使用30 μL雙蒸水溶解沉淀，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物見表1。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物

1.2.2.3 Western Blot 檢測ApoE蛋白表達(dá)

使用Western Blot半定量法檢測小鼠血清及脾臟ApoE蛋白表達(dá)量，取小鼠脾臟200 mg勻漿(每次5 s，連續(xù)3～5次)，12 000 r/min離心20 min。血清及脾臟勻漿液分別用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，加入100 μL RIPA裂解液4℃孵育30 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫(TBST緩沖液稀釋)密封2 h，一抗室溫孵育2 h，TBS洗5次，每次10 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗5次，每次10 min。ECL顯影后在暗室中用Kodak膠片曝光[8]。顯影、定影后晾干。將晾干的膠片用M-6000N凝膠影像成像系統(tǒng)拍攝照片。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)分析使用Excel 2010數(shù)據(jù)包進(jìn)行圖表繪制，SPSS22.0數(shù)據(jù)包進(jìn)行顯著性差異處理，通過正態(tài)檢驗及方差齊性檢驗后使用LSD-t檢驗進(jìn)行顯著性差異分析，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠血清NK細(xì)胞檢測結(jié)果(見圖1)

由圖1可知，通過6周力竭游泳運(yùn)動實驗，實驗小鼠CD3+、CD16+、CD56+細(xì)胞因子發(fā)生波動變化，與Mc組比較，T1組、T2組、Rc組細(xì)胞因子含量均極顯著低于Mc組(P<0.01)；T1組、T2組相互比較，T2組NK細(xì)胞CD3+、CD16+細(xì)胞因子劑量顯著低于T1組(P<0.05)，CD56+細(xì)胞因子間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

圖1 各組小鼠血清CD3+、CD16+、CD56+細(xì)胞因子劑量

2.2α-生育酚琥珀酸酯對小鼠ApoE mRNA表達(dá)的影響(見圖2)

圖2 小鼠血液ApoE mRNA電泳圖

由圖2可知，小鼠血液ApoE mRNA電泳條帶清晰，與Mc組比較，T1組、T2組及Rc組灰度值明顯高于Mc組。Mc組、T1組、T2組間兩兩比較可知，隨α-TOS劑量上升，凝膠成像下灰度值呈上升趨勢。提示α-TOS可能通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生ApoE等活性物質(zhì)，來對抗應(yīng)激造成的損害而起到保護(hù)機(jī)體的作用，其中α-TOS誘導(dǎo)產(chǎn)生ApoE的作用有一定的特異性。

2.3α-生育酚琥珀酸酯對ApoE蛋白表達(dá)的影響(見圖3、圖4)

圖3 小鼠血清ApoE蛋白表達(dá)

圖4 小鼠脾臟ApoE蛋白表達(dá)

由圖3、圖4可知，不同劑量α-生育酚琥珀酸酯干預(yù)6周后，Mc組ApoE蛋白發(fā)生了大量裂解，ApoE蛋白釋放到胞質(zhì)中，并使ApoE蛋白低表達(dá)；隨著α-生育酚琥珀酸酯劑量上升，實驗動物血清中ApoE蛋白表達(dá)量逐漸上升，T1組、T2組與Mc組間存在極顯著性差異(P<0.01)。說明此化合物能夠保護(hù)ApoE蛋白的損失及降解。

3 討 論

前期研究表明，機(jī)體處于過度運(yùn)動狀態(tài)時，免疫機(jī)能表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抑制作用，即Th1細(xì)胞亞群表現(xiàn)為免疫應(yīng)答抑制，Th2則表現(xiàn)為免疫應(yīng)答領(lǐng)先，易引發(fā)機(jī)體的急慢性炎癥[9-10]。NK細(xì)胞系統(tǒng)與T淋巴細(xì)胞存在較高的相關(guān)性。NK細(xì)胞對炎性介質(zhì)具有較強(qiáng)的殺傷作用，且作用過程中無需特異性抗體介入，可嚴(yán)重干擾機(jī)體的免疫過程。NK細(xì)胞因子發(fā)揮免疫作用的過程與T淋巴細(xì)胞因子活性存在廣泛聯(lián)系，如IL-2可作用于NK的分化過程，而NK又可分泌INF-γ，同時促進(jìn)Th2亞群中IL-4、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的分化[11]。

ApoE是介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的重要基因，主要在脾臟和腦組織中生成，廣泛參與細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)。機(jī)體過度運(yùn)動狀態(tài)下，體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基等強(qiáng)氧化物，細(xì)胞裂解作用加強(qiáng)，T淋巴細(xì)胞因子大量增殖，可造成部分組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)損傷。ApoE可通過阻斷T淋巴細(xì)胞分化通路，從而轉(zhuǎn)變細(xì)胞的免疫抑制狀態(tài)[12-13]。α-TOS通過增強(qiáng)ApoE mRNA P結(jié)合蛋白的吸附作用，提高血液、脾臟中mRNA及相關(guān)蛋白表達(dá)量。

4 結(jié) 論

通過6周不同劑量α-TOS干預(yù)，極顯著降低過度運(yùn)動小鼠血清NK細(xì)胞CD3+、CD16+、CD56+的含量，其血液ApoE mRNA及血清、脾臟ApoE蛋白表達(dá)量極顯著上升。說明α-TOS可顯著促進(jìn)機(jī)體的免疫平衡，緩解機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)。

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Effectsofalpha-tocopherolsuccinateonbalanceofNKcellsandApoEgeneexpressioninexcessivemovementmice

WANG Fenghua1,KONG Haijun1, KONG Lingsheng2, HUANG Ling3, LI Zhaoyue1

(1.Institute of physical Education, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054,China; 2.Basic Medical College,Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250031, China; 3.Jinan ADICON Clinical Center, Jinan 250031,China)

Byalpha-tocopherol succinic acting on the excessive movement mice, the effects of it on balance of NK cells and ApoE gene expression in mice were investigated. The results showed that thealpha-tocopherol succinic to overcome immunosuppressive phenomenon of excessive movement mice had significant effect, with CD3+, CD16+,CD56+cells factor decreasing extremely significant (P<0.01),and ApoE mRNA and ApoE protein expression increasing extremely significant (P<0.01). Different concentrations ofalpha-tocopherol succinic had certain different effects. The balance of NK cells and the ApoE expression of high concentration group was obviously better than that of low concentration group (P<0.05).

alpha-tocopherol succinic; excessive movement; NK cell; ApoE gene

2016-12-15；

：2017-04-17

國家自然科學(xué)基金(31660736)；新疆維吾爾自治區(qū)文科基地招標(biāo)課題(XJEDU040616C02)；2016年新疆維吾爾自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項目(XJGRI2016106)

王鳳華(1971)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向為運(yùn)動生物化學(xué)(E-mail)1057033469@qq.com。

TQ645；R965.1

：A

：1003-7969(2017)07-0132-04