鄭建永，張石自，王升帆，李 俊，汪 釗

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310014；2.浙江醫(yī)藥股份有限公司 新昌制藥廠，浙江 新昌 312500)

米曲霉脂肪酶催化魚油酯酯交換制備高含量EPA/DHA甘油酯的研究

鄭建永1,2，張石自1，王升帆2，李 俊1，汪 釗1

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310014；2.浙江醫(yī)藥股份有限公司 新昌制藥廠，浙江 新昌 312500)

利用米曲霉脂肪酶催化甘油酯型魚油和乙酯型魚油的酯酯交換反應(yīng)制備高含量EPA/DHA甘油酯，考察了底物摩爾比、反應(yīng)溫度、酶添加量和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酶催化反應(yīng)的影響，得到了最優(yōu)酶催化反應(yīng)條件：甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3，酶添加量14%，反應(yīng)溫度70℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。在最優(yōu)的酶催化反應(yīng)條件下反應(yīng)18 h，產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA含量可達(dá)到39.72%。在優(yōu)化條件下對(duì)米曲霉WZ007菌絲體重復(fù)使用6次，甘油酯型魚油產(chǎn)品中的EPA和DHA含量仍保持在34.51%。

脂肪酶；魚油；EPA；DHA；酯酯交換；米曲霉

脂肪酶廣泛存在于自然界中，包括動(dòng)物、植物和微生物，例如在人和動(dòng)物體內(nèi)，各類脂肪酶的功能主要是控制消化、吸收和脂蛋白代謝等過程[1-3]。微生物脂肪酶主要來源于細(xì)菌和真菌，由于其來源廣泛、生產(chǎn)周期短、易于生產(chǎn)，細(xì)菌胞外脂肪酶被廣泛應(yīng)用于食品、香料、清潔劑、手性醫(yī)藥中間體和其他一些化學(xué)品的生產(chǎn)中[4-5]。傳統(tǒng)的物理化學(xué)法制備高含量EPA和DHA甘油酯的方法包括低溫結(jié)晶法，金屬鹽沉淀法和超臨界流體萃取法[6]。與物理化學(xué)法相比，微生物酶法具有催化效率高、選擇性高，在工業(yè)化生產(chǎn)中能耗低等優(yōu)勢(shì)[7]；微生物酶法反應(yīng)條件溫和，對(duì)n-3 PUFA的結(jié)構(gòu)不會(huì)造成破壞[8]。酶催化反應(yīng)可在無溶劑體系中進(jìn)行，從而避免了龐大的生產(chǎn)設(shè)備，生產(chǎn)安全系數(shù)更高。目前有關(guān)酶法酯酯交換的研究報(bào)道較少，國內(nèi)有學(xué)者在這方面有所研究。郭正霞等[9]利用國產(chǎn)固定化假絲酵母脂肪酶催化甘油酯型魚油和乙酯型魚油酯酯交換，制備高PUFA含量的甘油酯型魚油，優(yōu)化條件下得到的甘油三酯中DHA和EPA的含量分別為13.10%和33.40%。宋詩軍等[10]以酶催化選擇性醇解反應(yīng)得到的混合甘油酯和乙酯魚油為原料，加入底物質(zhì)量2%的Novozym 435為催化劑，在100 Pa真空條件下，60℃磁力攪拌6 h，產(chǎn)物經(jīng)過分子蒸餾處理后，得到以甘油三酯為主的產(chǎn)品，其中DHA和EPA含量分別為28.6%和40.4%。近年來酶法催化富集n-3 PUFA的方法越來越受到關(guān)注[11-12]，但是研究通常采用商品化脂肪酶作為催化劑，存在酶的價(jià)格昂貴和使用成本較高等問題。因此，本課題組利用具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高活性全細(xì)胞脂肪酶催化制備富集n-3 PUFA產(chǎn)品，降低了成本，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

利用實(shí)驗(yàn)室保藏的米曲霉WZ007菌絲體所含脂肪酶催化甘油酯型魚油和乙酯型魚油的酯酯交換反應(yīng)制備高含量EPA和DHA甘油酯，并對(duì)各因素對(duì)酶催化反應(yīng)的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

甘油酯型魚油(EPA含量11.5%，DHA含量14.5%)、乙酯型魚油(EPA含量26.0%，DHA含量21.5%)，由浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠提供。正己烷等化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。米曲霉WZ007菌株(中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC M206105)為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6890氣相色譜儀，Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)，B2-2FA2004電子分析天平，ALPHA 2-4 LD plus真空冷凍干燥機(jī)，HWY-2112恒溫水浴搖床等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 米曲霉菌絲體的制備

米曲霉WZ007發(fā)酵培養(yǎng)基組成：蛋白胨20 g/L，橄欖油10 mL/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH自然。在30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，溫度30℃和轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)36 h后，過濾除去培養(yǎng)液，用蒸餾水洗滌數(shù)次后收集菌絲體，濾干蒸餾水后加入少量磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)浸泡，在-60℃條件下真空冷凍干燥48 h，將米曲霉菌絲體4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶催化酯酯交換反應(yīng)

在50 mL磨口具塞三角瓶中加入一定量的甘油酯型魚油和乙酯型魚油(總質(zhì)量10 g)，一定量的米曲霉菌絲體，用保鮮膜密封，置于一定溫度和轉(zhuǎn)速的恒溫水浴搖床上，開始反應(yīng)，定時(shí)取樣氣相色譜分析產(chǎn)物中乙酯型魚油EPA和DHA的含量。

1.2.3 產(chǎn)物中EPA和DHA含量計(jì)算

產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA的含量(Y)由下式計(jì)算。

式中：X1和X2分別表示反應(yīng)前和反應(yīng)后乙酯型魚油EPA和DHA的總含量；n(EE)和n(TAGs)分別表示原料中乙酯型魚油和甘油酯型魚油的物質(zhì)的量；Y1表示原料甘油酯中EPA和DHA的總含量，在本試驗(yàn)中為26.0%。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物摩爾比對(duì)酶催化酯酯交換反應(yīng)的影響

反應(yīng)底物總質(zhì)量為10 g，甘油酯型魚油與乙酯型魚油的摩爾比范圍為1∶1～1∶4.5，酶添加量為底物總質(zhì)量的10%(即1 g，每個(gè)樣品3個(gè)平行)，于50 mL 磨口具塞三角瓶。在30℃，200 r/min水浴搖床中反應(yīng)18 h，氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)物中乙酯型魚油EPA和DHA含量，并計(jì)算產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 底物摩爾比對(duì)酶催化酯酯交換反應(yīng)的影響

由圖1可知，產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA的含量隨著甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比的增大而緩慢增加，當(dāng)?shù)孜锬柋仍龃蟮?∶3.5以后，甘油酯型EPA和DHA的含量基本不變，說明此時(shí)反應(yīng)達(dá)到平衡。綜合考慮后續(xù)分離的能耗，選擇甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3作為后續(xù)試驗(yàn)的反應(yīng)底物摩爾比。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)酶催化酯酯交換反應(yīng)的影響

反應(yīng)底物甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3，酶添加量10%，于50 mL磨口具塞三角瓶?？刂品磻?yīng)溫度分別為30、40、50、55、60、65、70℃和75℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，反應(yīng)時(shí)間18 h。氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)物中乙酯型魚油EPA和DHA含量，并計(jì)算產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)酶催化酯酯交換反應(yīng)的影響

由圖2可知，產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA的含量隨反應(yīng)溫度的升高而增加，說明隨著反應(yīng)溫度的升高，脂肪酶的活性緩慢提高，并在70℃時(shí)，甘油酯型EPA和DHA含量達(dá)到最大值(36.61%)，當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高到75℃時(shí)，甘油酯型魚油EPA和DHA含量沒有繼續(xù)增加，說明米曲霉WZ007菌絲體在反應(yīng)體系中具有很好的熱穩(wěn)定性。綜合考慮熱量的能耗，選擇70℃為后續(xù)試驗(yàn)的反應(yīng)溫度。

2.3 酶添加量對(duì)酶催化酯酯交換反應(yīng)的影響

反應(yīng)底物甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3，酶添加量分別為10%、12%、14%、16%和18%，于50 mL磨口具塞三角瓶。反應(yīng)溫度70℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，反應(yīng)時(shí)間18 h。氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)物中乙酯型魚油的EPA和DHA含量，計(jì)算產(chǎn)物甘油酯型魚油的EPA和DHA含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶添加量對(duì)酶催化酯酯交換反應(yīng)的影響

由圖3可知，當(dāng)酶添加量從底物質(zhì)量的10%上升到14%時(shí)，產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA的含量隨酶添加量的增加而增大。當(dāng)酶添加量為14%時(shí)，甘油酯型魚油EPA和DHA含量達(dá)到最大，為39.32%。繼續(xù)增加酶添加量，反應(yīng)體系變得黏稠，傳質(zhì)受阻，甘油酯型魚油EPA和DHA的含量反而降低。因此，選擇14%為后續(xù)試驗(yàn)的酶添加量。

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酶催化酯酯交換反應(yīng)的影響

在50 mL具塞三角瓶中加入甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3，酶添加量14%，控制搖床轉(zhuǎn)速分別為100、150、200、250 r/min和300 r/min，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間18 h。氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)物中乙酯型魚油EPA和DHA含量，計(jì)算產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA含量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酶催化酯酯交換反應(yīng)的影響

由圖4可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速從100 r/min上升到150 r/min 時(shí)，甘油酯型魚油EPA和DHA含量有所增加，說明增大搖床轉(zhuǎn)速對(duì)體系的傳質(zhì)傳熱起到了促進(jìn)作用，搖床轉(zhuǎn)速從150 r/min增加到300 r/min的過程中，甘油酯型魚油EPA和DHA含量無明顯變化。可能是體系的傳質(zhì)阻力幾乎消失，從節(jié)省機(jī)械能耗方面考慮選擇150 r/min為后續(xù)試驗(yàn)的搖床轉(zhuǎn)速。酶催化酯酯交換反應(yīng)的所需轉(zhuǎn)速較低，其原因可能是甘油酯型魚油和乙酯型魚油具有良好的溶解性，底物的傳質(zhì)比較容易。

2.5 酶催化酯酯交換的反應(yīng)時(shí)間曲線

在優(yōu)化后的條件下(甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3，酶添加量14%，反應(yīng)溫度70℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min)進(jìn)行酶催化酯酯交換反應(yīng)，定時(shí)取樣氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)物中乙酯型魚油EPA和DHA含量，計(jì)算產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA含量，繪制反應(yīng)時(shí)間曲線，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶催化酯酯交換的反應(yīng)時(shí)間曲線

由圖5可知，在優(yōu)化條件下反應(yīng)0～12 h時(shí)間范圍，甘油酯型魚油EPA和DHA含量迅速增加，12～18 h時(shí)間范圍仍維持一定的反應(yīng)速度。反應(yīng)時(shí)間為18 h產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA含量為39.72%，18～30 h時(shí)間范圍反應(yīng)緩慢進(jìn)行，甘油酯型魚油EPA和DHA含量到達(dá)41.13%，30 h以后反應(yīng)趨于平衡，甘油酯型魚油EPA和DHA含量幾乎不變，整個(gè)反應(yīng)過程中EPA和DHA含量的最大值為41.78%(48 h)，與原料甘油酯型魚油相比，產(chǎn)物甘油酯型魚油中EPA和DHA含量有明顯提高。

2.6 酶的重復(fù)使用情況

在上述優(yōu)化條件下，酶催化反應(yīng)12 h，當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，直接離心回收米曲霉菌絲體，用少量丙酮沖洗，除去菌體上殘留的底物和產(chǎn)物，進(jìn)行10批次重復(fù)反應(yīng)。氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)物中乙酯型魚油EPA和DHA含量，計(jì)算產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA含量，結(jié)果如圖6所示。

圖6 酶的重復(fù)使用情況

由圖6可知，第1批反應(yīng)12 h甘油酯型魚油EPA和DHA含量為38.84%，米曲霉菌絲體重復(fù)使用6次，甘油酯型魚油EPA和DHA含量為34.51%。米曲霉菌絲體重復(fù)使用10次，甘油酯型魚油EPA和DHA含量為33.2%，高于進(jìn)口甘油酯型魚油EPA和DHA含量30%的水平。重復(fù)批次反應(yīng)過程中甘油酯型魚油EPA和DHA含量逐漸降低，其原因可能是長時(shí)間處于較高溫度使酶變性失活，或者是洗滌步驟造成細(xì)胞的脂肪酶蛋白流失?？傮w而言，米曲霉WZ007菌絲體具有較好的操作穩(wěn)定性，可以重復(fù)使用，將大大降低其應(yīng)用成本。

3 結(jié) 論

利用米曲霉WZ007菌絲體脂肪酶催化乙酯型魚油(EPA和DHA含量47.5%)和甘油酯型魚油(EPA和DHA含量26.0%)酯酯交換反應(yīng)，重點(diǎn)考察了底物摩爾比、反應(yīng)溫度、酶添加量和搖床轉(zhuǎn)速等因素對(duì)反應(yīng)的影響。試驗(yàn)得到了優(yōu)化的工藝條件：甘油酯型魚油與乙酯型魚油摩爾比1∶3，酶添加量為底物總質(zhì)量的14%，反應(yīng)溫度70℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。在優(yōu)化的條件下，酶催化反應(yīng)18 h，產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA含量可達(dá)到39.72%，反應(yīng)48 h，產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA含量為41.78%。在優(yōu)化條件下，米曲霉WZ007菌絲體重復(fù)使用6次，產(chǎn)物甘油酯型魚油EPA和DHA含量仍保持在34.51%。試驗(yàn)結(jié)果表明，米曲霉WZ007催化制備高含量EPA和DHA甘油酯型魚油產(chǎn)品具有較強(qiáng)的工業(yè)化應(yīng)用潛力。

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PreparationofhighcontentEPA/DHAglyceridesfromtransesterificationoffishoilcatalyzedbyAspergillusoryzaelipase

ZHENG Jianyong1,2，ZHANG Shizi1，WANG Shengfan2， LI Jun1，WANG Zhao1

(1.Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2.Xinchang Pharmaceutical Factory, Zhejiang Medicine Co., Ltd., Xinchang 312500, Zhejiang, China)

The preparation of high content EPA/DHA glycerides form transesterification of ethyl ester-type fish oil and glyceride-type fish oil catalyzed byAspergillusoryzaelipase was studied. The effects of molar ratio of substrate, reaction temperature, enzyme dosage and rotation speed on the reaction were investigated. The optimal enzymatic transesterification conditions were obtained as follows: molar ratio of glyceride-type fish oil to ethyl ester-type fish oil 1∶3, enzyme dosage 14%, reaction temperature 70℃ and rotation speed 150 r/min. Under the optimal conditions, the content of EPA and DHA in the glyceride-type fish oil product could reach 39.72% after reaction for 18 h. WhenAspergillusoryzaeWZ007 mycelium was reused for six batches, the content of EPA and DHA in the glyceride-type fish oil product kept above 34.51% in every batch.

lipase； fish oil; EPA; DHA; transesterification;Aspergillusoryzae

2016-10-12；

：2017-02-24

國家自然科學(xué)青年基金(31600639)；中國博士后科學(xué)基金(164936)

鄭建永(1982)，男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槊腹こ碳坝椭庸?E-mail) zhengjy@126.com。

汪 釗，教授(E-mail)hzwangzhao@163.com。

TS221；TQ644.3

：A

：1003-7969(2017)07-0111-04