□ 何沃權(quán) 莫永川 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司

柱前衍生法測(cè)定茶葉中L-茶氨酸的含量

□ 何沃權(quán) 莫永川 廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司

本文研究了柱前衍生測(cè)定茶葉中L-茶氨酸含量的方法。茶葉中的L-茶氨酸用熱水提取后，經(jīng)2，4-二硝基氟苯衍生后上高效液相色譜法測(cè)定。色譜條件為：色譜柱（Kromasil C18柱 4．6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙 ︰磷酸鹽溶液（pH=6．5）=15︰85梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；流速：1．0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣：5 μL。本方法檢出限4 mg/kg，在1．0～50．0 μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r=0．999 9），衍生后的樣品室溫25 ℃放置6天內(nèi)穩(wěn)定，重現(xiàn)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0．16%（n=6），回收率為96．4%～102．2%。本高效液相色譜法可以準(zhǔn)確地測(cè)定茶葉中L-茶氨酸的含量。

L-茶氨酸；柱前衍生；2，4-二硝基氟苯；高效液相色譜法

茶氨酸是茶葉中特有的非蛋白氨基酸，占茶樹體內(nèi)游離氨基酸的50%左右，約占茶葉干重的1%～2%[1]。由于茶原料、加工、制作方法的不同，茶氨酸在各類茶葉中含量有較大差異[2]。茶氨酸作為茶葉特有的化學(xué)成分之一，在提神、鎮(zhèn)靜、降血壓、抗癌和減肥等方面都起到了有效的作用[3-6]。茶葉中的茶氨酸主要有L-茶氨酸和D-茶氨酸兩種形式，而D-茶氨酸在茶葉中的茶氨酸占比很小[7]，可以忽略不計(jì)，而且國(guó)標(biāo)中茶氨酸一般指L-茶氨酸[8]，所以本方法重點(diǎn)考查茶葉中的L-茶氨酸。目前，測(cè)定茶氨酸的方法包括紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法等。高效液相色譜法能快速、準(zhǔn)確的測(cè)定茶氨酸，是作為茶氨酸測(cè)定的常用分析方法，由于大多數(shù)氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射，為了提高分析的靈敏度和分離選擇性，通常將氨基酸衍生。目前，主要有鄰苯二甲醛（OPA）衍生法，劉小力[9]就有詳細(xì)研究；還有以異氰酸苯酯（PITC）柱前衍生，以紫外檢測(cè)分析。1996年，郭升平老師對(duì)茶葉中的茶氨酸進(jìn)行詳細(xì)的研究[10]。由于OPA衍生法的衍生反應(yīng)快，衍生物要求在一定時(shí)間內(nèi)上機(jī)測(cè)定才能得到準(zhǔn)確結(jié)果，對(duì)操作者的能力要求比較高；而異氰酸苯酯（PITC）衍生法，衍生化后形成的副產(chǎn)物較多，需要系統(tǒng)處理以避免干擾[11]。因此，本文以2,4-二硝基氟苯作為柱前衍生試劑，以C18色譜柱進(jìn)行分離，以紫外作為檢測(cè)器，對(duì)L-茶氨酸進(jìn)行分析研究。結(jié)果證明本方法的檢測(cè)靈敏度高、分離效果好、準(zhǔn)確度高，適合茶葉中茶氨基酸的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，配DAD檢測(cè)器；恒溫振蕩水槽（精宏）；CP225D 電子天平（Sartorius）；移液器（Finnpipette）：100～1 000 μL。

1.2 試劑

2,4-二硝基氟苯（山東西亞化工）；碳酸氫鈉（廣州化學(xué)試劑）；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、磷酸（廣東化學(xué)試劑）；乙腈（默克 色譜級(jí)）。

1.3 試劑的配制

1%的2,4-二硝基氟苯溶液：取1 g 2,4-二硝基氟苯，加入100 mL乙腈溶解。0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液：取4.2 g碳酸氫鈉，加入100 mL水溶解。10%氫氧化鈉溶液：取10 g氫氧化鈉，加入100 mL水溶解。pH=7.0磷酸鹽溶液：取3.4 g磷酸二氫鉀，用水900 mL溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH=7.0后，加水定容至1 000 mL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品

L-茶氨酸：純度99%安譜。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

L-茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2.000 mg/ mL）：準(zhǔn)確稱取L-茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.02 g（精確到0.01 mg），用水溶解并定容至10 mL。

L-茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 μg/ mL）：準(zhǔn)確移取L-茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液500 μL置10 mL容量瓶中，加水至刻度，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制。準(zhǔn)確吸取L-茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液250 μL、100 μL，L-茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間液1 000、500、200、100 μL和0 μL于不同的10 mL容量瓶中，分別加入1 mL 0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液、1 mL1%的2,4-二硝基氟苯溶液，密封好，混勻，至60 ℃熱水中衍生1 h，取出，放冷，用pH=7.0磷酸鹽溶液定容，過濾，即得標(biāo)曲濃度0、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL和50.0 μg/mL。

1.6 色譜條件

色譜柱：KromasilC18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）：25 mmol磷酸鹽溶液（用氫氧化鈉溶液調(diào)pH=6.5）=15︰85；梯度洗脫：0～10 min； A：15%→20% B：85%→80%；10~20 min A：20%→30% B：80%→70%; %；20~30 min A：30%→60% B：70%→40%；30~30.5 min A：60%→15% B：40%→85%。流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.7 樣品制備

1.7.1 樣品提取

準(zhǔn)確稱取研細(xì)均勻的樣品0.5 g，準(zhǔn)確加入100 mL水，在80 ℃恒溫振蕩水槽中振蕩提取45 min，冷卻，過濾，濾液待用。

1.7.2 樣品衍生

準(zhǔn)確吸取樣品濾液1 mL于10 mL容量瓶中，分別加入1 mL 0.5 mol/ L碳酸氫鈉溶液、1 mL1%的2,4-二硝基氟苯溶液，密封好，混勻，至60℃熱水中衍生1 h，取出，放冷，用pH=7.0磷酸鹽溶液定容，過濾，上機(jī)。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-茶氨酸的定性和定量

本文考察了有機(jī)綠茶、毛尖、普洱茶、紅茶幾種不同成品茶葉的含量，見表1。由表1可以看出不同的茶葉含茶氨酸是不一樣的，其中綠茶含量最高，紅茶次之，普洱茶含L-茶氨酸最少。

圖1、圖2是標(biāo)準(zhǔn)品圖和樣品圖，可以看出分離效果符合要求。

2.2 L-茶氨酸衍生條件實(shí)驗(yàn)

由于綠茶含茶氨酸較高，所以選擇有機(jī)綠茶作為本方法學(xué)驗(yàn)證的茶葉。取同一個(gè)樣品提取液，考察衍生時(shí)間比較（見表2)和溫度比較（見表3），由表2和表3可以看出，樣品在衍生時(shí)間60 min和衍生溫度60 ℃時(shí)，基本衍生完成。

2.3 流動(dòng)相pH條件實(shí)驗(yàn)

本方法考察了流動(dòng)相磷酸鹽的pH值在4.5、6.5、7.0情況下對(duì)L-茶氨酸出峰的影響?？梢园l(fā)現(xiàn)，pH=4.5時(shí)，L-茶氨酸出峰較晚，而且與衍生劑的峰分離不是很完全，會(huì)受其干擾；pH=6.5、pH=7.0時(shí)，L-茶氨酸出峰越快，而且與衍生劑的峰、雜質(zhì)峰分離的比較好，同時(shí)為了保護(hù)色譜柱，選擇pH=6.5作為本方法流動(dòng)相。

2.4 樣品衍生化后的穩(wěn)定性考察實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)衍生化后的樣品，在室溫25℃下，考察其穩(wěn)定性（見表4），可以看出衍生化后的樣品至少可以保存6天，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.36%。

2.5 L-茶氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限實(shí)驗(yàn)

將已經(jīng)衍生后的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)樣，用外標(biāo)法定量分析，峰面積（y）與濃度（x）呈良好的線性相關(guān)性：

y=216.485 23x+15.971 36

r=0.999 96

以樣品檢出的最低濃度的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為檢出限，得檢出限為4 mg/kg。

2.6 樣品的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

取同一樣品6份，按方法進(jìn)行衍生上機(jī)后，得到L-茶氨酸的平均含量為1.31%，RSD=0.16%（見表5）。取樣后加入一定量的標(biāo)液，按方法處理、上機(jī)，得到回收率：96.4%～102.2%（見表6）。

2.7 L-茶氨酸的耐用性實(shí)驗(yàn)

考察了樣品在流動(dòng)相流速和柱溫發(fā)生改變時(shí)對(duì)L-茶氨酸測(cè)定的影響。適當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相的流速為0.8、1.2 mL/ min和柱溫變?yōu)?5、45℃時(shí)，雜質(zhì)與目標(biāo)峰都能很好的分離，對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響不大。

表1 各種成品茶葉的含量表

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品圖

圖2 有機(jī)綠茶樣品圖

表2 衍生時(shí)間比較表

表3 衍生溫度比較表

表4 穩(wěn)定性考察表

表5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表

表6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)表

柱前衍生法對(duì)茶葉中L-茶氨酸的檢測(cè)重現(xiàn)性好、靈敏度高、分離效果好、準(zhǔn)確度高，適用于不同茶葉中茶氨基酸的測(cè)定。

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