劉雁霞李少杰樊振川

（1. 天津科技大學(xué)大健康生物技術(shù)研究所 天津市大健康生物技術(shù)國際聯(lián)合研究中心 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院微生物研究所 真菌學(xué)國家重點實驗室，北京 100101）

粗糙脈孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體制備

劉雁霞1李少杰2樊振川1

（1. 天津科技大學(xué)大健康生物技術(shù)研究所 天津市大健康生物技術(shù)國際聯(lián)合研究中心 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 中國科學(xué)院微生物研究所 真菌學(xué)國家重點實驗室，北京 100101）

構(gòu)建pET-28a（+）-ERG-11重組質(zhì)粒，表達(dá)6×His-ERG-11融合蛋白，制備ERG-11多克隆抗體。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段，插入pET-28a（+）原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入E. coli BL21（DE3）感受態(tài)表達(dá)融合蛋白，融合蛋白經(jīng)親和純化及分子篩純化后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，取血清后，采用間接ELISA法和Western blot法檢測多克隆抗體的效價及特異性。成功構(gòu)建了pET-28a（+）-ERG-11表達(dá)載體，SDS-PAGE電泳顯示成功誘導(dǎo)出以包涵體形式存在的6 × His-ERG-11融合蛋白，兩步純化后得到純度較高的抗原，間接ELISA法顯示制備的多克隆抗體效價達(dá)到1∶512 000，Western blot顯示具有較高特異性。成功實現(xiàn)了粗超脈孢菌ERG-11蛋白的原核表達(dá)，制備出一支兔抗粗超脈孢菌ERG-11的多克隆抗體。

粗超脈孢菌ERG-11基因；克??；蛋白表達(dá)及純化；多克隆抗體

近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，真菌感染的幾率逐年增加，尤其存在于免疫力低下及免疫缺陷的人群中，如骨髓/器官移植者，人類免疫缺陷病毒（HIV）患者等［1］。目前隨著一系列抗真菌藥物的問世及人們的長期廣泛使用，使得真菌的抗藥性不斷增強(qiáng)［2-5］，由真菌感染所導(dǎo)致的各種疾病以及高死亡率成為臨床上亟待解決的重大問題。目前，根據(jù)各種抗菌藥物作用方式以及作用靶標(biāo)的不同，可將抗菌藥物分為多烯類藥物、堿基類似物、唑類藥物及棘球白素等四大類，其中唑類藥物的應(yīng)用最為廣范，研究報道的也比較多［6］。真菌細(xì)胞膜上的特有脂質(zhì)麥角固醇對于維持細(xì)胞的完整性及流動性有重要作用，14α-去甲基化酶（Erg11p）是麥角固醇合成過程中的限速酶，其編碼基因為ERG11，唑類藥物通過與14α-去甲基化酶結(jié)合，進(jìn)而影響酶活，阻止細(xì)胞膜的正常形成，因此ERG-11基因的改變，如基因過度表達(dá)、基因突變等都會影響真菌的耐藥性［7-10］，基于此制備ERG-11多克隆抗體用于后續(xù)試驗研究，進(jìn)一步探究該基因與唑類藥物的作用機(jī)理。

粗糙脈孢菌是一種屬于真菌界（Fungi）子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）糞殼菌目（Sordariales）糞殼菌科（Sordariaceae）脈孢菌屬（Neurospora）［11］的真核生物，該菌易于在實驗室培養(yǎng)，生長旺盛且不易被污染，同時不具致病性，也具備兩性生活周期，能夠快速獲得性狀分離、雜交后代等，已經(jīng)完成全基因組測序工作，擁有清楚的遺傳背景［12］，以上這些特點使得該菌作為一種模式生物被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)及基因調(diào)控等方面的研究［13-15］。為此，本研究以粗糙脈孢菌全基因組為模板，選擇擴(kuò)增長約800 bp的外顯子區(qū)域，將該基因片段克隆至原核表達(dá)載體pET-28a（+），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)兩步純化，免疫新西蘭大白兔制備兔抗粗糙脈孢菌多克隆抗體，旨在為進(jìn)一步探討ERG-11基因在粗糙脈孢菌中的生物學(xué)功能以及其抗藥性和抗藥機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 原核表達(dá)載體pET-28a（+），感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL21（DE3）及感受態(tài)細(xì)胞E. coli XL1-blue由本實驗室保存，免疫用新西蘭大白兔由天津歐陽實驗種兔場提供，粗超脈孢菌基因組由中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗室李少杰課題組提供。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自北京索來寶科技有限公司，限制性內(nèi)切酶（BamH I/Hind III）、蛋白Marker、T4DNA連接酶購自美國賽默飛公司，100 bp/1 kb DNA Marker購自北京全式金公司，Ni SepharoseTM6 Fast Flow蛋白純化填料、Hiload 16/60 Superdex 200 pg 預(yù)裝柱、Protein A SepharoseTMCL-4B抗體純化填料購自美國GE Healthcare公司；蛋白免疫印跡NC膜購自美國PALL公司；弗式完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔/鼠抗體購自美國Jackson公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購自德國Millipore公司。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中粗超脈孢菌ERG-11基因序列（登錄號：NCU02624）設(shè)計ERG-11的DNA擴(kuò)增引物，選擇一段長834 bp的外顯子制備多克隆抗體，融合蛋白大小為36 kD，在上下游引物中插入BamH I和Hind III酶切位點，上游引物：5'-AAGGATCCGGATCCATGGACACCATC-3'，下游引物：5'- TTAAGCTTAAGCTTTTACAACTGGC-3'，引物由北京奧科鼎盛生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）-ERG-11的構(gòu)建 以粗糙脈孢菌基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將大小正確的PCR產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET-28a（+）經(jīng)BamH I/Hind III雙酶切2 h后，利用T4連接酶4℃過夜連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E. coli XL1-blue中，次日挑選陽性克隆至液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切驗證，將驗證大小正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28a（+）-ERG-11，進(jìn)行測序驗證。1.2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒pET-28a（+）-ERG-11轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL21（DE3），37℃培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600值約0.5-0.6），加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，25℃條件下誘導(dǎo)6 h［16］，離心收集菌體，超聲破碎后獲得全蛋白。取上清和沉淀分別與5 × 蛋白上樣緩沖液混勻，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳檢測，鑒定融合蛋白的存在形式。

將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體離心收集，超聲破碎，收集沉淀，向沉淀中加入含8 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，8 mol/L尿素，pH7.4），使沉淀變性溶解，與Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料4℃過夜結(jié)合［17］；流出結(jié)合液，用含8 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液洗滌雜蛋白，再用含8 mol/L尿素及咪唑的洗脫緩沖液梯度（50 mmol/L、100 mmol/L、500 mmol/L）洗脫目的蛋白。將純化產(chǎn)物進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠分析。

將經(jīng)親和純化后的融合蛋白富集，再次進(jìn)行分子篩純化。用含8 mol/L尿素的PBS以1 mL/min 的速率平衡Hiload Superdex 200 pg 兩個柱體積；上樣3 mL（6 mg/mL），流速1 mL/min；以1 mL/min 的速率洗脫，收集蛋白。

1.2.3 動物免疫實驗 免疫前，經(jīng)耳動脈采血100 μL作為陰性對照血清。首次免疫，將融合蛋白與弗氏完全佐劑按照1∶1的比例充分混合，乳化至少2 h后，采用背部多點皮下注射法免疫新西蘭大白兔（1 mg/次/只）。10 d后，用弗氏不完全佐劑與融合蛋白按照1∶1的比例充分混合，乳化至少2 h，加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫4次，加強(qiáng)免疫劑量及途徑與初免一致。末次免疫1周后，再次經(jīng)耳動脈采血100 μL，分離血清，間接ELISA法測定抗血清效價。將效價合格的家兔經(jīng)股動脈采血，分離血清，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 多克隆抗體的純化 取1 mg抗血清加入12 mL Protein A結(jié)合液（20 mmol/L Na2HPO4，pH7.2），與Protein A SepharoseTMCL-4B純化介質(zhì)室溫結(jié)合30 min，5倍柱體積Protein A結(jié)合液洗滌后用洗脫緩沖液（0.1 mol/L甘氨酸，pH2.7）進(jìn)行洗脫，并用1 mol/L Tris-HCl（pH9.0）將洗脫液pH調(diào)節(jié)至中性。1.2.5 多克隆抗體效價及特異性檢測 采用間接ELISA法及Western blot法測定抗體效價和特異性。

間接ELISA法測定抗體效價［18］，采用免疫前后兔血清作為一抗，分別將免疫前血清和免疫后血清按照1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000，1∶128 000，1∶256 000，1∶512 000的比例稀釋，二抗采用HRP標(biāo)記羊抗兔抗體，酶標(biāo)儀測定OD450值，若試驗組血清OD450/陰性對照血清OD450≥2.0則判為陽性，其最高稀釋度即為待測抗血清的效價。

Western blot法測定抗體特異性。分別在E. coli BL21及粗超脈孢菌中Western blot檢測抗體特異性，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜，以5 %牛奶/TBST室溫封閉，將抗血清按1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000稀釋后，室溫孵育；用5%牛奶/TBST按1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育；用ECL顯色液進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET-28a（+）-ERG-11的構(gòu)建

以粗超脈孢菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠顯示在Marker 800 bp處有一條明亮條帶（圖1）；利用BamH I/Hind III將目的片段與載體雙酶切后連接，挑取4個陽性克隆酶切驗證（圖2），3號克隆驗證大小正確，將3號重組質(zhì)粒測序，測序結(jié)果正確，表達(dá)載體構(gòu)建成功，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28a（+）-ERG-11。

2.2 融合蛋白6 ×His-ERG-11誘導(dǎo)表達(dá)及純化

重組質(zhì)粒pET-28a（+）-ERG-11轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3）后，在25℃條件下，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的融合蛋白6 × His-ERG-11經(jīng)SDS-PAGE電泳（圖3），泳道3中，在35 kD以上有一條明顯條帶，大小與6 × His-ERG11融合蛋白預(yù)期大小相符，誘導(dǎo)表達(dá)成功，且融合蛋白主要以包涵體的形式存在。

圖1 ERG-11 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a（+）-ERG-11雙酶切驗證

圖3 融合蛋白的SDS-PAGE分析

鎳柱親和純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳（圖4），8 mol/L尿素存在的條件下，50 mmol/L /100 mmol/L咪唑可將35 kD以下的雜蛋白洗脫，在70 kD及130 kD以上仍存在少量雜蛋白；將親和純化后的洗脫液超濾濃縮后，進(jìn)行分子篩純化，分子篩上樣總蛋白約8 mg，取相應(yīng)峰頂處樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳（圖5），將樣品富集濃縮后得到免疫用抗原（圖6），可得純度較高的目的蛋白約3 mg，回收率為37.5%。

2.3 抗體的效價及特異性檢測

采用間接ELISA法測定5次免疫后的抗血清，在1∶512 000的稀釋度下，免疫后血清OD450（0.5）/免疫前血清OD450（0.15）≥2.0，抗血清滴度達(dá)到1∶512 000（圖7）。分別取誘導(dǎo)表達(dá)前細(xì)菌全蛋白，誘導(dǎo)后細(xì)菌蛋白和純化后細(xì)菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，經(jīng)Western blot分析顯示，抗血清在1∶10 000的稀釋條件下，誘導(dǎo)表達(dá)前細(xì)菌全蛋白無信號，誘導(dǎo)后細(xì)菌蛋白和純化后細(xì)菌蛋白在35 kD、70 kD及以上處均有信號，與抗原純化結(jié)果保持一致，且純化后的蛋白在35 kD處相對于未純化的蛋白信號較強(qiáng)，多克隆抗能夠與ERG-11蛋白發(fā)生特異性結(jié)合（圖8）。

圖4 親和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

圖5 分子篩純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

圖6 純化后的融合蛋白6×His-ERG-11

2.4 粗糙脈孢菌ERG-11蛋白檢測

圖7 間接ELISA法測定抗血清效價

圖8 免疫印跡法驗證ERG-11抗血清特異性

野生型粗糙脈孢菌中ERG-11全蛋白大小約為60 kD，粗糙脈孢菌ERG-11基因過表達(dá)菌株中ERG-11全蛋白大小為69.5 kD，多克隆抗體ERG-11在1∶2 000的稀釋比例下，野生型及基因過表達(dá)菌株中均能檢測到目標(biāo)蛋白，在ERG-11基因敲低的菌株中未檢測到目標(biāo)蛋白（圖9-A）；在1∶10 000的稀釋比下，基因敲低菌株及野生型菌株中相應(yīng)蛋白大小處幾乎無信號，僅在ERG-11基因過表達(dá)菌株中能夠檢測到信號（圖9-B）。以上數(shù)據(jù)表明多克隆抗體ERG-11具有較高的特異性和靈敏度。

3 討論

目前在臨床上，唑類藥物常作為真菌感染的普遍用藥，對唑類藥物的耐藥研究最為突出［19-21］，研究表明，ERG11基因編碼的麥角甾醇14α-去甲基化酶失活將會造成真菌細(xì)胞膜破壞，達(dá)到抑制真菌的作用。為了研究ERG11基因的生物學(xué)功能，以粗糙脈孢菌作為研究生物，通過PCR獲得該基因864 bp-1 698 bp間的834 bp外顯子區(qū)域，克隆至原核表達(dá)載體pET-28a（+），該表達(dá)載體含有6個組氨酸編碼序列，可使表達(dá)外源蛋白帶有6個組氨酸的純化標(biāo)簽，通過組氨酸與金屬離子（Ni2+）的螯合作用，有利于表達(dá)蛋白的純化，同時標(biāo)簽較小，不會影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。通過優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)的濃度及溫度，最終得到以包涵體形式存在的目的蛋白，造成目的蛋白以包涵體形式存在，一方面可能與pET系統(tǒng)的高效表達(dá)有關(guān)，過快的蛋白合成速度以至于無法進(jìn)行蛋白折疊，二硫鍵無法正確配對［22］；另一方面可能與蛋白本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，ERG-11蛋白屬于膜蛋白的一種，其本身具有疏水性。研究也曾嘗試采用pGEX和pMAL系列載體進(jìn)行純化免疫，利用GST與MBP標(biāo)簽的促溶性使其形成可溶性蛋白，但考慮到標(biāo)簽大于所表達(dá)的目的蛋白，可能會導(dǎo)致抗體效價不高以及后期抗體難于純化，而本次研究最終目的為將抗體用于Western blot檢測，因此最終選擇pET載體進(jìn)行表達(dá)純化抗原。由于細(xì)菌中大部分蛋白都是水溶性蛋白，以包涵體形式存在的蛋白較少，更加簡化了本次目的蛋白的純化。通過鎳柱親和純化和分子篩純化后得到干凈的免疫抗原后，直接用含高濃度尿素變性的蛋白免疫，在一免后相對于其他上清蛋白免疫效果來看，新西蘭大白兔免疫后反應(yīng)較大，這可能由于尿素含量高造成，但最終所得到的抗體在效價以及純度上沒有受到負(fù)面影響［23-24］。但該抗體仍存在一定的局限性，由于免疫抗原為變性蛋白，其空間構(gòu)象發(fā)生改變導(dǎo)致抗原決定簇以線性表位形式刺激兔子產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，這種情況下的抗血清不會影響Western blot的檢測，但由于免疫組化所用抗體識別的是空間構(gòu)象保持下的抗原表位，因此不能用于免疫熒光以及免疫共沉淀等免疫組學(xué)實驗。在以后的實驗中對于包涵體蛋白可采用蛋白沉淀法將尿素去除，以減輕對兔子的危害；另外可通過稀釋、透析、超濾等方法使蛋白復(fù)性，使其能進(jìn)一步用于免疫組學(xué)實驗。

圖9 粗糙脈孢菌中ERG-11蛋白檢測

4 結(jié)論

本研究成功克隆了粗糙脈孢菌ERG-11基因，并誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白6 × His-ERG-11，蛋白經(jīng)純化后免疫新西蘭大白兔，得到抗血清，在利用表達(dá)宿主細(xì)菌BL21以及真菌粗糙脈孢菌進(jìn)行Western blot檢測時，相比于一般多抗的稀釋比，顯示具有較高的特異性，能夠達(dá)到1∶10 000的稀釋比，該抗體的成功獲得可用于粗糙脈孢菌中不同轉(zhuǎn)基因菌株ERG-11蛋白的檢測分析。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Prokaryotic Expression，Purification and Polyclonal Antibody Preparation of Neurospora crassa ERG-11 Protein Antigen

LIU Yan-xia1LI Shao-jie2FAN Zhen-chuan1
（1. Institute of Health Biotechnology，International Collaborative Research Center for Health Biotechnology，College of Food Science and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. State Key Laboratory of Mycology，Institute of Microbiology，Chinese Academy of Science，Beijing 100101）

This work aims to construct the recombinant plasmid pET-28a（+）-ERG-11 and express the 6 × His-ERG-11 fusion protein for preparing ERG-11 polyclonal antibody. The target fragment amplified by PCR was inserted into pET-28a（+）prokaryotic expression vector，and then transformed into the competent cells of Escherichia coli BL21（DE3）for expressing the fusion protein. Further，the fusion protein was purified by affinity purification and gel filtration chromatography，and then immunized to New Zealand white rabbit for preparing polyclonal antibody. Taking serum，the titer and specificity of the polyclonal antibody were detected through indirect ELISA and Western blot，respectively. As results，the pET-28a（+）-ERG-11 expression vector was successfully constructed. SDS-PAGE showed that the 6 × His-ERG-11 fusion protein was induced successfully in the inclusion form. After two-step purification，the antigen with high purity was obtained. ELISA showed that the polyclonal antibody titer reached 1∶512 000，and Western blot confirmed its high specificity. Conclusively，the prokaryotic expression of ERG-11 gene was successfully conducted，and a polyclonal antibody against Neurospora crassa ERG-11 was prepared，providing a foundation for further study on the genetic structure and function of ERG-11 in N. crassa.

Neurospora crassa ERG-11；cloning；protein expression and purification；polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0258

2017-04-01

國際遺傳工程與生物技術(shù)中心聯(lián)合研究項目（CRP/CHN15-01）

劉雁霞，女，碩士，研究方向：大健康生物技術(shù)；E-mail：liuyanxia@mail.tust.edu.cn

樊振川，男，博士，研究方向：大健康生物技術(shù)；E-mail：fanzhen@tust.edu.cn