楊艷紅 余瑛 胡永強(qiáng) 余溪 李青青

（重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054）

解淀粉芽孢桿菌AF1發(fā)酵液的抗菌活性與抗菌機(jī)理

楊艷紅 余瑛 胡永強(qiáng) 余溪 李青青

（重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054）

測(cè)定解淀粉芽孢桿菌AF1發(fā)酵液的抗菌譜，對(duì)發(fā)酵液抗MRSA的活性穩(wěn)定性及抗MRSA機(jī)制進(jìn)行初步探究，為尋找新的抗MRSA化合物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。以耐藥金葡菌SA46為病原指示菌，不同pH、溫度和蛋白酶處理后，考察AF1發(fā)酵液剩余抗菌活性。用顯微鏡和透射電鏡觀察經(jīng)發(fā)酵液處理后的SA46形態(tài)變化，并用凝膠電泳分析SA46的蛋白質(zhì)和DNA滲漏情況，初步探討其抗菌機(jī)制。結(jié)果顯示，AF1發(fā)酵液具有廣譜抗菌活性：不僅對(duì)臨床耐藥金葡菌、一般臨床大腸桿菌和金葡菌有很強(qiáng)抑菌作用，同時(shí)對(duì)大部分試驗(yàn)的植物病原菌也有較好抑菌作用。發(fā)酵液在pH 2.0-9.0，4-80℃，120 min后抗菌活性均保持95%以上；并且對(duì)蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶穩(wěn)定。SA46經(jīng)發(fā)酵液（MIC）處理后，顯微鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞壁受到不同程度破壞；在DNA和蛋白質(zhì)電泳圖上，試驗(yàn)組SA46的DNA和蛋白質(zhì)條帶很清晰，即SA46蛋白質(zhì)和DNA出現(xiàn)滲漏，而對(duì)照組均沒有條帶出現(xiàn)，初步推斷AF1對(duì)MRSA的抗菌機(jī)理是破壞病原菌的細(xì)胞壁來抑制細(xì)胞生長的。菌株AF1可作為抗MRSA藥物研發(fā)的潛在新來源。

解淀粉芽孢桿菌；抗菌譜；抗MRSA；細(xì)胞壁

近年來，隨著廣譜抗生素的廣泛濫用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）已經(jīng)成為全球社區(qū)和醫(yī)院感染的重要病原菌之一。每年數(shù)百萬人遭受感染，并且出現(xiàn)的頻率越來越高，在2011年至2014年間，美國醫(yī)院從患者的鼻孔和血液培養(yǎng)中收集了516種MRSA分離物［1，2］。由于MRSA具有多部位感染和多重耐藥性，已被公認(rèn)為世界三大最難解決的感染性疾病之一［3，4］。目前，用于臨床的藥物主要是萬古霉素、去甲基萬古霉素、替考拉寧、達(dá)托霉素和利奈唑胺等。萬古霉素、去甲基萬古霉素雖然治療效果好，抗菌譜廣，但是對(duì)腎、耳有一定的毒性［5］，且已經(jīng)出現(xiàn)了多種萬古霉素耐藥菌株［6］。替考拉寧雖然腎毒性比萬古霉素低，但與其他糖肽類藥物有交叉耐藥性；達(dá)托霉素很難引起和其他抗生素發(fā)生交叉耐藥的問題，能達(dá)到比萬古霉素更好的治療效果［7］，但其諸如胃腸道反應(yīng)、發(fā)熱、頭疼等不良反應(yīng)較多［8］；在中國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)利奈唑胺耐藥菌株，并且有血小板減少、導(dǎo)致視神經(jīng)和周圍神經(jīng)病變等副作用［9-12］。因此，研究和篩選更加安全、有效、穩(wěn)定的抗MRSA的抗生素，對(duì)于控制感染流行和臨床治療有著重要的意義。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefacien）是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，在自然界分布廣泛，易分離培養(yǎng)，對(duì)人畜無毒無害，不污染環(huán)境。解淀粉芽孢桿菌在其生長過程中可以產(chǎn)生一系列能夠抑制真菌和細(xì)菌活性的代謝物。目前研究較多的是其對(duì)植物病原菌的抑制作用，被廣泛應(yīng)用于花卉、水果以及各種農(nóng)作物病害防治［13-19］。但是，解淀粉芽孢桿菌用于臨床治療的研究尚不多。本研究主要對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的一株解淀粉芽孢桿菌［20］的抗菌活性和抗MRSA機(jī)理進(jìn)行初步探究，以期為解淀粉芽孢桿菌的抗MRSA活性物質(zhì)的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 AF1，重慶理工大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室分離。病原指示菌（1）病原細(xì)菌：WHO2、252、SA44、SA45、SA46、SA47、SA48、SWSA58、SWSA59、SWSA60、SWSA61、SWSA62、35218、SWEC41、SWEC44、SWEC45、SWEC46、SWEC47、 SWKP41、SWKP42、SWKP43、SWKP44、SWKP45、SWKP46、SWKP47和KP42（由第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部藥理學(xué)教研室提供）。（2）植物病原菌：柑橘綠霉、枯萎、疫霉、蕃茄早疫、花生黑斑、棉立枯、稻瘟、煙草赤星、黃瓜灰霉（由本校余瑛老師提供）。

1.1.2 培養(yǎng)基 抗菌活性篩選培養(yǎng)基，如表1。

表1 抗菌活性篩選培養(yǎng)基

1.2 方法

1.2.1 AF1發(fā)酵液抗菌譜

1.2.1.1 發(fā)酵液樣品制備 將斜面菌種挑取1環(huán)接種到裝有50 mL生長培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃，200 r/min培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到5.0時(shí)，按1%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液于12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm膜過濾，收集濾液備用。

1.2.1.2 對(duì)病原細(xì)菌的處理 分別將各斜面病原菌種，接種至裝有30 mL新鮮液體LB培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，37℃，200 r/min培養(yǎng)20 h。然后，采用平板傾注法，把各個(gè)病原菌液分別接種至LB固體培養(yǎng)基，再在每個(gè)病原菌的LB固體平板上分別均勻打孔，孔徑為8 mm，每孔接入200 μL上述發(fā)酵濾液，37℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。1.2.1.3 對(duì)植物病原真菌的處理 采用平板對(duì)峙法，在PDA平板中，將直徑約0.3 cm的兩塊指示病原菌瓊脂塊接種在距平板中央3 cm處的直線上兩點(diǎn)處，平板中央打孔，孔徑為8 mm，接入1.2.1.1制備好的發(fā)酵濾液200 μL，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，測(cè)量抑菌圈直徑（中心至兩病原菌菌落菌絲邊緣的距離）的大小作為抑菌活性指標(biāo)。

1.2.2 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)耐藥金葡菌SA46的抗菌活性 將斜面菌種挑取1環(huán)接種到裝有50 mL生長培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃，200 r/min培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到5.0時(shí)，按1%接種量分別接入1.1.2中6種不同的培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液于12 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm膜過濾，收集濾液。以耐藥金葡菌SA46為指示菌，采用1.2.1.2相同的平板傾注法，測(cè)定每種發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌圈大小。

1.2.3 AF1發(fā)酵液活性穩(wěn)定性研究

1.2.3.1 pH值對(duì)發(fā)酵液活性的影響 取27支潔凈試管，每支分別取1.2.1.1制備好的發(fā)酵液10 mL，其中3支對(duì)照原液組保持自然pH值，其余用少量鹽酸溶液和NaOH溶液分別調(diào)pH為2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和11.0。每個(gè)pH分別處理30、60、90和120 min，處理后的樣品調(diào)回原來的自然pH值，再用0.22 μm濾膜過濾各樣品，收集濾液，每個(gè)pH處理重復(fù)3次。再用耐藥金葡菌SA46為指示菌，參考1.2.1.2測(cè)定各樣品的抑菌圈大小。以處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，以相對(duì)活性為縱坐標(biāo)，繪制曲線。以對(duì)照原液組的抑菌圈大小為活性100%，計(jì)算各pH組的相對(duì)活性。

1.2.3.2 溫度對(duì)發(fā)酵液活性的影響 取18支潔凈離心管，每支分別取1.2.1.1制備好的發(fā)酵液30 mL，其中3支對(duì)照組放置室溫，其余分別放置冰箱和水浴鍋保持4℃、30℃、60℃、80℃和100℃。每個(gè)溫度分別處理30、60、90和120 min，處理完畢后每支離心管補(bǔ)加去離子水至原來的刻度線，再用0.22 μm濾膜過濾各樣品，收集濾液，每個(gè)溫度處理重復(fù)3次。再用耐藥金葡菌SA46為指示菌，參考1.2.1.2測(cè)定各樣品的抑菌圈大小。以處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，以相對(duì)活性為縱坐標(biāo)，繪制曲線。以對(duì)照組的抑菌圈大小為活性100%，計(jì)算各溫度的相對(duì)活性。

1.2.3.3 蛋白酶對(duì)發(fā)酵液活性的影響 取12支潔凈試管，每支分別取1.2.1.1制備好的發(fā)酵液10 mL，其中3支為對(duì)照組，不加任何蛋白酶，其余9支，分別加入蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶，使酶的終濃度為1 mg/mL，每處理重復(fù)3次。其中，胃蛋白酶組調(diào)pH為2.0，蛋白酶K和胰蛋白酶組pH值為7.0，于37℃，處理2 h，處理完畢后，再把各濾液pH調(diào)至原發(fā)酵液pH，用0.22 μm濾膜過濾各樣品，收集濾液。再用耐藥金葡菌SA46為指示菌，參考1.2.1.2測(cè)定各樣品的抑菌圈大小。以對(duì)照組的抑菌圈大小為活性100%，計(jì)算各蛋白酶處理組的相對(duì)活性。

1.2.4 AF1 發(fā)酵液對(duì)耐藥金葡菌SA46抗菌機(jī)理初步研究

1.2.4.1 最低抑菌濃度測(cè)定［21］按最低抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）測(cè)定法測(cè)定上述制備的AF1菌的發(fā)酵濾液對(duì)耐藥金葡菌SA46的MIC值。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的SA46菌液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔50 μL，在向各孔中加入50 μL經(jīng)倍比稀釋的AF1菌的發(fā)酵濾液，陰性對(duì)照為加入無菌水。37℃培養(yǎng)6 h，酶標(biāo)儀在λ=630 nm檢測(cè)OD值，與初始值相比，OD值未有顯著變化的最小濃度定義為AF1發(fā)酵濾液對(duì)該菌的最低抑菌濃度。1.2.4.2 發(fā)酵液對(duì)耐藥金葡菌SA46菌株細(xì)胞壁的影響 按5%的接種量將對(duì)數(shù)期的SA46菌分別接種至30 mL液體LB培養(yǎng)基中，分別記作實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，按最低抑菌濃度稀釋比分別向?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組中加入10 mL 1.2.1.1制備好的發(fā)酵濾液和10 mL無菌水，然后將其在37℃，200 r/min條件下，培養(yǎng)12 h。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的SA46菌液，分別取5 mL，經(jīng)5 000 r/min離心10 min，菌體用生理鹽水洗滌1遍，分別加入蒸餾水5 mL，待作用15 min后，終止反應(yīng)，革蘭氏染色，用油鏡觀察結(jié)果。另分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的SA46菌液于5 000 r/min下離心10 min，去上清液，收集菌體于1.5 mL EP管，沿管壁緩慢加入戊二醛固定液，并保持不破壞細(xì)菌團(tuán)塊，送至重慶醫(yī)科大學(xué)透鏡室處理，切片，觀察，拍片。

1.2.4.3 對(duì)耐藥金葡菌SA46菌株基因組DNA和蛋白質(zhì)滲漏的影響 取對(duì)數(shù)期的SA46菌液10 000 r/min離心10 min，然后用生理鹽水洗滌2次，收集菌體。分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入100 μL 的AF1發(fā)酵濾液后加入300 μL無菌水，使其濃度為MIC，對(duì)照組加入400 μL水，每個(gè)組作兩個(gè)平行組，37℃作用90 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳30 min，觀察SA46基因組DNA的滲漏情況。同時(shí)，另取上清液中加入2×SDS上樣緩沖液，沸水浴15 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)用濃縮膠濃度為5.0%，分離膠濃度為15%，考馬斯亮藍(lán)染色后脫色，觀察SA46的蛋白質(zhì)滲漏情況。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵液抗菌譜

2.1.1 發(fā)酵液對(duì)病原細(xì)菌的抗菌活性 以不同病原細(xì)菌為指示菌、測(cè)定發(fā)酵液對(duì)各病原菌的抑菌圈大?。ū?），發(fā)現(xiàn)AF1發(fā)酵液不僅對(duì)標(biāo)準(zhǔn)耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）有較強(qiáng)的抑菌活性，同時(shí)對(duì)臨床MRSA的抑菌作用也很強(qiáng)。對(duì)臨床大腸桿菌和普通金葡菌均有抑菌作用，但是其對(duì)臨床的假單胞菌株卻沒有任何活性。

2.1.2 發(fā)酵液對(duì)植物病原菌的抑菌活性 以不同植物病原菌為指示菌，測(cè)定發(fā)酵液對(duì)各病原菌的抑菌圈大小，結(jié)果（表3）表明AF1發(fā)酵液對(duì)大部分試驗(yàn)菌株有強(qiáng)抑菌活性，特別是柑橘綠霉和棉立枯等菌效果明顯。

2.2 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)SA46的抗菌活性

把AF1接種6種不同的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，以耐藥金葡菌SA46為病原指示菌，分別測(cè)定每種發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌圈大小，結(jié)果如表4所示。AF1在LB發(fā)酵培養(yǎng)基①中不能產(chǎn)生抗SA46活性物質(zhì)，同時(shí)把發(fā)酵培養(yǎng)基中的馬鈴薯換成淀粉后培養(yǎng)基⑤也不能產(chǎn)生抗菌活性，所以肯定馬鈴薯汁中的某些成分是抗菌化合物的合成的必要成分。另外在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入NaCl的培養(yǎng)基⑥無抗菌活性，可見NaCl的添加抑制了活性化合物的生成。

2.3 AF1發(fā)酵液活性穩(wěn)定性

2.3.1 pH值對(duì)發(fā)酵液活性的影響 對(duì)AF1發(fā)酵液抗SA46活性的pH穩(wěn)定性研究結(jié)果（圖1）表明，發(fā)酵液在pH 2.0-9.0放置120 min均穩(wěn)定，抗菌活性保留95%以上，只有pH 11.0活性有所下降，但也保持在85%以上。

2.3.2 溫度對(duì)發(fā)酵液活性的影響 在不同溫度下處理AF1發(fā)酵液后，測(cè)定其抗SA46活性，發(fā)現(xiàn)在4-80℃，經(jīng)過120 min后抗菌活性仍保持95%以上，只有100℃煮沸后，活性有所下降，但也有原活性的80%（圖2）。

表2 AF發(fā)酵液對(duì)不同病原細(xì)菌的抗菌活性

表3 AF1發(fā)酵液對(duì)不同植物病原真菌的抗菌活性

表4 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)SA46的抗菌活性

圖1 不同pH值對(duì)發(fā)酵液活性的影響

圖2 溫度對(duì)發(fā)酵液活性的影響

2.3.3 蛋白酶對(duì)發(fā)酵液活性的影響 用蛋白酶K處理AF1發(fā)酵濾液2 h后，其抗SA46活性保持不變（圖3），可見發(fā)酵液中的抗SA46活性物質(zhì)為非蛋白類化合物，或者化合物中不包含脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵；用胃蛋白酶處理AF1發(fā)酵上清液后，抑菌活性也沒有降低，可見發(fā)酵液中的抗菌化合物為非蛋白類化合物，或者其不含疏水殘基肽鍵；用胰蛋白酶處理后，活性也無降低，說明發(fā)酵液中的抗菌化合物為非蛋白類化合物，或者不含有賴氨酸、精氨酸。因此，AF1發(fā)酵液具有非常好的蛋白酶穩(wěn)定性。

2.4 AF1發(fā)酵液對(duì)MRSA抗菌機(jī)理

圖3 不同蛋白酶對(duì)發(fā)酵液活性的影響

2.4.1 最低抑菌濃度 由表5可知，稀釋倍數(shù)為2和4的處理組處理6 h后與其初始相比，OD630值有所下降，但從稀釋倍數(shù)8開始直到256倍，與其初始相比，OD630值開始有所上升，并且隨著稀釋倍數(shù)增加到256時(shí)，OD630值上升非常明顯，增加了16.22%，而陰性對(duì)照CK1上升了32.34%。與初始值相比，把OD630值未有顯著變化的最小濃度定義為AF發(fā)酵濾液對(duì)該菌的最低抑菌濃度，因此選擇稀釋倍數(shù)為4的AF1發(fā)酵液濃度為最低抑菌濃度MIC。

表5 AF1發(fā)酵液最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)（n=3，x-±s）

2.4.2 發(fā)酵液對(duì)耐藥金葡菌SA46菌株細(xì)胞壁的影響 通過革蘭氏染色鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)（圖4），不加AF1發(fā)酵液處理的正常SA46為紫色葡萄球狀，而經(jīng)AF1發(fā)酵液處理后的SA46的菌株，細(xì)胞形態(tài)由原來的球狀變?yōu)殚L桿狀，且細(xì)胞體積明顯增大。由此說明，在AF1發(fā)酵液的最低抑菌濃度（MIC）下，SA46菌株細(xì)胞壁受到一定程度的破壞。

圖4 MRSA菌株細(xì)胞形態(tài)

采用透射電鏡法觀察，結(jié)果（圖5）表明，經(jīng)AF1發(fā)酵液處理后的SA46菌株，出現(xiàn)了一些異形（桿狀）菌，并且這些菌的細(xì)胞壁出現(xiàn)凹凸不平的松散狀，進(jìn)一步驗(yàn)證了耐藥金葡菌SA46在AF1發(fā)酵液的作用下，細(xì)胞壁受到破壞。

圖5 SA46菌株透射電鏡圖

2.4.3 發(fā)酵液對(duì)耐藥金葡菌SA46菌株基因組DNA和蛋白質(zhì)滲漏的影響 采用瓊脂糖凝膠電泳分析，SA46菌株經(jīng)MIC濃度下的AF1發(fā)酵液作用后的DNA滲漏情況。結(jié)果如圖6，用生理鹽水處理的對(duì)照組SA46和AF1發(fā)酵液樣品均沒有條帶出現(xiàn)，而實(shí)驗(yàn)組的SA46的DNA條帶卻很清晰。

SDS-PAGE凝膠電泳（圖7）顯示，用MIC濃度的發(fā)酵液處理的實(shí)驗(yàn)組有大量明顯的蛋白質(zhì)條帶，而用生理鹽水處理的對(duì)照組的SA46卻無任何條帶出現(xiàn)，而AF1發(fā)酵液樣品出現(xiàn)少量蛋白質(zhì)條帶。

綜上證明，試驗(yàn)組處理時(shí)其細(xì)胞壁遭到破壞，導(dǎo)致胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)滲漏。因此，進(jìn)一步推斷AF1發(fā)酵液對(duì)耐藥金葡菌SA46的抗菌機(jī)理是破壞病原菌的細(xì)胞壁來抑制細(xì)胞生長，其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

圖6 用AF1發(fā)酵液處理后的SA46的DNA電泳圖

圖7 用AF1發(fā)酵液處理后的SA46蛋白質(zhì)電泳圖

3 討論

目前，對(duì)解淀粉芽孢桿菌研究主要集中在生防領(lǐng)域，用于植物病原真菌和細(xì)菌的防治［22，23］。近年來，隨著進(jìn)一步深入研究，其作為食品防腐劑和益生菌開發(fā)也在不斷受到重視［24，25］。其抑菌物質(zhì)主要包括3大類即多肽類、脂肽類及抑菌蛋白類，對(duì)植物病原真菌和細(xì)菌有較好抑制作用，但并未見文獻(xiàn)報(bào)道它們對(duì)MRSA有抑制作用。除了這3類化合物外，僅有幾篇文獻(xiàn)報(bào)道解淀粉芽孢桿菌還可以產(chǎn)生羊毛硫抗生素［26］、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素［27，28］、酚類化合物［29］及聚酮類抗生素［30］。除聚酮類外，其他3種均有對(duì)MRSA有抑制作用的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)中初步確定AF1產(chǎn)生的抗耐藥金葡菌SA46化合物并不是文獻(xiàn)報(bào)道的其他3種化合物即羊毛硫抗生素［26］、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素［27，28］和酚類化合物［29］。首先，根據(jù)AF1發(fā)酵液的抗SA46化合物的pH和熱穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，其pH和熱穩(wěn)定性都非常好，與文獻(xiàn)［25］報(bào)道的羊毛硫抗生素相似，但經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)基篩選實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為AF1發(fā)酵的抗MRSA化合物和文獻(xiàn)［25］報(bào)道的羊毛硫抗生素不是同一個(gè)化合物，因?yàn)槲墨I(xiàn)報(bào)道的羊毛硫抗生素化合物可以用LB培養(yǎng)基大量發(fā)酵生產(chǎn)，而我們的AF1菌經(jīng)LB發(fā)酵以后，發(fā)酵液根本就沒有抗耐藥金葡菌SA46的活性；其次，由于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，酸性條件下易發(fā)生苷鍵水解，堿性條件下內(nèi)酯環(huán)易破裂，而根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果AF1發(fā)酵液在酸性和堿性均較穩(wěn)定，因此AF1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)也不是文獻(xiàn)所報(bào)道的大環(huán)內(nèi)酯類化合物；最后，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AF1不能用LB培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生抗SA46物質(zhì)，培養(yǎng)基中NaCl的添加將完全抑制抗SA46物質(zhì)的產(chǎn)生，這與Jeyanthi［29］報(bào)道的產(chǎn)生酚類抑菌化合物的培養(yǎng)基添加12%的NaCl有助于提高抗MRSA活性物的產(chǎn)量完全不同。可見，AF1菌產(chǎn)生的抗MRSA活性化合物也并非是文獻(xiàn)報(bào)道的酚類化合物。因此，初步推斷AF1菌發(fā)酵的抗MRSA化合物不是現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的化合物，很可能是一種或多種新化合物。

隨著基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)迅猛發(fā)展和對(duì)微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)與分子機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，抗生素篩選靶點(diǎn)不斷涌現(xiàn)，增強(qiáng)了新型抗生素篩選的特異性、安全性和高效性。同時(shí)，在細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)生物合成和DNA復(fù)制與修復(fù)過程的傳統(tǒng)藥物靶點(diǎn)也找到不少新靶點(diǎn)，引起了研究者們的高度興趣［31］，尤其是對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁合成抑制劑的篩選。由于人體細(xì)胞無細(xì)胞壁，用于臨床的抗生素中，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗生素有很好的“選擇性毒性作用”，即對(duì)人體無毒或毒副作用甚微。因此，篩選抑制細(xì)胞壁合成的抗生素最具有實(shí)用意義。

本實(shí)驗(yàn)初步探討了AF1菌發(fā)酵液的抗菌機(jī)理，用AF1發(fā)酵液處理耐藥金葡菌SA46后，無論是對(duì)SA46的形態(tài)觀察，還是對(duì)SA46的蛋白質(zhì)和DNA的滲漏情況檢測(cè)，均表明SA46經(jīng)AF1發(fā)酵液處理后，其細(xì)胞壁遭到破壞。初步推斷AF1發(fā)酵液對(duì)MRSA的抗菌機(jī)理是破壞病原菌的細(xì)胞壁來抑制細(xì)胞生長。此外，AF1菌發(fā)酵的抗MRSA化合物很有可能是一種或多種作用于病原菌細(xì)胞壁的新化合物，其對(duì)人體毒害性較小，具有一定的研究價(jià)值。我們將對(duì)其抗菌化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)確證以及抗菌分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

經(jīng)抗菌譜測(cè)定表明解淀粉芽孢桿菌AF1發(fā)酵液具有廣譜抗菌活性，尤其對(duì)臨床MRSA抗菌活性很強(qiáng)。AF1發(fā)酵液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明AF1發(fā)酵液具有很好的溫度、pH和蛋白酶穩(wěn)定性。臨床耐藥金葡菌SA46經(jīng)AF1發(fā)酵液的最低抑菌濃度（MIC）處理后，用顯微鏡和透射電鏡觀察，均發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞壁受到不同程度的破壞；同時(shí)采用SDS-PAGE和瓊脂糖凝膠電泳分析，SA46的DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生滲漏。初步推斷AF1對(duì)MRSA的抗菌機(jī)理是破壞病原菌的細(xì)胞壁來抑制細(xì)胞生長。

［1］ Marklevitz J, Harris LK. Improved annotations of 23 differentially expressed hypothetical proteins in methicillin resistant S. aureus［J］. Bioinformation, 2017, 13（4）：104-110.

［2］ Tickler IA, Goering RV, Mediavilla JR, et al. Continued expansion of USA300-like methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）among hospitalized patients in the United States［J］. Diagn Microbiol Infect Dis, 2017（in press）.

［3］ 李海清, 王鳳玲, 劉靜. 骨外系感染患者金黃色葡萄球菌耐藥性分析［J］. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 34（13）：1765-1767.

［4］ 馬翔宇, 易龍, 宋治遠(yuǎn). 醫(yī)源性MRSA感染及其防治研究進(jìn)展［J］. 臨床醫(yī)學(xué), 2003, 23（5）：53-54.

［5］ Ping L, Blair C, Amy S et al. El-Solh Clinical outcomes of linezolid and vancomycin in patients with nosocomial pneumonia caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus stratified by baseline renal function：a retrospective, cohort analysis［J］. BMC Nephrology, 2017, 18：168-177.

［6］ Suresh P, Hiroshi H, Atmika P, et al. Genomic analysis of vancomycin-resistant Staphylococcus aureus VRS3b and its comparison with other VRSA isolates［J］. Drug Discov Ther, 2017, 1：1-6.

［7］ 趙博, 陳取, 杜志成, 等. 萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺、達(dá)托霉素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗菌活性及藥物優(yōu)弊的研究［J］. 中國實(shí)用醫(yī)藥, 2011, 6（18）：242-243.

［8］ Darren C, Kenneth C L, Min JY, et al Duration of prior vancomycintherapy and subsequent daptomycin treatment outcomes in methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia［J］. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2015, 83（2）：193-197.

［9］ Gerson SL, Kaplan SL, Bruss JB, et al. Hematologiceffects of linezolid：Summary of clinical experience［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2002, 46（8）：2723-2726.

［10］Rao N, Hamilton CW. Efficacy and safety of linezolid for Grampositive orthopedic infections：A prospective case series［J］. Diagn Microbiol Infect Dis, 2007, 59（2）：173-179.

［11］Bishop E, Melvani S, Howden BP, et al. Good clinical outcomes but highrates of adverse reactions during linezolidtherapy for serious infection：A proposed protocol for monitoring therapy in complex［J］. Antimicrob Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50（4）：1599-1602.

［12］楊元?jiǎng)? 李剛, 錢正剛. 利奈唑胺不良反應(yīng)文獻(xiàn)分析［J］. 實(shí)用藥物與臨床, 2013, 16（7）：621-623.

［13］Shahzad R, Khan AL, Bilal S, et al. Plant growth-promoting endophytic bacteria versus pathogenic infections：an example of Bacillus amyloliquefaciens RWL-1 and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in tomato［J］. Peer J, 2017, 5：e3107.

［14］ Vinodkumar S, Nakkeeran S, et al. Biocontrol potentials of antimicrobial peptide producing bacillus species：multifaceted antagonists for the management of stem rot of carnation caused by Sclerotinia sclerotiorum［J］. Front Microbiol, 2017, 8：446.

［15］Masmoudi F, Ben Khedher S, Kamoun A, et al. Combinatorial effect of mutagenesis and medium component optimization on Bacillus amyloliquefaciens antifungal activity and efficacy in eradicating Botrytis cinerea［J］. Microbiol Res, 2017, 197：29-38.

［16］Gotor-Vila A, Teixidó N, Di Francesco A, et al. Antifungal effect of volatile organic compounds produced by Bacillus amyloliquefaciens CPA-8 against fruit pathogen decays of cherry［J］. Food Microbiol, 2017, 64：219-225.

［17］關(guān)曉歡, 姜華. 解淀粉芽孢桿菌研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)世界, 2013（1）：4, 9.

［18］Lee HA, Kim JH. Isolation of Bacillus amyloliquefaciens strains with antifungal activities from Meju［J］. Preventive Nutrition & Food Science, 2012, 17（1）：64-70.

［19］Ji SH, Paul NC, Deng JH, et al. Biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 against fungal plant diseases［J］. Mycobiology, 2013, 41（4）：234-242.

［20］楊艷紅, 李世川, 蘭世玉, 等. 一株產(chǎn)耐酸性α—淀粉酶菌株的鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究［J］, 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2015,（9）：1544-1549.

［21］董文波. 細(xì)菌藥敏最低抑菌濃度微孔檢測(cè)板的研制［J］. 中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志, 2000（2）：47-48, 50.

［22］出曉銘, 林毅雄, 張珅, 等. 生防菌解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的研究進(jìn)展［J］. 包裝與食品機(jī)械, 2014, 32（6）：49-54.

［23］ Pretorius D, Van RJ, et al. Enhanced production of antifungal lipopeptides by Bacillus amyloliquefaciens for biocontrol of postharvest disease［J］. New Biotechnology, 2015, 32（2）：243-252.

［24］ Kadaikunnan S, Rejiniemon TS, Khaled JM, et al. In-vitro antibacterial, antifungal, antioxidant and functional properties of Bacillus amyloliquefaciens［J］. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 2015, 14（9）：1-11.

［25］張娟, 楊彩梅, 曹廣添, 等. 解淀粉芽孢桿菌及其作為益生菌的應(yīng)用［J］. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào), 2014, 26（4）：863-867.

［26］Arias AA, Ongena M, Devreese B, et al. Characterization of amylolysin, a novel lantibiotic from Bacillus amyloliquefaciens GA1［J］. PLoS One, 2013, 8（12）：1-10.

［27］楊橋, 瀚文菊, 張文俊, 等. 一株新型大環(huán)內(nèi)酯抗生素海洋解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定［J］. 中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 16（2）：92-95.

［28］Ravut RR, Jacobt MR, Chent XL, et al. Bacillusin A, antibacterial macrodiolide from Bacillus amyloliquefaciens AP 183［J］. Journal of Natural Products, 2015, 78（4）：924-928.

［29］Jeyanthi V, Velusamy P. Anti-methicillin resistant Staphylococcus aureus compound isolation from halophilic Bacillus amyloliquefaciens MHB1 and Determination of its mode of action using electron microscope and flow cytometry analysis［J］. Indian Journal of Microbiology, 2016, 56（2）：148-157.

［30］Arguelles-Arias A, Ongena M, Halimi B, et al. Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens［J］. Microbial Cell Factories, 2009, 8：63.

［31］謝練武, 李翔, 歐陽永長, 等. 抗生素作用新靶點(diǎn)的發(fā)掘策略［J］. 中國抗生素雜志, 2007, 32（11）：641-646.

（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Antimicrobial Activity and Anti-MRSA Mechanism of the Fermentation Broth of Bacillus amyloliquefaciens AF1

YANG Yan-hong YU Ying HU Yong-qiang YU Xi LI Qing-qing
（School of Pharmacy & Bioengineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054）

This study aims to measure the antimicrobial spectrum of fermentation broth of Bacillus amyloliquefaciens AF1 and to explore the activity stability and mechanism of anti-MRSA，for providing an experimental basis in seeking new anti-MRSA compounds. The drugresistant S. aureus SA46 was used as indicating pathogen，the rest antimicrobial activities of AF1 fermentation broth were detected after it was dealed with different pH，temperatures and proteases. The antmicrobial mechanism was studied preliminarily by observing the morphologic change of SA46 tread with AF1 fermentation broth under both optical microscope and transmission electron microscope，and by detecting the protein and DNA leakage of treated SA46 with AF1 fermentation broth with SDS-PAGE and agarose gel electrophoresis. The results showed that AF1 fermentation broth had a broad antimicrobial spectrum. It presented a strong inhibitory ability to all tested clinical drug-resistant Staphylococcus aureus，common clinical Escherichia coli and S. aureus；also it inhibited the most of the tested phytopathogen. The antimicrobial activity of AF1 fermentation broth remained more than 95% in pH 2.0 - 9.0 for 120 min from 4 to 80℃，and it was stable when adding protease K，pepsin and trypsin into the broth respectively. The cell walls of SA46 treated by AF1 fermentation broth（MIC）were destroyed at varied level while observed under both optical microscope and transmission electron microscope. Furthermore，the leakage of protein and DNA of treated SA46 with AF1 fermentation broth were checked by SDS-PAGE and agarose gel electrophoresis. The electrophoretic bands of experimental groups were clear，while there was no bands in control groups on both DNA and protein electrophorograms. Thus，a preliminary deduction was that the cell walls of MRSA were damaged by AF1 fermentation broth. In conclusion，B. amyloliquefaciens AF1 might be developed as a potential new source for the novel anti-MRSA medicines.

Bacillus amyloliquefaciens；antimicrobial spectrum；anti-MRSA；cell wall

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0312

2017-04-18

重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（cstc2014jcyjA0211）

楊艷紅，女，博士，副教授，研究方向：微生物資源與天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)；E-mail：yyh@cqut.edu.cn