周配+張磊+方亞坤+高巖+劉宇鵬

摘要：在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面設(shè)計法對日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonica）HD1025靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油合成甘油酸的條件進行優(yōu)化，并建立了各因素與甘油酸產(chǎn)量之間的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，采用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)甘油酸取得了較好的效果，且靜息細(xì)胞濃度、甘油濃度、反應(yīng)時間以及溫度等對甘油酸產(chǎn)量均有不同程度的影響。響應(yīng)面預(yù)測產(chǎn)甘油酸的最佳工藝為靜息細(xì)胞濃度0.67%、甘油濃度160.74 g/L、溫度30.10 ℃、pH值7.0、反應(yīng)時間 3 d，此時甘油酸產(chǎn)量為33.83 g/L，與響應(yīng)面極值吻合，表明優(yōu)化方案達(dá)到了預(yù)期效果。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面設(shè)計；靜息細(xì)胞；甘油酸；甘油

中圖分類號： S188文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0216-04

隨著化石能源的大量使用，石油等能源儲量的減少，人們越來越關(guān)注可再生資源的開發(fā)，并且開始投入大量的精力來研發(fā)各種可以代替石油等化石燃料的可再生資源，其中生物能源的開發(fā)就是一條途徑。然而在生物燃料的生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大約10%的副產(chǎn)物——甘油[1-2]。因此，在過去的10年間，越來越多的研究者開始探索能夠?qū)⒏视娃D(zhuǎn)化成更有價值的化學(xué)物質(zhì)的方法，其中利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘油酸就是一條重要的途徑，微生物法生產(chǎn)甘油酸具有對環(huán)境溫和、產(chǎn)量高、方法簡便而且產(chǎn)物具有立體選擇性等優(yōu)點，因此越來越受到關(guān)注。

甘油酸作為一種有機酸普遍存在于自然界各種各樣的植物中，其衍生物（3-磷酸甘油酸）作為一種代謝產(chǎn)物存在于人體內(nèi)。甘油酸及其衍生物具有很多的生物學(xué)功能，例如在人體內(nèi)D-甘油酸能促進乙醇分解代謝，有文獻報道稱在狗體內(nèi)的甘油酸具有膽固醇活性和肝興奮劑的功能[3]。甘油酸衍生出的酯類低聚物能表現(xiàn)出抗胰蛋白酶活性[4]。在食品方面，甘油酸可以作為一種食品添加劑。所以氧化甘油生產(chǎn)甘油酸，既可充分利用生物燃料行業(yè)的廢棄物，又具有很大的市場潛力。

國外有關(guān)微生物法生產(chǎn)甘油酸的報道較少，其中報道較多的4株菌株為熱帶醋酸桿菌（Acetobacter tropicalis）NBRC16470[2]、葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter sp.） NCBR3259[3]、氧化葡萄糖酸桿菌（G. oxydans） NBRC3292[1]、費拉托葡萄糖酸桿菌（G. frateurii） NBRC3262[1]，它們生產(chǎn)甘油酸的產(chǎn)量分別為22.7、33.7、32.6、57.2 g/L。國外有關(guān)微生物法生產(chǎn)甘油酸的報道主要是以微生物生長細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化法來生產(chǎn)甘油酸，該方法也存在一些問題，如培養(yǎng)基成分復(fù)雜導(dǎo)致反應(yīng)體系雜質(zhì)多，后期除雜困難，不利于產(chǎn)物的提取等。而靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是以微生物整體細(xì)胞作為反應(yīng)催化劑，對外源底物進行結(jié)構(gòu)修飾的微生物轉(zhuǎn)化，除具有反應(yīng)條件溫和、選擇性強、無污染、成本低、副產(chǎn)物少等優(yōu)點，還可有效地提高下游產(chǎn)物的處理效率，降低提取成本。其原理是靜息狀態(tài)的微生物是限制性營養(yǎng)物質(zhì)中靜息細(xì)胞在非生長條件下的代謝，在這種狀態(tài)下的微生物由于缺乏某些必需的營養(yǎng)成分使細(xì)胞不能繁殖，但因含有各種酶系統(tǒng)，細(xì)胞仍能轉(zhuǎn)化其他營養(yǎng)物質(zhì)[5-8]。目前，國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)甘油酸的詳細(xì)報道。

在筆者所在課題組前期的研究中，已從腐爛的蔬菜中篩選獲得1株能夠生產(chǎn)甘油酸的菌株Gluconobacter japonicas HD1025，本試驗主要利用靜息細(xì)胞培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)甘油酸并利用SAS軟件進一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，探討各因素的交互效應(yīng)，得到較優(yōu)的條件組合。

1材料與方法

1.1試驗材料

菌種：日本葡萄糖酸桿菌HD1025，由筆者所在實驗室從腐爛的蔬菜中分離獲得。

甘油酸（分析純，日本東京化成工業(yè)株式會社），甘油（分析純，購自鄭州派尼化學(xué)試劑廠），蛋白胨（生化純，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），CaCO3（分析純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），KH2PO4（分析純，購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）等。

種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，5 g/L酵母粉，5 g/L蛋白胨，1 g/L MgSO4·7H2O，pH值為6.5，115 ℃滅菌20 min。

1.2試驗方法

1.2.1靜息細(xì)胞的制備按5%接種量將HD1025接入種子培養(yǎng)基的搖瓶中，30 ℃恒溫培養(yǎng)10 h后，8 000 r/min離心 15 min，棄上清液，收集菌體用無菌水洗滌3遍，制得靜息細(xì)胞，4 ℃冷藏備用。

1.2.2靜息細(xì)胞初始培養(yǎng)條件靜息細(xì)胞濃度為0.5%；培養(yǎng)體系為100 g/L甘油，3 g/L KH2PO4，15 g/L CaCO3，pH值為7.0，在30 ℃恒溫振蕩搖床中220 r/min培養(yǎng)3 d。

1.2.3發(fā)酵液中菌體細(xì)胞濃度的測定通過測定細(xì)胞吸光度得到細(xì)胞濃度。將發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用分光光度計于600 nm處測吸光度，D600 nm =稀釋倍數(shù)×分光光度計讀數(shù)。量取一定量的不同吸光度菌體懸浮液，離心棄上清液后于105 ℃烘干至恒質(zhì)量，此時的質(zhì)量即為細(xì)胞干質(zhì)量，計算D600 nm與細(xì)胞干質(zhì)量的關(guān)系。

1.2.4甘油和甘油酸的檢測甘油和甘油酸的檢測方法參考文獻[9-10]。

1.2.5靜息細(xì)胞濃度對轉(zhuǎn)化甘油酸的影響將靜息細(xì)胞濃度設(shè)定為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，其他條件不變，按照“1.2.2”節(jié)中方法進行轉(zhuǎn)化，利用高效液相色譜（HPLC）測定甘油酸的含量，考察靜息細(xì)胞濃度對甘油酸產(chǎn)量的影響。

1.2.6pH值對轉(zhuǎn)化甘油酸的影響在最適的靜息細(xì)胞濃度的基礎(chǔ)上，將pH值分別設(shè)定為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他條件不變，按照“1.2.2”節(jié)中方法進行轉(zhuǎn)化，然后檢測甘油酸含量，考察pH值對甘油酸產(chǎn)量的影響。endprint

1.2.7溫度對轉(zhuǎn)化甘油酸的影響在最適靜息細(xì)胞濃度和最適pH值的基礎(chǔ)上，將溫度設(shè)定為15、20、25、30、35、40 ℃，其他條件固定不變，按照“1.2.2”節(jié)中方法進行轉(zhuǎn)化，然后檢測甘油酸的含量，考察溫度對甘油酸產(chǎn)量的影響。

1.2.8甘油濃度對轉(zhuǎn)化甘油酸的影響在最適靜息細(xì)胞濃度、最適pH值和適宜的溫度的基礎(chǔ)上，將甘油濃度設(shè)定為60、80、100、120、140、160、180、200 g/L，其他條件固定不變，按照“1.2.2”節(jié)中方法進行轉(zhuǎn)化，然后檢測甘油酸含量，考察甘油濃度對甘油酸產(chǎn)量的影響。

1.2.9反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化甘油酸的影響選擇最適靜息細(xì)胞濃度和最適pH值，添加合適的甘油濃度和適宜的溫度培養(yǎng) 5 d，每天取樣檢測甘油酸含量，考察反應(yīng)時間對甘油酸產(chǎn)量的影響。

1.2.10響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化甘油酸轉(zhuǎn)化工藝在單因素試驗的基礎(chǔ)上，將甘油酸轉(zhuǎn)化工藝的主要影響因素綜合在一起，以溫度、甘油濃度和靜息細(xì)胞濃度3個因素為自變量，以甘油酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的試驗，其他因素不變。試驗設(shè)計如表1所示。

2結(jié)果與分析

2.1靜息細(xì)胞濃度對甘油酸產(chǎn)量的影響

由圖1可知，靜息細(xì)胞濃度對甘油酸產(chǎn)量有較大影響，當(dāng)靜息細(xì)胞濃度為0.6%時，甘油酸產(chǎn)量達(dá)最大值，為 21.32 g/L，此后甘油酸的產(chǎn)量隨著靜息細(xì)胞濃度的增大而減少。當(dāng)靜息細(xì)胞濃度低于0.6%時，甘油酸產(chǎn)量隨菌體濃度的增加而增加，因為隨著細(xì)胞濃度增大，參加轉(zhuǎn)化甘油酸反應(yīng)的酶量也相應(yīng)增大，從而加快轉(zhuǎn)化甘油酸的速率；但是，過高的細(xì)胞濃度并不能提高酶的催化效率。在轉(zhuǎn)化過程中，氧氣也是必需的底物之一，單純地提高菌體量并不能提高轉(zhuǎn)化效率，相反，由于過多的菌體會影響溶液的傳質(zhì)效率，不利于轉(zhuǎn)化的進行。隨著細(xì)胞濃度的進一步增加，甘油酸產(chǎn)量降低，是由于細(xì)胞濃度過高造成細(xì)胞膜的破裂影響酶活，從而降低甘油酸產(chǎn)量。因此，靜息細(xì)胞濃度選擇0.6%。

2.2初始pH值對甘油酸產(chǎn)量的影響

由于甘油酸屬于有機酸，在發(fā)酵過程中pH值低于3時會嚴(yán)重影響菌體的生長和甘油酸的產(chǎn)量，因此，本試驗在發(fā)酵過程中添加CaCO3來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值。初始pH值對甘油酸產(chǎn)量的影響如圖2所示，可見不同初始pH值對甘油酸產(chǎn)量的影響較小。

2.3溫度對甘油酸產(chǎn)量的影響

由圖3可知，溫度對靜息細(xì)胞產(chǎn)甘油酸有很大的影響，當(dāng)溫度在30～35 ℃之間時，甘油酸產(chǎn)量達(dá)22.77 g/L，隨著溫度進一步升高，甘油酸產(chǎn)量明顯下降，這可能是由于反應(yīng)溫度過高降低了酶活，導(dǎo)致甘油酸產(chǎn)量有所下降。較高的溫度需要消耗更多的能量，出于節(jié)能方面的考慮，本試驗選擇最適溫度為30 ℃。

2.4甘油濃度對甘油酸產(chǎn)量的影響

氧化葡萄酸桿菌轉(zhuǎn)化制備甘油酸的底物是甘油，適當(dāng)提高底物濃度，有利于提高甘油酸的產(chǎn)量，但若底物濃度過高，可能會對轉(zhuǎn)化制備甘油酸產(chǎn)生抑制作用，從而降低甘油的實際轉(zhuǎn)化率。如圖4所示，隨著甘油濃度的增加，甘油酸產(chǎn)量逐漸增加。當(dāng)甘油濃度為160 g/L時，甘油酸產(chǎn)量為 30.47 g/L，此后繼續(xù)增加甘油濃度時，甘油酸產(chǎn)量卻有所下降，這可能是因為高濃度甘油對靜息細(xì)胞的酶活力有抑制作用，從而導(dǎo)致甘油酸產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率降低。因此，甘油濃度選擇 160 g/L。

2.5反應(yīng)時間對甘油酸產(chǎn)量的影響

由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)時間為3 d時，甘油酸產(chǎn)量達(dá) 29.53 g/L，之后隨著反應(yīng)時間的延長，甘油酸產(chǎn)量達(dá)到平衡狀態(tài)，幾乎不再增加，從經(jīng)濟角度考慮，反應(yīng)時間選擇為3 d。

2.6響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果分析

單因素試驗研究了培養(yǎng)基中各組分及培養(yǎng)條件對甘油酸產(chǎn)量的影響，由單因素試驗結(jié)果可確定溫度、甘油濃度和靜息細(xì)胞濃度是影響甘油酸產(chǎn)量的主要因素。為研究這些單因素之間的相互影響，根據(jù)單因素試驗所確定的這3個顯著因素的變化范圍，設(shè)計響應(yīng)面分析試驗考察溫度、甘油濃度和靜息細(xì)胞濃度對甘油酸產(chǎn)量的影響，明確這3個主要因素的最佳條件。

以甘油酸得率為響應(yīng)值，根據(jù)甘油酸產(chǎn)量響應(yīng)面設(shè)計試驗結(jié)果（表2），用SAS統(tǒng)計分析軟件進行多元回歸分析，所得

響應(yīng)面分析結(jié)果如圖6所示，在一定范圍內(nèi)，隨著甘油濃度、靜息細(xì)胞濃度、溫度的變化，甘油酸的產(chǎn)量呈先增后減的趨勢，這說明3種顯著因素相互作用后甘油酸的產(chǎn)量存在最大值，同時利用SAS軟件進行分析尋找到甘油酸產(chǎn)量達(dá)到最大值時，相對應(yīng)的3種顯著因素的最適濃度。從表3中可以看出，用回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，其因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著，決定系數(shù)為98.47%，說明回歸方程的擬合程度較好。

2.7驗證試驗

為了進一步研究最佳響應(yīng)值的范圍，預(yù)測3個因素的最佳理論濃度，進行脊嶺分析[11]，得出回歸模型存在最大值，甘油酸含量的最大估計值為34.04 g/L，此時靜息細(xì)胞濃度、溫度、甘油濃度的取值分別為0.67%、30.10 ℃、160.74 g/L。為了驗證優(yōu)化后轉(zhuǎn)化條件的可靠性，分別進行3次驗證試驗，所得甘油酸產(chǎn)量的平均值為33.83 g/L，與預(yù)測產(chǎn)量相近。

3結(jié)論

目前微生物游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化工藝通常采用2種方法：一種是生長細(xì)胞轉(zhuǎn)化法，另一種是靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。生長細(xì)胞轉(zhuǎn)化法中微生物生長代謝產(chǎn)生一定量的代謝產(chǎn)物，給后期產(chǎn)品的分離提純帶來一定的困難。而靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是將微生物細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)一定時間后，離心或過濾收集菌體靜息細(xì)胞，然后將靜息細(xì)胞懸浮于含有底物的水或緩沖液中進行生物轉(zhuǎn)化。此法的優(yōu)點是可以避免生長細(xì)胞對產(chǎn)物的降解作用，且產(chǎn)物后處理簡單，沒有培養(yǎng)基成分的污染，生產(chǎn)周期短，因而是微生物轉(zhuǎn)化的一種主要方式。

本試驗優(yōu)化產(chǎn)甘油酸的最佳工藝條件：靜息細(xì)胞濃度、溫度、甘油濃度的取值分別為0.67%、30.10 ℃、160.74 g/L，pH值7.0，反應(yīng)3 d，此時甘油酸的產(chǎn)量為33.83 g/L，比優(yōu)化前的 20.16 g/L 提高了67.8%。endprint

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