姜慧君，賀漪

（湖北省武漢市第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,湖北 武漢 430022）

MicroR N A-20b在卵巢癌細胞中的表達及對增殖和凋亡的影響*

姜慧君，賀漪

（湖北省武漢市第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,湖北 武漢 430022）

目的探討microRNA-20b（miR-20b）在卵巢癌細胞系中的表達及對增殖和凋亡的影響。方法實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）測定miR-20b在卵巢癌細胞系A(chǔ)431、SKOV3及正常卵巢上皮細胞系Hose中的相對表達量，將SKOV3細胞系分成未轉(zhuǎn)染對照、陰性對照及miR-20b模擬物組，用Lipofectamine 2000分別不轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染miR-20b scramble和miR-20b mimics，CCK8實驗測定3組細胞增殖能力，流式細胞術(shù)測定3組細胞凋亡，Western blot測定張力蛋白同源在10號染色體有缺失的磷酸酶（PTEN）、裂解型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的相對表達量。結(jié)果qRT-PCR示A431、SKOV3細胞系miR-20b相對表達量較Hose細胞系低；miR-20b模擬物組在0、24、48、72及96 h的OD45 nm值低于未轉(zhuǎn)染對照組和陰性對照組；miR-20b模擬物組凋亡率高于陰性對照組和未轉(zhuǎn)染對照組；miR-20b模擬物組PTEN相對表達量低于陰性對照組，裂解型PARP蛋白相對表達量高于陰性對照組。結(jié)論miR-20b抑制卵巢癌細胞增殖并促進凋亡，其機制可能與下調(diào)PTEN和上調(diào)PARP蛋白表達有關(guān)。

miR-20b;卵巢癌；增殖；凋亡

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，在發(fā)達國家，年齡標(biāo)化發(fā)病率為十萬分之9.1，年齡標(biāo)化死亡率為十萬分之5.0；在發(fā)展中國家，年齡標(biāo)化發(fā)病率為十萬分之5.0，年齡標(biāo)化死亡率為十萬分之3.1[1]。在卵巢癌早期，經(jīng)手術(shù)、化療等綜合治療后，5年生存率可達90%，而對于晚期卵巢癌，5年生存率則降至50%[2]。目前，對于卵巢癌的發(fā)病機制尚不十分清楚，深入研究卵巢癌的發(fā)病機制對設(shè)計合理的藥物具有重要的意義。microRNA是一類長度約19～22 nt的微小RNA，其通過與靶基因結(jié)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的負調(diào)控[3]，在腫瘤增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中起著重要的作用[4]。microRNA-20b（miR-20b）屬于microRNA-17大家族中miRNA 106a-363 cluster亞家族成員[5]，miR-20b被報道參與調(diào)節(jié)骨肉瘤[6]、膀胱癌[7]、乳腺癌[8]、食管癌[9]、胃癌[10]的增殖、自噬、遷移和侵襲等腫瘤生物學(xué)過程。然而，miR-20b對卵巢癌的增殖和凋亡的影響，目前尚未見報道，本研究在體外研究miR-20對卵巢癌增殖和凋亡的影響，并揭示其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備

卵巢癌細胞系A(chǔ)431、SKOV3及正常卵巢上皮細胞系Hose（美國ATCC公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Hyclone公司），Trizol（美國Invitrogen公司），Western blot所用一抗（美國BD公司），HRP標(biāo)記的二抗（美國 Invitrogen公司），miR-20b mimics及scramble均由廣州銳博公司合成。Lipofectamine 2000 reagent（美國Invitrogen公司），ABI Prism 7700系統(tǒng)的SYBR Green Reagents（日本TaKaRa公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將卵巢癌細胞系A(chǔ)431、SKOV3及正常卵巢上皮細胞系Hose加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后消化傳代。將卵巢癌SKOV3細胞系分成未轉(zhuǎn)染對照組、陰性對照及miR-20b模擬物組，陰性對照組及miR-20b模擬物組采用Lipofectamine 2000 reagent分別轉(zhuǎn)染miR-20b scramble和miR-20b mimics，未轉(zhuǎn)染對照組用PBS處理，作為空白對照，miR-20b模擬物組轉(zhuǎn)染序列：miR-20b mimics正向引物：5'-CAAAGUG CUCAUAGUGCAGGUAG-3'，miR-20b mimics 反向引物：5'-ACCUGCACUAUGAGCACUUUGUU-3’；陰性對照組轉(zhuǎn)染序列：miR-20b NC正向引物：5'-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3'，miR-20b NC 反向引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.3 R N A提取及實時定量聚合酶鏈反應(yīng)

用All-in-One microRNA抽提試劑盒和All-in-One miRNA實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測試劑盒提取和分離miRNAs，ABI Prism 7700系統(tǒng)的 SYBR Green Reagents qRT-PCR，在ABI 7500實時定量PCR儀中，以U6小核RNA作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法定量，量化miR-20b相對表達水平。

1.4 細胞增殖實驗

采用CCK-8法，將3組細胞消化成單細胞懸液，在96孔板上以2×103個/孔接種，每孔培養(yǎng)基體積 200μl。在分別培養(yǎng) 0、24、48、72、96 h 后，每孔加入20μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔吸光值，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制卵巢癌細胞增殖曲線。

1.5 細胞凋亡實驗

采用流式細胞術(shù)，用Annexin V/PI染色檢測，將3組細胞消化成單細胞懸液后，PBS清洗2次，并使用Binding Buffer重懸，加入相應(yīng)比例的Annexin V抗體，避光染色10 min后加入適量PBS溶液以及PI染料，流式細胞儀檢測Annexin V陽性細胞比例來確定細胞凋亡的變化。

1.6 Western blot

將陰性對照組和miR-20b模擬物組兩組細胞用RIPA細胞裂解液冰上裂解30 min后，變性、上樣，以每孔30μg總蛋白上樣，濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠100 V電泳2 h。常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，加入10號染色體有缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin ho-molog deleted from chromosome 10，PTEN）、裂解型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]一抗，濃度為 1∶200，37℃孵育 4 h，二抗（1∶500）孵育過夜，ECL液顯影，Quantity One 1-D分析軟件對蛋白質(zhì)印跡條帶進行定量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白測定值/GAPDH，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組間比較先行方差分析，在方差分析有意義的基礎(chǔ)上，再行LSD-t或SNK-q檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 m iR-20b在卵巢癌細胞系中低表達

qRT-PCR檢測miR-20b在A431細胞系中相對表達量為（0.300±0.050），在SKOV3細胞系中相對表達量為（0.100±0.020），在正常卵巢上皮細胞系Hose中相對表達量為1.000，提示3組間miR-20b的表達量經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=155.814，P=0.000）；A431 細胞系中 miR-20b 相對表達量與Hose細胞系比較，行LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （t=-0.700，P=0.000），A431 細胞系中miR-20b相對表達量低于正常卵巢上皮細胞系Hose；SKOV3細胞系中 miR-20b相對表達量與Hose細胞系比較，行LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.900，P=0.000），SKOV3細胞系中 miR-20b相對表達量低于正常卵巢上皮細胞系Hose。見圖1。

2.2 m iR-20b過表達抑制SKO V3細胞增殖

轉(zhuǎn)染miR-20b模擬物24 h后，qRT-PCR示，miR-20b模擬物組的miR-20b表達量是（45±2.800），陰性對照組為1.000，未轉(zhuǎn)染對照組為1.000，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.389，P=0.000）；miR-20b模擬物組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.872，P=0.000），miR-20b 模擬物組miR-20b相對表達量高于陰性對照組，提示轉(zhuǎn)染成功。見圖2A。

轉(zhuǎn)染后0 h，miR-20b模擬物組OD 450 nm值為（0.330±0.030），陰性對照組為（0.350±0.040），未轉(zhuǎn)染對照組為（0.390±0.030），3組OD 450 nm值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.471，P=0.164）。

圖1 m iR-20b在卵巢癌及正常卵巢上皮細胞系中的表達

轉(zhuǎn)染后24 h，miR-20b模擬物組OD 450 nm值為（0.430±0.080），陰性對照組為（0.750±0.100），未轉(zhuǎn)染對照組為（0.700±0.100），3組OD 450 nm值有統(tǒng)計學(xué)差異（F=10.102，P=0.012）；MiR-20b 模擬物組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.320，P=0.000），與未轉(zhuǎn)染對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.270，P=0.000）。

轉(zhuǎn)染后48 h，miR-20b模擬物組OD 450 nm值為（0.720±0.090），陰性對照組為（1.670±0.250），未轉(zhuǎn)染對照組為（1.570±0.200），3組OD 450 nm值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=22.175，P=0.001）；MiR-20b模擬物組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.950，P=0.000），與未轉(zhuǎn)染對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.850，P=0.000）。

轉(zhuǎn)染后72 h，miR-20b模擬物組OD 450 nm值為（1.230±0.150），陰性對照組為（2.430±0.190），未轉(zhuǎn)染對照組為（2.5±0.1），3組OD 450 nm值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=66.862，P=0.000）；MiR-20b模擬物組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-1.200，P=0.000），與未轉(zhuǎn)染對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-1.270，P=0.000）。

圖2 m iR-20b過表達抑制SKO V3細胞增殖

轉(zhuǎn)染后96 h，miR-20b模擬物組OD 450 nm值為（1.720±0.200），陰性對照組為（3.780±0.320），未轉(zhuǎn)染對照組為（4.080±0.270），3組OD 450 nm值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=68.996，P=0.000），miR-20b模擬物組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.060，P=0.000）；與未轉(zhuǎn)染對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.360，P=0.000）。miR-20b模擬物組在轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h OD450 nm值低于陰性對照組和未轉(zhuǎn)染對照組。見圖2B。

2.3 m iR-20b過表達促進細胞凋亡

流式細胞術(shù)測細胞凋亡率，示miR-20b模擬物組的凋亡率為（20.150±1.200）%，陰性對照組為（4.000±0.700）%，未轉(zhuǎn)染對照組為（2.800±0.500）%，3組凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=387.581，P=0.000），miR-20b模擬物組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.150，P=0.000），與未轉(zhuǎn)染對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.350，P=0.000），miR-20b模擬物組凋亡率高于陰性對照組和未轉(zhuǎn)染對照組。見圖3。

2.4 m iR-20b抑制增殖并促進凋亡的機制

Western blot檢測了PTEN蛋白和與凋亡發(fā)生相關(guān)的蛋白 Cleaved PARP，miR-20b模擬物組PTEN蛋白相對表達量為（0.370±0.030），陰性對照組為1.000，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-36.370，P=0.000），miR-20b模擬物組PTEN蛋白相對表達量低于陰性對照組；miR-20b模擬物組Cleaved PARP蛋白相對表達量為（3.500±0.120），陰性對照組為1.000，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=36.080，P=0.000），miR-20b模擬物組Cleaved PARP蛋白相對表達量高于陰性對照組。見圖4。

圖3 m iR-20b過表達促進SKO V3細胞凋亡

圖4 m iR-20b下調(diào)PTEN、上調(diào)PAR P的表達

3 討論

卵巢癌是起源于卵巢上皮的惡性腫瘤，依據(jù)病理類型可分為卵巢肉瘤和漿液性卵巢癌，96%～99%為漿液性卵巢癌，先手術(shù)再化療比單獨手術(shù)或者單獨化療效果更佳，但卵巢癌預(yù)后仍較差，據(jù)報道Ⅳ期卵巢癌5年生存率僅20.3%[11]。在腫瘤演進的過程中，會涉及到一系列重要的分子或信號通路變異，包括 EMT[12]、miRNA[13]、LncRNA[14]、P21[15]、P53[16]等分子。

miRNA是含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體，經(jīng)過Dicer加工之后一類非編碼的小RNA分子（18～25個核苷酸），通過與靶基因的種子區(qū)序列相互配對抑制其基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯行使其功能，廣泛存于真核生物體中[17]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，多種miRNA發(fā)生表達異常，并廣泛參與了增殖、凋亡、自噬、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程。比如：miR-124被報道在結(jié)腸癌細胞系中下調(diào)表達，通過下調(diào)ROCK1蛋白表達，miR-124抑制結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。Wnt/b-catenin信號通路激活miR-30a-5p并通過抑制NCAM表達促進膠質(zhì)瘤細胞侵襲[19]。miR-20b在腫瘤中所起的作用不盡相同，在骨肉瘤組織和細胞系中，miR-20b較正常骨組織和細胞系下調(diào)表達，miR-20b可靶向調(diào)節(jié)HIF-1a的表達，上調(diào)miR-20b可抑制HIF-1a的表達，下調(diào)VEGF信號通路蛋白，抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲，是個抑癌基因[6]。在膀胱癌中，miR-20b在膀胱癌細胞系中低表達，過表達miR-20b抑制膀胱癌細胞系EJ的增殖，通過下調(diào)cyclin D1，CDK2和CDK6的表達，誘導(dǎo)G1細胞周期阻滯，并抑制膀胱癌細胞遷移和侵襲，起抑癌基因的作用[7]。在甲狀腺乳頭狀癌中，miR-20b低表達，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，上調(diào)miR-20b表達通過抑制MAPK/ERK信號通路抑制甲狀腺K1和TPC-1細胞系活動性和遷移侵襲能力，起抑癌基因的作用[20]。與之相反，在乳腺癌中，miR-20b在乳腺癌組織和細胞中上調(diào)表達，且miR-20b可與PTEN 3"UTR靶向結(jié)合，上調(diào)miR-20b可促進乳腺癌細胞增殖和克隆形成，起促癌基因的作用[8]。miR-20b在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的病人中的表達水平較無腦轉(zhuǎn)移的病人要高[21]，在胃癌中，miR-20b在胃癌組織中高表達，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征相關(guān)，起促癌基因的作用[10]。在食管癌中，miR-20b高表達于食管癌組織和細胞，且通過靶向結(jié)合PTEN 3'-UTR而促進食管癌增殖、遷移和侵襲，為促癌基因[9]。在肝癌中，miR20b上調(diào)表達，且與肝癌預(yù)后差相關(guān)[22]。

在本研究中，miR-20b在卵巢癌細胞系A(chǔ)431、SKOV3的相對表達量較正常卵巢上皮細胞系降低，通過對SKOV3細胞系外源性轉(zhuǎn)染miR-20b mimics后，發(fā)現(xiàn)miR-20b模擬物組的miR-20b相對表達量較未轉(zhuǎn)染對照組和陰性對照組升高，表示轉(zhuǎn)染成功；進一步采用CCK-8法測定3組細胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)miR-20b模擬物組OD450 nm值低于對照組和未轉(zhuǎn)染對照組，提示miR-20b可抑制SKOV3細胞增殖。對miR-20b模擬物組、未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組行流式細胞術(shù)測定凋亡，發(fā)現(xiàn)miR-20b組凋亡率高于未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組，表明miR-20b可誘導(dǎo)SKOV3細胞凋亡，表明在卵巢癌中，miR-20b起抑癌基因的作用，這與骨肉瘤、膀胱癌、甲狀腺癌中的結(jié)果一致，而與乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌中所起的作用相反。

PTEN分子是被廣泛研究的抑癌分子，其在多種腫瘤中缺乏表達[23]，其通過對磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸肌醇（PIP3）脫磷酸化負調(diào)控PI3K/Akt信號通路，最終參與調(diào)控細胞周期、增殖、凋亡、遷移和侵襲等腫瘤生物學(xué)過程[24]。LI等[25]報道m(xù)iR-20b可靶向調(diào)節(jié)PTEN表達，且miR-20b上調(diào)可抑制PTEN蛋白的表達，進而促進肝癌腫瘤發(fā)生。ZHU等[26]在結(jié)腸癌中也發(fā)現(xiàn)miR-20b可靶向下調(diào)PTEN的表達，在乳腺癌中，ZHOU等[8]通過熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)miR-20b與PTEN靶向結(jié)合，并通過下調(diào)PTEN表達促進乳腺癌細胞系ZR-75-30和MCF-7增殖和克隆形成。在本研究中，miR-20b模擬物組PTEN相對表達量較陰性對照組低，miR-20b抑制增殖的機制可能與miR-20b下調(diào)PTEN表達有關(guān)。

細胞凋亡的通路主要包括內(nèi)源性途徑和外源性途徑，外源性途徑由腫瘤壞死因子受體1、Fas/CD95、DR3和TRAIL-R1等死亡受體介導(dǎo)，進而激活caspase-3、8誘導(dǎo)凋亡[20]；內(nèi)源性途徑，即線粒體途徑，主要通過激活 caspase-3、8、9，PARP，并將DNA裂解為180～200 bp大小的片段，進而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[27]，PARP剪切被認(rèn)為是細胞凋亡的一個重要指標(biāo)，被認(rèn)為是Caspase 3激活的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-20b模擬物組裂解型PARP表達量高于陰性對照組，提示miR-20b誘導(dǎo)細胞凋亡的機制可能與PARP升高有關(guān)，為內(nèi)源性通路所介導(dǎo)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-20b在卵巢癌細胞系中低表達，且上調(diào)miR-20b的表達可抑制卵巢癌細胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡，其機制可能與PTEN下調(diào)、PARP上調(diào)有關(guān)，這更深入的闡明了卵巢的發(fā)病機制，可能成為卵巢癌治療的新治療靶點，值得進一步研究。

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（張蕾 編輯）

Expression of miR-20b in ovarian carcinoma cell line and its effect on proliferation and apoptosis*

Hui-jun Jiang,Yi He
(Department of Gynecology and Obstetrics,Wuhan No.1 Hospital,Wuhai,Hubei 430022,China)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-20b in ovarian carcinoma cell line and its effect on proliferation and apoptosis.MethodsThe relative expression levels of miR-20b in A431,SKOV3 and Hose cell lines were measured by qRT-PCR.The SKOV3 cell line was divided into non-transfection control group without transfection,negative control group transfected with miR-20b scramble and miR-20b mimics group transfected with miR-20b mimics by Lipofectamine 2000.The proliferation ability was tested by CCK8 assay.The apoptosis rate was measured by flow cytometry.The expression levels of phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10(PTEN)and cleaved poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)were measured by Western blot.ResultsThe expression levels of miR-20b in the A431 and SKOV3 cell lines were significantly lower than that in the Hose cell line.The value of OD 450 nm in the miR-20b mimics group was significantly lower than that in the non-transfection control and negative control groups at 0,24,48,72 and 96 h.The apoptosis rate of the miR-20b mimics group was significantly higher than that of the negative control and non-transfection control groups.Compared to the negative control group,the expression level of PTEN was down-regulated and the cleaved PARP was up-regulated in the miR-20b mimics group.ConclusionsmiR-20b inhibits proliferation and promotes apoptosis of ovarian carcinoma cells,the mechanism may be associated with down-regulation of PTEN and up-regulaton of cleaved PARP.

miR-20b;ovarian carcinoma cell;proliferation;apoptosis

R737.31

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.007

1005-8982（2017）13-0033-06

2016-12-10

武漢市衛(wèi)計委課題（No：WX15C32）

賀漪，E-mail：heyi879@126.com