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(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

HPLC法檢測生物硒醋及老陳醋乳酸和醋酸含量

王興華,劉菊,謝玉韜,宋佳,張帆,喬沈

(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

本文研究了利用HPLC法測定生物硒醋和老陳醋中乳酸和醋酸的含量,并對其測定條件進行優(yōu)化。應用以C18為色譜分析柱,檢測波長為215 nm,流動相為2.5% NH4H2PO4緩沖液,樣品稀釋度為30倍,流速為1.0 min/mL,柱溫為29 ℃,生物硒醋樣品的最佳pH=2.5,老陳醋的最佳pH為2.7時,可以較好的分離、檢測生物硒醋和老陳醋中乳酸和醋酸的含量,所有的檢測在4 min內完成。同時當其他分析條件一定,pH=2.7時,醋酸和乳酸標樣的回歸方程分別為y=484.23x-81.373,R2=0.9992、y=441.37x-68.321,R2=0.9979。當pH=2.5時,醋酸和乳酸標樣的回歸方程分別為y=484.61x+72.201,R2=0.9993、y=389.82x+30.432,R2=0.9991。該檢測方法重復性、準確度、精確度的相對標準偏差范圍為0.00%～1.07%,其中生物硒醋乳酸和醋酸標品的加標回收率分別為100.00%～110.00%、99.00%～100.83%,老陳醋乳酸和醋酸標品的加標回收率分別為100.00%～101.00%、100.00%～110.00%。此方法重復性好、準確性和精確性好,檢測時間短?？梢詰糜谏镂缀屠详惔椎腍PLC法有機酸的定量分析。

HPLC法,生物硒醋,老陳醋,乳酸,醋酸

我國食醋具有悠久的釀造歷史,其味酸、醇厚、柔和,是大眾生活中的一種重要調味品。食醋中含有一定量的礦物質和維生素和氨基酸[1]。食醋中含有豐富的有機酸,其中有乳酸、醋酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸等,但含量最高的是醋酸和乳酸,也是影響食醋酸味和品質最重要的兩種有機酸。生物硒醋是在傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工藝的基礎上,加入銀杏果、黑苦蕎麥、甘草等具有保健功效的物質,是新型保健食醋的代表之一。老陳醋是山西省一種特色的調味料[2],其顏色黑亮透紫,醋香柔酸,是純糧釀造醋的代表[3]。目前測定有機酸的方法主要有離子色譜法、氣相色譜法、堿式滴定法、比色法等[4]。其中離子色譜法由于色譜柱對樣品蛋白質的含量有嚴格的限制[5-6],故不適用于食醋中有機酸的測定;氣相色譜法由于有機酸的沸點較高,且食醋中揮發(fā)性成分較多,前處理不易控制;堿式滴定法和比色法由于測定過程誤差較大,準確性較差。HPLC法是目前測定有機酸最常見的方法[7-10],由于原料使用和制作工藝的差異,采用以前報道的測定方法,應用HPLC法無法較好的分離生物硒醋、老陳醋中的醋酸和乳酸。

因此,建立定量分析生物硒醋和老陳醋中的有機酸的方法是十分必要的。本文研究了食醋樣品經過稀釋、萃取等預處理過程后,對HPLC法測定生物硒醋和老陳醋中醋酸和乳酸的條件進行優(yōu)化研究,以期為生物硒醋和老陳醋的釀造工藝、食用品質和藥用價值提供一定的理論參考和依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

老陳醋 山西太原市清徐第四醋廠;生物硒醋 山西銀杏食品科技開發(fā)有限公司;磷酸二氫銨 分析純,北京化工廠;磷酸 分析純,成都市科龍化工試劑廠;甲醇 色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司;醋酸標品、乳酸標品 色譜純,Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

STARTER2100型pH計 奧豪斯儀器(上海)儀器有限公司;JA1203N型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司;高效液相色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司;Sep-PakC18固相萃取小柱 天津毫津科技有限公司;SC-3616型離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;移液器 德國Eppendorf股份公司。

1.2實驗方法

1.2.1 食醋樣品的處理 吸取1 mL生物硒醋和老陳醋分別于10個1 mL的離心管中,以10000 r/min的速度離心20 min后[11-13],吸取各離心管上清液0.6 mL,得生物硒醋和老陳醋上清液總量各6 mL保存于4 ℃的冰箱中備用。

制備的生物硒醋樣品和老陳醋樣品,用Sep-parkC18固相萃取小柱(250 mg/3 mL)進行處理(萃取小柱先用3 mL甲醇活化,然后用適量超純水進行平衡)[14],使樣品中的色素吸附完全,再將呈無色、透明的樣品用針筒式水膜(0.45 μm×0.13 mm)過濾,過濾的樣品進行相應梯度的稀釋后進入HPLC檢測。

1.2.2 HPLC法檢測條件的單因素實驗 色譜柱:Waters Atlantis T3(150 mm×4.6 mm,5 μm)。

其他條件的選擇:在樣品稀釋度為20倍,進樣量為20 μL,流動相為2.0% NH4H2PO4,流動相pH為2.8,流速為0.8 min/mL,柱溫為28 ℃的條件下[15],研究不同波長(210、215 nm)對醋樣乳酸和醋酸的分離及最大吸收峰的影響;在檢測波長為215 nm,其它分析條件不變,比較6種流動相NaH2PO4、KH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4,對醋樣乳酸和醋酸的分離情況;在檢測波長為215 nm,其它分析條件不變,研究樣品的不同稀釋度(1、10、20、30、40、50倍)對醋樣乳酸和醋酸這兩種有機酸的分離情況;在檢測波長為215 nm,其它分析條件不變,研究不同流動相濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)對醋樣乳酸和醋酸這兩種有機酸的分離情況;在檢測波長為215 nm,其它分析條件不變,研究不同pH(2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0)對醋樣乳酸和醋酸這兩種有機酸的分離情況;在檢測波長為215 nm,其它分析條件不變,研究不同流速(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 min/mL)對醋樣乳酸和醋酸這兩種有機酸的分離情況;在檢測波長為215 nm,其它分析條件不變,研究不同柱溫(25、26、27、28、29、30 ℃)對醋樣乳酸和醋酸這兩種有機酸的分離情況[16-18]。

1.2.3 標準曲線的繪制 分別準確稱取40 mg的乳酸標準品、50 mg醋酸標準品于5 mL的離心管中,用移液器精確移取超純水,使標準品稀釋到相應刻度,即濃度分別為8、10 mg/mL作為母液。精確移取乳酸、醋酸母液各50、100、150、200、250、300 μL至1 mL離心管中,用2.5% NH4H2PO4分別將混合酸標準樣品稀釋到相應刻度,即乳酸的濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL,醋酸的濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL。在檢測波長為215 nm,流動相為2.5% NH4H2PO4緩沖液,樣品稀釋度為30倍,流速為1.0 min/mL,柱溫為29 ℃,pH=2.5和pH=2.7的最佳分析條件下分別進樣,進樣量為20 μL,并以標品濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3數據處理

應用Origin軟件計算其HPLC分析法的重復性、準確度、精確度、回收率等的相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1檢測波長的確定

檢測結果發(fā)現,當波長為215 nm時,乳酸和醋酸兩種有機酸在此處均有最大的吸收峰,波峰穩(wěn)定且重復性好,不受流動相中其它物質的干擾。所以確定本研究檢測波長為215 nm。

2.2流動相的選擇

比較六種磷酸鹽緩沖液為流動相的目標物分離情況,結果發(fā)現,六種磷酸鹽緩沖液對生物硒醋和老陳醋乳酸和醋酸的分離有一定的差異。KH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4、(NH4)2HPO4這四種磷酸鹽分離效果不佳,乳酸和醋酸這兩個主峰沒有完全分開,出現交叉峰和拖尾峰的現象。NaH2PO4和NH4H2PO4這兩種磷酸鹽作為流動相時分離效果都比較好,NaH2PO4比NH4H2PO4出峰時間長,乳酸和醋酸分離需要的時間長。NH4H2PO4緩沖液作為流動相時,分離效果好且分析時間短,所以NH4H2PO4選定為流動相。

2.3樣品稀釋度的選擇

生物硒醋和老陳醋中有機酸含量比較多,尤其是乳酸和醋酸含量豐富,且樣品食醋的成分復雜。故圖譜中出峰雜而多,乳酸和醋酸峰值高且分離效果不好,因受其他物質的影響而不好判斷。由于本文只研究樣品中具有代表性的乳酸和醋酸,此波長下,樣品中的其它物質均不予研究,所以考慮稀釋食醋樣品,可以讓樣品中的醋酸和乳酸得到稀釋,峰值相應降低,有些含量低的物質可能由于稀釋而不出峰或峰值更低,從而可以降低215 nm檢測波長處圖譜的復雜度,簡明分析主要峰。實驗結果發(fā)現當稀釋度達到30倍時,生物硒醋和老陳醋的乳酸和醋酸分離效果好,不受其它雜峰的影響。故選定稀釋度為30倍。

2.4流動相濃度的選擇

流動相濃度的高低將會影響色譜的分離情況,濃度過高,將會影響到流動柱的靈敏度和壽命,降低組分分析的準確性。濃度過低,可能影響乳酸和醋酸的分離情況,出現拖尾等分離效果差的現象。本實驗中NH4H2PO4濃度為2.0%、2.5%和3%的分離效果比較好,但2.5%的濃度出峰效果最好且峰值最高。綜合考慮出峰和離子強度對柱子的影響,選用NH4H2PO4緩沖液的濃度為2.5%。

2.5流動相pH的選擇

當溶液的pH=3.0,乳酸和醋酸不能很好的分開,逐漸降低磷酸緩沖液的pH,當溶液pH=2.7,老陳醋的乳酸和醋酸可以很好的分開,且分離效果好,但生物硒醋的乳酸和醋酸分離效果不甚好。逐漸降低pH,當pH=2.5時,生物硒醋的乳酸和醋酸的分離效果好,但老陳醋的卻不佳。故老陳醋的分析pH選擇為2.7,生物硒醋的pH選擇為2.5。

2.6流速的選擇

當流速0.5 min/mL時,兩種食醋的乳酸和醋酸保留時間過長,且分離效果不好。逐漸提高流速時,色譜中乳酸和醋酸的分離效果相差不大,流速越高,保留時間越短。由于高效液相色譜儀最高流速不能超過1.0 min/mL,故生物硒醋和老陳醋的流速選擇為1.0 min/mL。

2.7柱溫的選擇

色譜的柱溫是一個重要的操作變數,直接影響到層析柱的選擇性、分離效果、檢測器的靈敏度和穩(wěn)定性。溫度過高,會導致分離效果和色譜柱使用壽命的下降。溫度過低,流動相的粘度增加,導致傳遞效率降低。當柱溫為25 ℃時,生物硒醋和老陳醋的乳酸和醋酸沒有完全分開。隨著柱溫的升高,分離效果愈來愈好。當溫度為29 ℃和30 ℃時,兩種食醋的乳酸和醋酸的分離效果最佳。但考慮到溫度高會影響柱子的壽命和靈敏性。故綜合考慮,選用色譜柱的溫度為29 ℃。

2.8標準曲線方程

當檢測波長為215 nm,流動相為2.5% NH4H2PO4緩沖液,流速為1.0 min/mL,柱溫為29 ℃,pH=2.7時,得到醋酸和乳酸的線性方程分別為y=484.23x-81.373(R2=0.9992),y=441.37x-68.321(R2=0.9979)。當檢測波長為215 nm,流動相為2.5% NH4H2PO4緩沖液,流速為1.0 min/mL,柱溫為29 ℃,pH=2.5時,醋酸和乳酸線性方程分別為y=484.61x+72.201(R2=0.9993),y=389.82x+30.432(R2=0.9991)。

2.9重復性

取生物硒醋和老陳醋樣品各6份,預處理后分別在最佳條件下分析檢測,即生物硒醋在以C18為色譜分析柱,檢測波長為215 nm,流動相為2.5% NH4H2PO4緩沖液,樣品稀釋度為30倍,流速為1.0 min/mL,柱溫為29 ℃,pH=2.5的最佳分析條件下,而老陳醋在以C18為色譜分析柱,檢測波長為215 nm,流動相為2.5% NH4H2PO4緩沖液,樣品稀釋度為30倍,流速為1.0 min/mL,柱溫為29 ℃,pH=2.7的最佳分析條件下進樣,進行HPLC法檢測,對其樣品中乳酸和醋酸進行6次平行測定,并計算其相對標準偏差RSD。

表1 重復性實驗結果Table 1 The results of repetition test

由表1結果可看出,應用HPLC法平行測定生物硒醋和老陳醋中的乳酸、醋酸含量時,其相對標準偏差范圍為0.50%～1.07%,故該方法測定生物硒醋和老陳醋中的乳酸、醋酸含量重復性好,方法可靠。

2.10精密度

對乳酸和醋酸標準品(濃度分別為1.20、1.50 g/100 mL)進行連續(xù)5次HPLC分析,分析條件設置同2.9,記錄每次進樣的保留時間和峰面積,并計算標樣乳酸和醋酸在流動相pH為2.7和pH為2.5條件下的相對標準偏差RSD。

表2 精密度實驗結果Table 2 The results of precision test

由表2可得出,當檢測波長為215 nm,流動相為2.5% NH4H2PO4緩沖液,樣品稀釋度為30倍,流速為1.0 min/mL,柱溫為29 ℃,pH為2.5和2.7時,乳酸、醋酸標準品檢測的相對標準偏差范圍為0.00%～0.02%,故醋酸、乳酸標品的精密度較高。

2.11穩(wěn)定性

分別取生物硒醋和老陳醋1 mL,經過預處理過程后,分別在制樣不同時間后(1、2、3、4、5 d),在兩種食醋的最佳分析條件下對其分別進行HPLC分析,并計算兩種醋樣的乳酸和醋酸的相對標準偏差RSD。

表3 穩(wěn)定性實驗結果Table 3 The results of stability test

表4 生物硒醋樣品中乳酸、醋酸的加標回收率Table 4 The recovery rate of lactic acid and acetic acid in the samples of biological selenium vinegar

表5 老陳醋樣品乳酸、醋酸的加標回收率Table 5 The recovery rate of lactic acid and acetic acid in the samples of vinegar

由表3可看出,在一定時間內,隨著時間的延長,生物硒醋和老陳醋中乳酸、醋酸的含量相對穩(wěn)定,其相對標準偏差范圍為0.00%～0.06%,故其測定方法具有較高的穩(wěn)定性。

2.12加標回收率

取生物硒醋和老陳醋各2份,每份1 mL,其中一份作為本液,另一份加入1 mL乳酸和醋酸的混合酸標準品(其中混合酸標準品的乳酸和醋酸濃度依次為1.00、1.10、1.20 g/100 mL),經過預處理后分別在兩種食醋的最佳分析條件下對其進行HPLC分析,并計算其相對標準偏差RSD。

由表4和表5可看出,生物硒醋乳酸和醋酸的加標平均回收率分別為(103.33%±5.77%)、(99.94%±0.92%),老陳醋乳酸和醋酸的加標平均回收率分別為(100.61%±0.54%)、(103.94%±5.33%)。故該分析測定方法具有較高的準確度。

2.13兩種食醋樣品的高效液相色譜圖分析

經過各單因素的條件優(yōu)化后,得到HPLC法檢測生物硒醋中乳酸和醋酸含量的最佳分析條件為:以C18為色譜分析柱,檢測波長為215 nm,流動相為2.5% NH4H2PO4緩沖液,樣品稀釋度為30倍,流速為1.0 min/mL,柱溫為29 ℃,pH=2.5。而HPLC法分析檢測老陳醋中乳酸和醋酸含量的最佳條件為:以C18為色譜分析柱,檢測波長為215 nm,流動相為2.5% NH4H2PO4緩沖液,樣品稀釋度為30倍,流速為1.0 min/mL,柱溫為29 ℃,pH=2.7。兩種醋樣乳酸和醋酸的檢測均在4 min內完成。采用優(yōu)化后的分析條件,得到兩種食醋的高效液相色譜圖,如圖1～圖4所示。其中圖1和圖2是在上述HPLC法分析檢測生物硒醋中乳酸和醋酸含量的最佳條件下得到的分析圖譜,圖3和圖4是在上述HPLC法分析檢測老陳醋中乳酸和醋酸含量的最佳條件下得到的分析圖譜,由圖1和圖3可看出,主峰1和主峰2分離完全,不受其它物質的影響且出峰對稱穩(wěn)定,故其乳酸、醋酸的定量分析不受其它物質的干擾,方法準確性高。

圖1 老陳醋樣品有機酸HPLC分析圖譜(pH=2.7)Fig.1 HPLC analysis samples of organic acid of vinegar samples(pH=2.7)注:1代表乳酸峰;2代表醋酸峰;圖2～圖4同。

圖2 標準品的有機酸HPLC分析圖譜(pH=2.7)Fig.2 HPLC analysis samples of organic acid of standard samples(pH=2.7)

圖3 生物硒醋樣品有機酸HPLC分析圖譜(pH=2.5)Fig.3 HPLC analysis samples of organic acids of biological selenium vinegar(pH=2.5)

圖4 標準品的有機酸HPLC分析圖譜(pH=2.5)Fig.4 HPLC analysis samples of organic acid of standard samples(pH=2.5)

3 結論

對生物硒醋和老陳醋的乳酸和醋酸進行HPLC分析,且對其分析條件進行優(yōu)化,獲得最佳優(yōu)化條件為:以C18為色譜分析柱,檢測波長為215 nm,流動相為2.5% NH4H2PO4緩沖液,樣品稀釋度為30倍,流速為1.0 min/mL,柱溫為29 ℃,兩種食醋樣品分析條件唯一不同的是:生物硒醋樣品的最佳pH=2.5,而老陳醋的最佳pH為2.7,所有的檢測在4 min內完成。當其他分析條件一定,pH=2.7時,醋酸和乳酸標樣的回歸方程分別為y=484.23x-81.373(R2=0.9992),y=441.37x-68.321(R2=0.9979)。當pH=2.5時,醋酸和乳酸標樣的回歸方程分別為y=484.61x+72.201(R2=0.9993),y=389.82x+30.432(R2=0.9991)。使用該方法測定的目標峰對稱且穩(wěn)定性好,一定的稀釋倍數可以降低主峰面積過高引起的分析難度,降低其它雜質的干擾,且靈敏度和回收率高。該方法簡單、準確性好、精密度高、重復性好、檢測時間短,可以應用于生物硒醋和老陳醋的HPLC法的定量分析,準確測定食醋中乳酸和醋酸的含量,為生物硒醋和老陳醋的質量標準提供一定的依據和參考數據。

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DeterminationoflacticacidandaceticacidcontentinbiologicalseleniumvinegarandvinegarbyHPLCmethod

WANGXing-hua,LIUJu,XIEYu-tao,SONGJia,ZHANGFan,QIAOShen

(School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

Determination of lactic acid and acetic acid of biological selenium vinegar and vinegar by using HPLC method were studied. C18as chromatographic analysis column,detection wavelength was 215 nm,the mobile phase was 2.5% NH4H2PO4buffer,sample dilution was 30 times,the flow rate was 1.0 min/mL,the column temperature was 29 ℃,the best pH of the biological selenium vinegar was 2.5,while the best pH of the vinegar was 2.7,which could better separation and determination of lactic acid and acetic acid of biological selenium vinegar and vinegar,all testing completed within 4 min. When other analysis conditions were certain,pH was 2.5,the regression equation of acetic acid and lactic acid standard were y=484.23x-81.373,R2=0.9992,y=441.37x-68.321,R2=0.9979,respectively. When pH was 2.5,the regression equations of acetic acid and lactic acid standard were y=484.61x+72.201,R2=0.9993,y=389.82x+30.432,R2=0.9991,respectively. The relative standard deviation of this method was 0.00%～1.07%,standard addition recoveries of biological selenium vinegar lactic acid and acetic acid standard were 100.00%～110.00%,99.00%～100.83% respectively,standard addition recoveries of vinegar lactic acid and acetic acid were 100.00%～101.00%,100.00%～110.00% respectively. The method has good repeatability,accuracy and precision,short detection time,therefore it could be applied in biological selenium vinegar and vinegar.

HPLC method;biological selenium vinegar;vinegar;lactic acid;acetic acid

2017-03-01

王興華(1958-)，男，大學本科，副教授，研究方向：微生物發(fā)酵及食品安全，E-mail：xhwang@sxu.edu.cn。

山西省科技廳(20140311021-5)；富硒醋生產工藝研究(20130201)。

TS207.3

:A

:1002-0306(2017)16-0247-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.047