陳永久，陳定標(biāo)，蔣日進(jìn)

（1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

DNA條形碼在浙江沿海浮游魚卵和仔魚分類鑒定中的應(yīng)用

陳永久1，陳定標(biāo)1，蔣日進(jìn)2

（1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

本研究的目的是對魚卵和仔魚進(jìn)行分類鑒定，了解浙江沿海水域產(chǎn)卵區(qū)的物種組成。樣品收集于2014年5月-2015年11月，在浙江沿海水域租用漁船采用大型浮游生物網(wǎng)（網(wǎng)長280 cm、網(wǎng)口內(nèi)徑80 cm、網(wǎng)口面積0.5 m2、網(wǎng)目0.5 mm、拖速2 n mile/h、拖網(wǎng)時(shí)間10 min）通過分析CO I DNA序列，結(jié)果顯示從24個(gè)樣本一共鑒定出10個(gè)魚類物種，分屬于7個(gè)科，即鳀魚、小黃魚、龍頭魚、康氏小公魚、矛尾刺蝦虎魚、褐菖鲉和沙帶魚仔魚，及鳳鱭、藍(lán)點(diǎn)馬鮫、黃姑魚魚卵。種內(nèi)平均K-2-P遺傳距離0.47%，科內(nèi)屬間平均遺傳距離21.7%，目內(nèi)科間平均遺傳距離24.6%，表明種內(nèi)距離遠(yuǎn)小于種間距離，與絕大多數(shù)條形碼研究結(jié)果一致。研究結(jié)果表明，DNA條形碼技術(shù)是傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)強(qiáng)有力的補(bǔ)充。它是一種準(zhǔn)確的，規(guī)范化的，有效的物種鑒定工具，在魚類生物多樣性研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

魚卵；仔稚魚；分類；DNA條形碼；CO I；生物多樣性

眾所周知，對魚卵、仔魚的保護(hù)是實(shí)現(xiàn)漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)利用的根本[1]。魚類資源的世代強(qiáng)弱主要取決于魚類早期生活史階段的存活率。它的數(shù)量直接決定了成魚資源的補(bǔ)充量。此外，魚卵和仔魚在生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位，對實(shí)現(xiàn)生態(tài)平衡具有重要意義[2]。通過對魚類浮游生物群落生態(tài)的研究，可以有效地評估漁業(yè)資源的現(xiàn)狀，確定魚類產(chǎn)卵場和索餌場，了解魚類浮游生物的補(bǔ)充機(jī)制，以及對環(huán)境的適應(yīng)運(yùn)轉(zhuǎn)等。

盡管魚類浮游生物具有重要的研究價(jià)值和生態(tài)地位，但是對其進(jìn)行物種鑒定存在瓶頸。目前已鑒別的成魚種類超過28 700余種，而能夠鑒別的仔稚魚僅僅占成魚種類的1/10[3]。過去對魚類浮游生物進(jìn)行種類組成調(diào)查時(shí)一般采用形態(tài)學(xué)方法。但是由于海洋魚類魚卵發(fā)育變化復(fù)雜，不同種間形態(tài)差異不明顯，仔稚魚生長期形態(tài)變化快，僅僅通過形態(tài)學(xué)鑒定魚類浮游生物是不適宜的[4-6]。KO et al[7]通過電鏡掃描的方法在臺灣五個(gè)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立對魚卵和仔魚進(jìn)行鑒定。結(jié)果鑒定到科的準(zhǔn)確率為80.1%，鑒定到屬的準(zhǔn)確率為41.1%，鑒定到種的準(zhǔn)確率僅為13.5%。也有學(xué)者也嘗試過各種其他方法來鑒定魚卵和仔魚，例如單克隆抗體免疫染色技術(shù)[8]。這種方法不需要提取DNA，而且可以一次性鑒定大批魚卵。但是它的成本很高。其他一些學(xué)者利用計(jì)算機(jī)科學(xué)輔助鑒定魚卵和仔魚[9-10]。這種方法適宜區(qū)分已知物種的大批魚卵和仔魚，但是對于多種魚卵鑒定，需要提前把鑒別特征輸入數(shù)據(jù)庫。HEBERT et al[11]第一次提出利用線粒體DNA（mtDNA）特定編碼區(qū)域進(jìn)行物種分類，并期望賦予所有生物條形碼。此后，國內(nèi)外許多專家學(xué)者已經(jīng)證明了利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行海洋魚類鑒別具有很高可信度[12]，已經(jīng)成為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定強(qiáng)有力的補(bǔ)充。因?yàn)閙tDNA結(jié)構(gòu)簡單，嚴(yán)格母系遺傳，進(jìn)化速率比核基因快[13]。其中細(xì)胞色素氧化酶第一亞基（CO I）基因即便在最初的發(fā)育階段，在魚卵中也有大量拷貝，作為魚卵和仔魚鑒定的分子標(biāo)記是較合適的。因此通過DNA條形碼技術(shù)實(shí)現(xiàn)魚卵仔稚魚的快速和準(zhǔn)確鑒定在魚類浮游生物多樣性研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和DNA條形碼技術(shù)鑒定魚卵和仔稚魚。首先通過形態(tài)學(xué)方法將魚卵和仔稚魚鑒定到科或者屬的水平；再分析CO I DNA序列鑒定到種的水平；最后對樣本、形態(tài)及序列建立數(shù)據(jù)庫。為下一步的魚類生態(tài)學(xué)，生物多樣性，及增殖放流等研究工作提供基礎(chǔ)資料，以期最終實(shí)現(xiàn)浙江沿海漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本文所采集的樣品均來自浙江近海海域，具體如圖1所示。采集時(shí)間為2014年5月-2015年11月。租用漁船，按照《海洋調(diào)查規(guī)范》采用大型浮游生物網(wǎng)（網(wǎng)長280 cm，網(wǎng)口內(nèi)徑80 cm，網(wǎng)口面積0.5 m2，網(wǎng)目0.5 mm）在海水表層進(jìn)行水平拖網(wǎng)調(diào)查，拖速2 n mile/h、每個(gè)調(diào)查站位拖10 min。所采集的仔魚和魚卵立即保存于95%的酒精中，帶回實(shí)驗(yàn)室后在顯微鏡下觀察，進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定，并拍照保存。

圖1 樣品采集站點(diǎn)分布區(qū)域Fig.1 Sample collection sites

1.2 總DNA提取

使用QIAGEN公司DNeasy謼RBlood&Tissue Kit試劑盒提取樣本DNA(具體操作方法參考QIAGEN的手冊)。每尾仔魚取整條或剪其尾部組織，稚魚剪其尾鰭或胸鰭破碎消化，經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定為同一類的魚卵取3～5顆進(jìn)行消化。

1.3 PCR測序

線粒體CO I DNA的PCR引物為FishF1（5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’）和FishR1（5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’）[12]。引物為上海生工生物有限公司合成。PCR擴(kuò)增在一個(gè)25 μL 的反應(yīng)體積中進(jìn)行，反應(yīng)體系為：ddH2O（8.5 μL）、2×Taq Mix（12.5 μL）、正向引物（1.0 μL、0.4 μM）、反向引物（1.0 μL、0.4 μM）、模板 DNA（2.0 μL）。PCR 擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃變性 40 s；52℃退火1 min；72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳15 min，電泳完成后利用凝膠電泳成像儀觀看圖像。PCR產(chǎn)物檢測陽性后送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，測序儀器為ABI-PRISM 3730。

1.4 序列分析

采用Sequencher 5.4(Gene Codes)和Clustal X2軟件將測序結(jié)果進(jìn)行編輯、人工校正和序列比對[14-15]。通過BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)，將所得DNA序列在Genbank中進(jìn)行相似性檢索，得出物種的分類地位。使用DnaSP 5.0軟件[16]計(jì)算單倍型數(shù)。采用MEGA 5.0軟件[17]計(jì)算序列Kimura雙參數(shù)（K-2-P）遺傳距離，再構(gòu)建鄰接法（NJ）聚類樹，并通過Bootstrap檢驗(yàn)聚類樹各分支的置信度。

2 結(jié)果

2.1 DNA條形碼鑒定結(jié)果

除去PCR擴(kuò)增失敗以及樣品保存不良等問題，本研究一共獲得了24條樣本序列，共22個(gè)單倍型，包括3個(gè)魚卵個(gè)體和21個(gè)仔魚個(gè)體，編號見表1。序列長度為633 bp，均沒有插入和缺失密碼子。通過與Genbank數(shù)據(jù)庫比對，如表1所示這24個(gè)樣品分屬7科10種，即鳀魚Engraulis japonicus仔魚、小黃魚Larimichthys polyactis稚魚、龍頭魚Harpadon nehereus仔魚、康氏小公魚Stolephorus commersonnii仔魚、矛尾刺蝦虎魚Acanthogobius hasta仔魚、褐菖鲉Sebastiscus marmoratus仔魚、沙帶魚Lepturacanthus savala仔魚，及鳳鱭Coilia mystus魚卵、藍(lán)點(diǎn)馬鮫Scomberomorus niphonius魚卵、黃姑魚Nibea albiflora魚卵。

2.2 基于CO I序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

基于CO I DNA序列構(gòu)建的魚卵、仔魚及其參考物種的聚類關(guān)系樹如圖2所示?？梢钥闯?，鳀魚聚為一支，最先與鳳鱭和康氏小公魚分享同一個(gè)祖先。小黃魚與黃姑魚在樣品中的親緣關(guān)系是最近的。此外，矛尾刺蝦虎魚聚為一支，其他種各自為一支。結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)構(gòu)建的演化關(guān)系基本相同。圖中每一個(gè)編號代表一個(gè)單倍型。這也證明了DNA條形碼技術(shù)在物種的分類鑒定研究上對于形態(tài)學(xué)是一個(gè)很好的補(bǔ)充。甚至能夠克服形態(tài)學(xué)鑒定上的一些缺點(diǎn)。

2.3 K-2-P遺傳距離分析

由表2可知，所有樣本，同種內(nèi)平均遺傳距離為0.47%，同一科內(nèi)屬間平均遺傳差異是21.7%，同一目內(nèi)科間平均遺傳差異是24.6%。根據(jù)相關(guān)報(bào)道[18]，絕大多數(shù)魚類的種內(nèi)K-2-P距離不會(huì)超過2%，而且遠(yuǎn)小于種間距離。這24個(gè)樣品與數(shù)據(jù)庫對比結(jié)果顯示，它們的相似度都在98%以上。因此我們認(rèn)為，這24個(gè)樣品都能夠準(zhǔn)確鑒定到種的水平。

圖2 基于線粒體CO I DNA序列的24個(gè)魚卵和幼仔魚樣本和參考物種的NJ聚類樹Fig.2 NJ tree of 24 samples of fish eggs and larvae and reference species inferred from mitochondrial CO I DNA sequences.

表1 浙江沿海魚卵、仔魚DNA序列比對及物種鑒定結(jié)果Tab.1 Results of DNA sequence comparison and species of fish eggs and larvae identified from the coastal sea of Zhejiang

表2 24個(gè)魚卵、仔魚樣本及參考物種序列在不同分類級別的K-2-P遺傳距離Tab.2 K-2-P distances for sequences of 24 samples of fish eggs and larvae,as well as reference species at different taxonomic levels

3 討論

3.1 利用DNA條形碼技術(shù)鑒定魚卵、仔魚的必要性

通過形態(tài)學(xué)建立的海洋魚類分類以及鑒定系統(tǒng)較為完善，但是在仔稚魚以及魚卵形態(tài)鑒定的研究成果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及成魚。研究表明，由于仔稚魚的形態(tài)與成魚的形態(tài)差異很大，親緣關(guān)系遠(yuǎn)的物種的形態(tài)差異反而比親緣關(guān)系近的要小，以及發(fā)育不完全等原因，形態(tài)學(xué)鑒定極為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且鑒定到種水平的準(zhǔn)確率不高。盡管不能否認(rèn)形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)作用，但要進(jìn)一步將魚卵、仔魚鑒定到種水平需要借助DNA條形碼技術(shù)。對魚卵、仔魚的鑒定僅僅依靠分子手段，只是屬于一種技術(shù)過程。必須在提取DNA之前對其進(jìn)行形態(tài)記錄并且拍照保存，然后采用DNA條形碼予以確認(rèn)。此外，從條形碼結(jié)果也可以反過來建立魚卵、仔魚的形態(tài)學(xué)鑒別特征，從而為傳統(tǒng)的魚卵、仔魚分類鑒定的發(fā)展提供幫助。

3.2 DNA條形碼技術(shù)的潛在問題

生物條形碼數(shù)據(jù)庫的完整性和準(zhǔn)確性也極大的影響DNA條形碼鑒定結(jié)果。如果數(shù)據(jù)庫中沒有該物種的成魚序列，我們就無法鑒定該魚卵或仔魚的種類。KO et al[7]在類似的報(bào)道中也表明，數(shù)據(jù)庫的不完整性是一個(gè)很嚴(yán)重的問題，特別是對一些非經(jīng)濟(jì)種類以及形態(tài)上很難區(qū)別的科或?qū)?，因?yàn)樗鼈兺鶝]有收錄到數(shù)據(jù)庫中。此外，錯(cuò)誤的數(shù)據(jù)也會(huì)誤導(dǎo)研究者。

基于我們的研究結(jié)果，不難看出，雖然利用COI單個(gè)基因能夠解決大多數(shù)海洋硬骨魚在種的水平的分類。然而，在高級階元上的分類仍存在一定缺陷。VALDEZ-MORENO et al[19]人對墨西哥尤卡坦半島附近海域的1 392個(gè)樣品的K2P遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)，屬內(nèi)平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的45倍左右，而科內(nèi)平均遺傳距離為屬內(nèi)的1.4倍，目內(nèi)遺傳距離僅為科內(nèi)的1.19倍。由此可見，海洋硬骨魚COI序列在高級階元的差異并不明顯。從表2可知，我們的結(jié)果有相似的趨勢。王中鐸等人也曾報(bào)道過，他們認(rèn)為，這是由于COI序列僅為600 bp左右，信息位點(diǎn)不足，在高級階元時(shí)堿基置換趨于飽和。導(dǎo)致海洋魚類COI序列在高級階元的分化明顯變慢[20]。而在高級階元的分類上，形態(tài)學(xué)已經(jīng)構(gòu)建了一個(gè)較為完善的系統(tǒng)。未來我們將通過新一代基因組測序技術(shù)以期獲得更多信息位點(diǎn)加以驗(yàn)證[21]。

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Application of DNA Barcoding in Classification and Identification of Fish Eggs and Larvae from Zhejiang Coastal Sea

CHEN Yong-jiu1,CHEN Ding-biao1,JIANG Ri-jin2
(1.School of Marine Science and Technology of Zhejiang Ocean University,National Engineering Research Center for Mariculture,Zhoushan 316022;2.Marine and Fishery Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316022,China)

This study aimed to identify and classify fish eggs and larvae and examine the species composition in spawning areas of Zhejiang Coastal waters.Samples were collected during May 2014-November 2015 using rental boats and plankton NETs(length 280 cm,internal diameter 80 cm,opening area 0.5 m2,mesh size 0.5 mm,trawl speed 2 n mile/h in the sea,trawling time 10 min).Via analysis of CO I DNA sequences,a total of ten species that belong in seven families were identified from 24 samples,i.e.the Japanese anchovy Engraulis japonicus,small yellow croaker Larimichthys polyactis,bummalo Harpadon nehereus,Commerson's anchovy Stolephorus commersonnii,yellowfin goby Acanthogobius hasta,sea ruffe Sebastiscus marmoratus,andLepturacanthus savala larvae,and Coilia mystus,Scomberomorus niphonius,and Nibea albiflora eggs.The average pairwise K-2-P distance is 0.47%within species,21.7%between genus within family,and 24.6%between families within order,indicating that the former is far smaller than the latter ones.Our results demonstrate that being a powerful complement to traditional morphology,DNA barcoding is an accurate,standardized,and efficient tool for species identification,and possesses a broad prospect of application in fish biodiversity research.

fish eggs;fish larvae;classification;DNA barcoding;CO I;biodiversity

S917.4

A

1008－830X(2017)03－0202－05

2016-12-01

浙江省海洋與漁業(yè)局項(xiàng)目（浙海漁計(jì)[2013]149號）”；浙江省海洋與漁業(yè)局項(xiàng)目（浙財(cái)農(nóng)[2014]277號）”

陳永久（1969-），男，浙江普陀人，博士，副教授，研究方向：海洋生物遺傳與進(jìn)化.E-mail:yongjiu.chen@gmail.com