文 強(qiáng)，唐明美，陳 玲，彭章麗，何月娟，唐正洪

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 呼吸二科,貴州 遵義 563099；2.山東省臨沂市人民醫(yī)院東醫(yī)療區(qū) 內(nèi)三科，山東 臨沂 276000)

臨床醫(yī)學(xué)研究

結(jié)核分枝桿菌包涵體蛋白R(shí)v3480c的克隆、表達(dá)與純化

文 強(qiáng)1，2，唐明美1，陳 玲1，彭章麗1，何月娟1，唐正洪1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 呼吸二科,貴州 遵義 563099；2.山東省臨沂市人民醫(yī)院東醫(yī)療區(qū) 內(nèi)三科，山東 臨沂 276000)

目的應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌重組抗原Rv3480c基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化。方法以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv基因組為模板，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，克隆Rv3480c基因片段，產(chǎn)物經(jīng)驗(yàn)證后與載體質(zhì)粒pET28a連接重組質(zhì)粒，將驗(yàn)證構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主E.coli BL21(DE3)菌體內(nèi)，經(jīng)異丙基半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，溶解包涵體，并通過(guò)多次低溫凍融、不同濃度尿素復(fù)性方法進(jìn)行包涵體蛋白質(zhì)的純化。結(jié)果擴(kuò)增后基因電泳試驗(yàn)及測(cè)序證實(shí)成功重組目的基因，用尿素溶液和磷酸鹽緩沖液(PBS)透析和純化重組蛋白，Western-Blot證實(shí)成功重組結(jié)核分枝桿菌抗原Rv3480c。結(jié)論應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)成功獲得結(jié)核分枝桿菌Rv3480c蛋白，為其結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，并為包涵體蛋白的純化提供了新的技術(shù)思路。

結(jié)核分枝桿菌；Rv3480c；包涵體；克隆；純化

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病,是全球范圍內(nèi)單一病原體引起人類死亡人數(shù)最多的疾病之一[1]。2015年，全球估計(jì)有1040萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病患者，結(jié)核病已成為導(dǎo)致20～59歲女性死亡的五大重要原因之一，也是威脅兒童健康的重要疾病，結(jié)核病更是HIV陽(yáng)性感染者死亡的主要?dú)⑹?，中?guó)是全球結(jié)核病患者比例居前六位的國(guó)家之一[2]。

面對(duì)如此嚴(yán)峻的結(jié)核病疫情，快速診斷和早期治療是控制結(jié)核病疫情的重要手段[3]。卡介菌純蛋白衍化物(PPD)皮試、結(jié)核菌涂片/培養(yǎng)檢查、γ干擾素釋放試驗(yàn)/TSPOT-TB等技術(shù)方法是目前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的重要手段。在這些常用的診斷方法中，PPD敏感性較高但特異性差，細(xì)菌學(xué)檢查是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但抗酸桿菌涂片陽(yáng)性率低，而傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)周期長(zhǎng)，延誤結(jié)核病早期診治，γ干擾素釋放試驗(yàn)/TSPOT-TB敏感性和特異性均高，但不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染，且價(jià)格昂貴[4]。同時(shí)，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)不能滿足肺外結(jié)核病的臨床應(yīng)用[5]，因此，我們急需要尋找一種快速、靈敏、特異性高且經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。

結(jié)核分枝桿菌感染人體后在機(jī)體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生針對(duì)結(jié)核菌菌體蛋白的特異性抗體。血清學(xué)診斷通過(guò)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原檢測(cè)患者血清中特異性抗體水平診斷結(jié)核病。目前國(guó)內(nèi)外已有多種結(jié)核分枝桿菌特異性抗原作為被檢靶標(biāo)，例如ESAT6[6]、M.tb81、M.tb8、M.tb48、DPEP (MPT32)等[7]，其靈敏度和特異度各研究報(bào)道不盡一致，仍需繼續(xù)篩選與結(jié)核相關(guān)的高特異性抗原，開(kāi)發(fā)更有診斷價(jià)值的血清學(xué)診斷方法。Rv3480c蛋白是本課題組利用蛋白芯片技術(shù)篩選出的特異性抗原之一，是結(jié)核菌分泌到菌體外的蛋白抗原，其結(jié)構(gòu)和功能尚未清楚，我們選取該蛋白進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，為進(jìn)一步的功能驗(yàn)證、結(jié)構(gòu)分析以及血清學(xué)診斷試劑盒的制作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人型結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv由貴州省疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng)。原核表達(dá)載體pET-28a購(gòu)于Novagen公司。DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司。EcoR I限制性內(nèi)切酶、Hind III限制性內(nèi)切酶及T4連接酶均購(gòu)于TaKaRa公司。Pfu高保真PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)于TransGen Biotech。質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、500bp DNA marker購(gòu)于天根生化科技有限公司。蛋白預(yù)染marker購(gòu)自Thermo公司。組氨酸(6x-His)抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，二抗購(gòu)自美國(guó)Abcm公司。

1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)購(gòu)于中國(guó)上海智誠(chéng)分析儀器公司。超聲細(xì)胞粉碎儀購(gòu)于中國(guó)寧波新芝生物科技公司。低溫高速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司。半干轉(zhuǎn)電泳儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。恒壓恒流電泳儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。普通PCR儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。生物安全柜購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 在NCBI網(wǎng)站查找H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株的全基因序列，并查找出Rv3480c基因，該基因全長(zhǎng)1494bp，設(shè)計(jì)引物時(shí)，上游加入EcoR I酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)記)、下游加入Hind III酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)記)，引物序列：Rv3480c-F-EcoRI(CCGGAATTCGTGAGCCAGACGGCCCGGC)和Rv3 480c-R-HindIII(CCCAAGCTTTCAGGAACCGAGGCCCGCG)。

1.3.2 目的基因擴(kuò)增 以人型結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv DNA為模板，Rv3480c-F-EcoRI為上游引物，Rv3480c-R-HindIII為下游引物，使用Pfu高保真PCR反應(yīng)試劑盒，在DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。設(shè)置溫度梯度摸索最佳反應(yīng)條件，反應(yīng)程序：預(yù)變性 94 ℃ 4 min，變性94 ℃ 30 s，退火58～70 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 4 min，共34個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后補(bǔ)延伸72 ℃ 10 min，終止反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化。

1.3.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增及表達(dá) 將目的基因和載體質(zhì)粒分別進(jìn)行EcoR I和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收酶切后的基因片段。酶切產(chǎn)物加入T4連接酶，置于PCR反應(yīng)儀中，16 ℃，連接過(guò)夜。取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂布在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)板上；37 ℃正置培養(yǎng)1 h，在倒置培養(yǎng)16～18 h；挑取單菌落接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜。質(zhì)粒小抽提取DNA，雙酶切驗(yàn)證。再送蘇州金唯智生物科技有限公司完成測(cè)序驗(yàn)證。取10 μL驗(yàn)證構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。采用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，設(shè)誘導(dǎo)濃度梯度(1∶2 000；1∶5 000；1∶1 0000)16 ℃少量誘導(dǎo)表達(dá)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗(yàn)證，查找IPTG最佳誘導(dǎo)濃度。按最佳誘導(dǎo)濃度大量誘導(dǎo)表達(dá)后加入溶菌酶及苯甲基磺酰氟(PMSF)；反復(fù)凍融后；在冰上超聲(工作5s、間歇9 s、功率200 W)30 min，重復(fù)1次；加入100 μL DNase(100 μg/mL)(1∶500)，4 ℃ 30 min；離心后驗(yàn)證誘導(dǎo)蛋白表達(dá)于上清中還是在包涵體中。

1.3.4 目的蛋白的純化 經(jīng)多次驗(yàn)證，誘導(dǎo)蛋白均顯示表達(dá)于包涵體中。將超聲破壁離心后的沉淀用IBS buffer(PH=8.0)洗3次，離心后棄上清；分別用6 M、4 M尿素(用1×PBS配制PH=8.0的6 M/4 M尿素)8 mL混勻；將8 mL分裝至8個(gè)EP管內(nèi)，-20 ℃凍存過(guò)夜；取出融化，10 000 g，2 min，將上清倒入裁剪好的透析膜中，兩端封口；透析(2M尿素2L 6 h×2次、1 M尿素2L 6 h×2次、1×PBS 2L6h×2次)。保存純化后的蛋白。SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色初步驗(yàn)證。

1.3.5 Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證 配制分離膠和濃縮膠、制備蛋白上樣混合液，將配制好的分離膠和濃縮膠放入電泳槽中，加1×電泳液，上樣孔分別加入蛋白上樣混合液和蛋白質(zhì)預(yù)染Marker，做好記錄，80V電泳至Marker分層(約30 min)，120 V電泳2 h；用半干轉(zhuǎn)法將分離膠的目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜；用5 mL 5%脫脂奶粉封閉緩沖液封閉PVDF膜，再用0.1%PBST溶液洗膜3次，分別用一抗、二抗孵育，每次孵育后均用0.1%PBST溶液洗膜3次；最后用Bio-Rad凝膠成像儀曝光采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 Rv3480c基因擴(kuò)增 以人結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv DNA為模板，Rv3480c-F-EcoRI為上游引物，Rv3480c-R-HindIII為下游引物擴(kuò)增Rv3480c基因，設(shè)定退火溫度梯度擴(kuò)增后1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，在6個(gè)溫度下1494bp處均有較明顯的條帶，與目的基因大小相符，但61.4～68.2 ℃擴(kuò)增均有雜帶并隨溫度增高而減少(見(jiàn)圖1A)，以此得到最佳反應(yīng)程序：預(yù)變性 94 ℃ 4 min，變性 94 ℃ 30 s，退火 70 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 4 min，共34個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后補(bǔ)延伸72 ℃ 10 min，終止反應(yīng)。

A：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果M為500BP DAN marker，1-6分別是設(shè)定退火溫度61.4 ℃、63.2 ℃、65.2 ℃、66.9 ℃、68.2 ℃、70.0 ℃；B：重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Rv3480c構(gòu)建示意圖； C：重組質(zhì)粒pET28a-Rv3480c雙酶切驗(yàn)證圖 1、2為EcoRI和HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pET28a-Rv3480c； D：pET28a-Rv3480c重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE，M為蛋白分子量Marker，泳道1、3、5分別是1∶2 000、1∶5 000和1∶10 000的IPTG誘導(dǎo)沉淀，泳道2、4、6分別是1∶2 000、1∶5 000和1∶10 000的IPTG誘導(dǎo)上清； E：pET28a-Rv3480c重組蛋白SDS-PAGE，M為蛋白分子量Marker，泳道1為4M尿素溶解pET28a-Rv3480c重組蛋白，泳道2和3為4M尿素溶解pET28a-Rv3480c重組蛋白并純化，泳道4為6M尿素溶解pET28a-Rv3480c重組蛋白； F：Rv3480c純化后Western-blot鑒定膠圖，M為標(biāo)準(zhǔn)物相對(duì)分子質(zhì)量。圖1 結(jié)核分枝桿菌包涵體蛋白R(shí)v3480c的克隆和純化

2.2 重組質(zhì)粒 將擴(kuò)增的目的基因和載體質(zhì)粒pET28a分別進(jìn)行EcoR I和HindIII雙酶切后連接(見(jiàn)圖1B)，轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞提取質(zhì)粒并雙酶切驗(yàn)證，可以看到在載體5369bp處和目的基因1494bp處均有條帶(見(jiàn)圖1C)，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。送測(cè)序的重組質(zhì)粒結(jié)果與人型結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv基因序列比對(duì)顯示重組質(zhì)粒插入序列完全匹配。

2.3 抗原Rv3480c的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將驗(yàn)證成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，破菌體后進(jìn)行SDS-PAGE跑膠驗(yàn)證，如圖1D所示。結(jié)果顯示1∶5 000和1∶10 000IPTG誘導(dǎo)濃度均可，且該蛋白表達(dá)于包涵體中。使用IBS buffer清洗，分別用6M、4M尿素溶解包涵體，并用低濃度尿素和PBS透析包涵體蛋白后，4M尿素溶解所得目的蛋白如泳道2和3所示，見(jiàn)較細(xì)單一目的條帶。而6M尿素溶解所得目的蛋白較粗，且雜帶較多圖1E泳道4所示。

2.4 Western Blot驗(yàn)證表達(dá)的Rv3480c蛋白 經(jīng)過(guò)SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、抗His一抗孵育、再次洗膜、二抗孵育、顯色等步驟，可見(jiàn)膜上出現(xiàn)特異性條帶，如圖1F。

3 討論

結(jié)核病在全球蔓延的趨勢(shì)不容忽視，控制結(jié)核病的關(guān)鍵之一在于早期診斷技術(shù)的革新。近年來(lái)許多新技術(shù)如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、質(zhì)譜分析、蛋白芯片、血清學(xué)診斷等，都致力于尋找活動(dòng)性結(jié)核病的生物標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)新的活動(dòng)性結(jié)核病生物標(biāo)志物用于結(jié)核病診斷和病情監(jiān)測(cè)已經(jīng)成為當(dāng)前研究重點(diǎn)[5]。

本研究目的蛋白R(shí)v3480c是一種假定甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶，為結(jié)核分支桿菌分泌蛋白，是本課題組通過(guò)結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片雜交技術(shù)篩選出的與活動(dòng)結(jié)核病相關(guān)的蛋白。Daniel等[6]報(bào)道Rv3480c可能參與了結(jié)核菌休眠狀態(tài)下的能量供應(yīng)。結(jié)核分枝桿菌首次感染宿主后，激活宿主免疫反應(yīng)，大部分宿主體內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制而進(jìn)入休眠狀態(tài)，可在機(jī)體休眠數(shù)年甚至可達(dá)數(shù)十年。當(dāng)宿主免疫低下時(shí)，細(xì)菌可復(fù)蘇，宿主發(fā)展成為活動(dòng)結(jié)核病。現(xiàn)有報(bào)道Rv3480c蛋白的英文文獻(xiàn)僅兩篇[8-9]，中文未見(jiàn)報(bào)道，其分子結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)特性有待進(jìn)一步的深入研究。

近幾十年來(lái)生物基因工程技術(shù)得到了長(zhǎng)足發(fā)展，基因克隆技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，其中就包括結(jié)核病的研究。大腸桿菌為最常用的原核表達(dá)體系，該體系具有耗時(shí)短、經(jīng)濟(jì)、高效、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但是該表達(dá)產(chǎn)物容易形成非水溶性、無(wú)生物活性的包涵體。本研究通過(guò)構(gòu)建Rv3480c基因大腸桿菌表達(dá)體系表達(dá)出的蛋白幾乎均存在于包涵體中，故需要溶解包涵體、蛋白變性和復(fù)性才能得到有生物活性的表達(dá)蛋白。本研究先經(jīng)溶菌酶處理法破壞大腸桿菌細(xì)胞壁，再結(jié)合反復(fù)凍融法及超聲破壁法充分裂解細(xì)菌，因超聲波處理過(guò)程中產(chǎn)生大量熱能，會(huì)使蛋白變性失活，為防止高溫蛋白變性，操作需在冰上進(jìn)行，間歇開(kāi)機(jī)，而且操作時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。為能夠充分裂解細(xì)菌，我們超聲破壁處理了2次，蛋白液出現(xiàn)黑色沉淀，分析可能是由于超聲功率過(guò)大、操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致蛋白炭化，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中只超聲處理1次，未再出現(xiàn)該情況。尿素作為包涵體溶解劑有很多優(yōu)勢(shì)，如成本低、容易透析清除、不電離、可直接進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)等，所以我們選擇尿素溶解包涵體，它可通過(guò)離子間的相互作用使包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間的各類化學(xué)鍵斷裂。我們首先應(yīng)用6M尿素進(jìn)行溶解包涵體，再使用透析復(fù)性法，通過(guò)逐步降低透液濃度來(lái)控制尿素清除速度，獲得可溶性蛋白體積無(wú)明顯變化，但是復(fù)性后蛋白雜質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE顯示有雜帶，且蛋白液出現(xiàn)白色沉淀，考慮可能是透析復(fù)性過(guò)程中去除尿素速度過(guò)快。改用4M尿素后未出現(xiàn)沉淀，且經(jīng)SDS-PAGE可見(jiàn)單一目的條帶，獲得可溶性蛋白液量不及6M尿素溶解所得。由此可見(jiàn)用低濃度尿素溶解包涵體得到的可溶性蛋白純度高于高濃度尿素溶解，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，因?yàn)樽冃詣舛雀邥r(shí)胞質(zhì)顆粒蛋白也被釋放出來(lái)[10]，而且高濃度變性劑能夠更充分地溶解包涵體，獲得更多的可溶性蛋白。在透析復(fù)性過(guò)程中應(yīng)緩慢去除變性劑，若速度較快，蛋白離子環(huán)境改變較大，容易形成沉淀，為后續(xù)純化增加難度。

本研究采用原核表達(dá)體系成功克隆和純化了結(jié)核分枝桿菌包涵體蛋白R(shí)v3480c，為進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能研究奠定了基礎(chǔ)，也為更好地獲取包涵體蛋白提供了新方法。

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(編輯：王福軍)

Cloning,expression and purification of the Rv3480c inclusion body protein of Mycobaterium tuberculosis

Wen Qiang1,2,Tang Mingmei1,Chen Ling1,Peng Zhangli1,He Yuejuan1,Tang Zhenghong1

(1.The Second Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China; 2.The Third Department of Internal Medicine,Eastern Medical District of Linyi People’s Hospital,Linyi Shandong 276000,China)

ObjectiveTo clone，express and purify the Rv3480c inclusion body protein ofMycobateriumtuberculosisby molecular biological technique.MethodsRv3480c was amplified fromM.tuberculosisH37Rv by PCR and cloned into vector pET-28a,then transformed to E.coli BL21 (DE3) strain.The engineering bacteria were induced to express the protein by Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG).The inclusion body was repeatedly dissolved,and recombinant protein was purified.ResultsThe gene that was amplified by PCR was successfully built in right sequence detected via agarose gel electrophoresis and sequencing.Recombinant protein was dialyzed and purified with urea solution and Phosphate Buffered Saline (PBS).The target protein was identified as Rv3480c by Western-blot,which was the recombination antigen ofM.tuberculosis.ConclusionThe purified Rv3480c protein was successfully obtained by molecular biological technique,which provides an experimental basis for further studies of the function and structure of Rv3480c,and explores a new method for better purification of inclusion body proteins.

Mycobacteriumtuberculosis; Rv3480c; inclusion body; cloning; purification

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO:81360002)。

陳玲，女，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：肺部感染與結(jié)核病的防治，E-mail:lingjuncd@163.com。

R378.91

A

1000-2715(2017)04-0401-04

[收稿2017-06-04;修回2017-07-09]