關(guān)紅雨，胡添源，趙瑜君，蘇平，童宇茹，張逸風(fēng)，張夏楠，高偉*，黃璐琦*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700)

·基礎(chǔ)研究·

雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1)的cDNA全長(zhǎng)克隆及表達(dá)分析△

關(guān)紅雨1，胡添源1，趙瑜君2，蘇平2，童宇茹2，張逸風(fēng)1，張夏楠1，高偉1*，黃璐琦2*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700)

目的：克隆得到雷公藤一型4α-甲基氧化酶(TwSMO1)(GenBank KX987126)全長(zhǎng)基因，并對(duì)其進(jìn)行序列分析及初步的功能驗(yàn)證。方法：根據(jù)雷公藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)克隆得到雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1)，并利用相關(guān)軟件對(duì)所得核酸序列及其所編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。用茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)雷公藤懸浮細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)的方法分析誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)后雷公藤懸浮細(xì)胞中的TwSMO1基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：克隆所得的TwSMO1基因cDNA全長(zhǎng)1505 bp，開放閱讀框900 bp，編碼299個(gè)氨基酸，在線預(yù)測(cè)其所編碼蛋白分子量為34.55 kDa，理論等電點(diǎn)為6.89。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示其與其他物種的SMO1氨基酸序列有較高同源性，且包含SMO1基因家族的3個(gè)保守域，系統(tǒng)進(jìn)化樹將其歸為4α-甲基氧化酶第一家族基因，遂將其命名為TwSMO1。RT-PCR結(jié)果表明MeJA誘導(dǎo)后TwSMO1基因在1 h后表達(dá)量達(dá)到最高，約是對(duì)照組的450倍。結(jié)論：本研究首次克隆得到雷公藤TwSMO1基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及MeJA誘導(dǎo)表達(dá)分析，為深入研究此基因功能及闡述雷公藤甾醇生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。

雷公藤；4α-甲基氧化酶；克隆；生物信息學(xué)分析；誘導(dǎo)表達(dá)

甾醇類化合物普遍存在于真核生物中，對(duì)于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用，同時(shí)作為組成膜結(jié)構(gòu)的基本成分，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性和滲透性的作用，可在細(xì)胞膜間交流脂類和蛋白類化合物，并可促使細(xì)胞膜完成細(xì)胞形態(tài)的變化及細(xì)胞分化等活動(dòng)[1]。在高等植物中，甾醇類化合物經(jīng)甲羥戊酸途徑(MVA)合成，與三萜類化合物的上游合成途徑基本一致，而環(huán)阿屯醇合酶(CAS)促使代謝流向甾體類化合物方向流動(dòng)，在此后生成甾醇類化合物的過程中，植物甾醇若想發(fā)揮組成膜結(jié)構(gòu)的功能，需要脫去C-4位的兩個(gè)甲基[2]。SMO對(duì)C-4位的脫甲基反應(yīng)起到起始氧化作用[3]，繼而有助脫甲基過程的發(fā)生。SMO分為兩個(gè)家族，分別在甾醇下游的不同步驟進(jìn)行C4位的脫甲基化反應(yīng)。SMO1催化4，4-二甲基-9β，19-環(huán)丙烷環(huán)甾醇生成4，4-二甲基甾醇，而SMO2則有助于促進(jìn)4α-甲基甾醇脫甲基生成C-4甲基甾醇。

本研究中，根據(jù)雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆得到一條SMO基因，并通過生物信息學(xué)分析對(duì)該基因及其所編碼的蛋白進(jìn)行初步預(yù)測(cè)，同時(shí)分析了經(jīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后懸浮細(xì)胞中基因表達(dá)含量的變化，為進(jìn)一步研究該基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 懸浮細(xì)胞

雷公藤懸浮細(xì)胞暗培養(yǎng)于0.5 mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1KT+0.5mg·L-1IBA的MS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為25 ℃、120 r·min-1。

1.2 菌株

本實(shí)驗(yàn)所用的E.coilTrans1-T1菌株購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑及儀器

本研究所用的RNA純化試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(美國(guó)Clontech公司)；克隆載體pEASY-T3 Cloning Kit及菌液PCR所用2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；KAPA SYBR?Tetra System(美國(guó)KAPA Biosystems公司)；ABI verity PCR擴(kuò)增儀；LightCycler?480II熒光定量PCR儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 雷公藤懸浮細(xì)胞RNA的提取

用茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)雷公藤懸浮細(xì)胞，使MeJA終濃度為50 μmol·L-1,分別取誘導(dǎo)1、4、12、24、72、72 h后的懸浮細(xì)胞用CTAB法提取總RNA，并經(jīng)DNase I去除基因組污染及RNA純化試劑盒純化，用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)所提取RNA質(zhì)量。

2.2 TwSMO1末端快速擴(kuò)增

將上述純化RNA用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA。把轉(zhuǎn)錄組中所得基因片段在NCBI進(jìn)行BlastX比對(duì)，結(jié)果顯示該片段5′端完整，3′端有缺失，設(shè)計(jì)3′ RACE Primer以得到cDNA全長(zhǎng)序列，引物序列為TwSMO1 (3′ RACE)：CGTTTGCGGAGACTTTGTGGTTC，以3′ RACE Ready cDNA為模板進(jìn)行末端擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：5 μL 10×Adantage 2 PCR Buffer、1 μL dNTP mix (10 mmol·L-1)、1 μL 50×Advantage 2 polymerase及34.5 μL PCR-grade water，將上述體系稍稍混勻后再加入5 μL 10×UPM、1 μL 3′RACE Primer (10 μmol·L-1)和2.5 μL cDNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸7 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化后，連接pEASY-T3克隆載體，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB+Amp (100 mg·L-1)的平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌斑參照全式金EasyTaq Mix說明書進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，選擇陽性菌斑進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與先前轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接得到TwSMO1全長(zhǎng)cDNA全長(zhǎng)序列。

2.3 TwSMO1全長(zhǎng)ORF的克隆

利用在線ORF Finder工具從TwSMO1全長(zhǎng)cDNA序列中找到TwSMO1 的開放閱讀框即ORF區(qū)，并在其ORF兩端設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增其ORF全長(zhǎng)序列，引物序列為：TwSMO1-F，ATGCTGCCGTACGCCACCATCG；TwSMO1-R，CTAATCAGATTTAACATTGTACAATCCTCC；用NEB Phusion HF高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：正反引物各2.5 μL，2×Phusion HF PCR Master Mix 25 μL，cDNA模板1 μL，用水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，連接pEASY-T3載體，轉(zhuǎn)化E.coilTrans1-T1感受態(tài)細(xì)胞并于LB+Amp (100 mg·L-1)的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌斑進(jìn)行菌液PCR，挑取陽性菌斑測(cè)序，從而得到TwSMO1 基因完整ORF 。

2.4 TwSMO1基因生物信息學(xué)分析

將獲得的TwSMO1全長(zhǎng)序列用ORF Finder網(wǎng)站查找開放閱讀框，并在NCBI網(wǎng)站與其他物種核酸及氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，同時(shí)下載同源序列用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，MEGA 5.2建立系統(tǒng)進(jìn)化樹；用Compute PI/Mw (http：//web.expasy.org/compute_pi/) 網(wǎng)站預(yù)測(cè)其氨基酸序列所編碼蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)；TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白跨膜域結(jié)構(gòu)；分別用Predictprotein (http：//www.predictprotein.org/)和SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)網(wǎng)站進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及三維同源建模。

2.5 TwSMO1基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

茉莉酸甲酯(MeJA)作為一種非生物誘導(dǎo)子，具有促進(jìn)次生代謝物累積的作用。將雷公藤懸浮細(xì)胞中提取得到的RNA反轉(zhuǎn)為cDNA后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)方法檢測(cè)TwSMO1在不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)含量的變化。根據(jù)RT-PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)特異性引物(qTwSMO1-F：GTGGATAGTTTTGCGGC；qTwSMO1-R：TAGCTTTTTCTGATATCGAAAG)以擴(kuò)增TwSMO1基因片段；所用內(nèi)參基因?yàn)檠由煲蜃踊?eukaryoticelongationfactor-1α)Efα1U和Efα1L；引物序列為：Efα1U，TAGCTTTTTCTGATATCGAAAG；Efα1L，CACTGGTGGTTTTGAGGCTGGTATCT[4]。20 μL反應(yīng)體系包括：10 μL 2×KAPA SYBR? FAST qPCR Master Mix 2 Universal，各0.5 μL的正反向引物，1 μL cDNA及8 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；而后95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共重復(fù)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，用2-△△Ct的方法分析TwSMO1基因相對(duì)于內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 TwSMO1基因全長(zhǎng)ORF的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組所得的SMO1基因片段信息設(shè)計(jì)3′ RACE引物并進(jìn)行cDNA末端擴(kuò)增，隨后將RACE測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接，得到TwSMO1全長(zhǎng)序列，在ORF兩端設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增ORF全長(zhǎng)，結(jié)果如圖1所示，在900 bp處得到單一明亮的條帶。

注：M.2000bp marker；1.TwSMO1基因ORF擴(kuò)增條帶。圖1 TwSMO1基因全長(zhǎng)ORF克隆

3.2 TwSMO1基因生物信息學(xué)分析

TwSMO1基因全長(zhǎng)1505 bp，開放閱讀框 900 bp，編碼299個(gè)氨基酸。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示TwSMO1含有SMO1基因家族的3個(gè)保守域：一個(gè)HX3H及兩個(gè)HX2HH。同時(shí)其氨基酸序列與毛果楊Populustrichocarpa及可可樹Theoboromacacao的同源性均達(dá)81%，與川桑Morusnotabilis及蒺藜苜蓿的Medicagotruncatula的相似性分別為79%和78%，與其他物種比對(duì)結(jié)果如圖2所示。

ExPASy在線預(yù)測(cè)其氨基酸所編碼蛋白的分子量為34.55 kDa，理論等電點(diǎn)為6.89。TMHMM蛋白跨膜域結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(見圖3)：TwSMO1為膜蛋白，含有3個(gè)跨膜區(qū)域，分別位于37～59、92～114及184～206位氨基酸，此外，1～36和115～183位氨基酸位于膜外，60～91、207～299位氨基酸位于膜內(nèi)。

注：TcSMO1.Theobroma cacao，XP_007039995.1；DhSMO1.Dorcoceras hygrometricum，KZV19433.1；PtSMO1.Populus trichocarpa，XP_006368716.1；MnSMO1.Morus notabilis，XP_010108130.1；MtSMO1.Medicago truncatula，XP_003608797.1；GaSMO1.Gossypium arboreum，KHG07507.1；AtSMO1.Arabidopsis thaliana，NP_567670.1；Region 1～3為SMO1基因家族的3個(gè)保守域：HX3H、HX2HH及HX2HH。圖2 TwSMO1與其他物種的SMO1氨基酸序列比對(duì)

圖3 TwSMO1蛋白跨膜域分析

Predictprotein預(yù)測(cè)結(jié)果表明其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以螺旋結(jié)構(gòu)為主，占到65.89%，此外成環(huán)結(jié)構(gòu)和線性結(jié)構(gòu)分別占到31.77%和2.34%。SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖4所示，以4zr 0.1.A為模板建模，序列同源性為22.14%，建模范圍為126～268位氨基酸。

圖4 模擬TwSMO1蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)

將不同物種的SMO1和SMO2家族基因氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹歸類，結(jié)果如圖5所示，進(jìn)化樹按基因家族分為兩大分支，SMO1為一分支，SMO2聚為另一分支，而克隆所得TwSMO基因的氨基酸序列與其他物種的SMO1序列歸為一類，故其為SMO1家族基因，同時(shí)可看出雷公藤SMO1與毛果楊(Populustrichocarpa)中的SMO1親緣關(guān)系最近。

注：MtSMO1.Medicago truncatula，XP_003608797.1；GsSMO1.Glycine soja，KHN04765.1；MnSMO1.Morus notabilis，XP_010108130.1；PtSMO1.Populus trichocarpa，XP_006368716.1；DhSMO1.Dorcoceras hygrometricum，KZV19433.1；GaSMO1.Gossypium arboreum，KHG07507.1；TcSMO1.Theobroma cacao，XP_007039995.1；AtSMO1.Arabidopsis thaliana，NP_567670.1；ZmSMO2.Zostera marina，KMZ74989.1；AcSMO2.Ananas comosus，OAY85395.1；AtSMO2.Arabidopsis thaliana，Q9ZW22.2；GsSMO2.Glycine soja，KHN45289.1；MnSMO2.Morus notabilis，XP_010106554.1。圖5 TwSMO1與其他物種的SMO氨基酸序列的進(jìn)化樹

3.3 TwSMO1基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

用實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測(cè)經(jīng)MeJA誘導(dǎo)不同時(shí)間的懸浮細(xì)胞中TwSMO1的表達(dá)量，并通過2-△△Ct法計(jì)算TwSMO1基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖6所示，經(jīng)MeJA誘導(dǎo)1 h后，TwSMO1基因的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組有顯著提高，是對(duì)照組的450多倍，隨后即呈下降趨勢(shì)，在誘導(dǎo)后約12 h誘導(dǎo)組表達(dá)量與對(duì)照組趨于一致。

圖6 MeJA誘導(dǎo)雷公藤懸浮細(xì)胞TwSMO1基因表達(dá)量分析

4 討論

雷公藤作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，應(yīng)用歷史悠久，廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及麻風(fēng)等疾病的治療[5-6]。在前期研究中，許多參與植物次生代謝的重要功能基因已被克隆并進(jìn)行了功能驗(yàn)證[7-12]，但參與雷公藤甾醇類化合物生物合成的中下游基因研究才剛剛開始。

甾醇類化合物主要起調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育及組成膜結(jié)構(gòu)的作用，高等植物中甾醇種類豐富，主要為谷甾醇、豆甾醇及24-甲基膽甾醇等化合物[10]。在SMO的作用下，甾醇生物合成中C4位脫掉兩個(gè)甲基從而使甾醇具有組成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用。同時(shí)有研究表明，將擬南芥中克隆得到的SMO1、SMO2基因分別在煙草屬植物中沉默，分別導(dǎo)致了4，4-二甲基-9β，19-環(huán)丙烷環(huán)甾醇和4α-甲基甾醇的累積，從而可影響4，4-二甲基甾醇和C-4甲基甾醇的表達(dá)水平。更有研究表明，在煙草中過表達(dá)黃花蒿AaSMO1基因可提高總甾醇含量，從而使其后代能夠更好地發(fā)芽和生長(zhǎng)；此外，該基因還具有提高植物對(duì)干旱環(huán)境的耐受力作用[2]。

本研究克隆得到一條全長(zhǎng)TwSMO1基因，其cDNA全長(zhǎng)為1505 bp，開放閱讀框900 bp，編碼299個(gè)氨基酸，多重序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析將此基因歸為SMO1基因家族，同時(shí)結(jié)果顯示其與其他物種的SMO1氨基酸序列具有較高同源性，且實(shí)驗(yàn)表明，MeJA誘導(dǎo)雷公藤懸浮細(xì)胞1 h后，TwSMO1基因表達(dá)量急劇上升并達(dá)到峰值。此研究將為深入研究雷公藤SMO1基因功能及闡釋雷公藤甾醇生物合成途徑奠定基礎(chǔ)，同時(shí)可對(duì)調(diào)節(jié)雷公藤植株的生長(zhǎng)及抗旱能力起到一定的意義。此外，雷公藤紅素作為雷公藤中具有重要藥理活性的三萜類化合物，其藥理活性廣泛[13-14]，其下游生物合成位于甾醇類化合物的旁路，利用RNA干擾等手段抑制甾醇通路上基因的表達(dá)可能有利于三萜類化合物的累積，對(duì)于促進(jìn)雷公藤紅素的生物合成具有一定意義。

[1] Singh A，Jindal S，Longchar B，et al.Overexpression ofArtemisiaannuasterol C-4 methyl oxidase gene，AaSMO1，enhances total sterols and improves tolerance to dehydration stress in tobacco[J].Plant Cell Tissue & Organ Culture，2015，121(1)：167-181.

[2] Darnet S，Ranier A.Plant sterol biosynthesis：identificationof two distinctfamilies of sterol 4alpha-methyl oxidases[J].BiochemJ，2004 ,378(3)：889-898.

[3] Rondet S，Taton M，Rahier A.Identification，characterization，and partia l purifica tionof 4alpha-carboxysterol-C3-dehydrogenase/C4-deca rboxylase fromZeamays[J].Arch BiochemBiophys，1999，366(2)：249-260.

[4] 祝傳書，陳欣，郭嘉，等.雷公藤1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸還原酶基因(twdxr)的克隆與表達(dá)分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2014,22(3)：298-308.

[5] 黃玲.雷公藤藥理作用研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)藥，2000(2)：45-46.

[6] 水光興，萬毅剛，蔣春明，等.雷公藤及其活性成分藥效學(xué)和藥理學(xué)研究的若干進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35(4)：515.

[7] Tong Y R，Su P，Zhao Y J，et al.Molecular cloning and characterization ofDXSandDXRgenes in terpenoid biosynthetic pathway fromTripterygiumwilfordii.[J].Int J Mol Sci，2015，16：25516-25535.

[8] Zhang M，Su P，Zhou Y J，et al.Identification of geranylgeranyl diphosphate synthase genes fromTripterygiumwilfordii[J].Plant Cell Rep，2015，34：2179-2188.

[9] 張萌，蘇平，劉雨佳,等.雷公藤牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶基因全長(zhǎng)cDNA的獲得及生物信息學(xué)分析[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40(6)：1066-1070.

[10]童宇茹，蘇平，張萌,等.雷公藤M(fèi)CT基因的全長(zhǎng)克隆與表達(dá)分析[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40(22)：4378-4383.

[11]Zhao Y J，Chen X，Zhang M，et al.Molecular cloning and characterisation of farnesyl pyrophosphate synthase fromTripterygiumwilfordii[J].PLoS One，2015，10：1-13.

[12]趙瑜君，張萌，劉雨佳,等.雷公藤乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因全長(zhǎng)cDNA克隆及表達(dá)分析[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40(5)：847-852.

[13]陳銘祥，馮玉靜，王定勇,等.雷公藤紅素的研究進(jìn)展[J].中成藥，2010，32(3)：473-476.

[14]Zhang L X，Yu F K，Zheng Q Y，et al.Immunosuppressive and-antiinflammatory activities of tripterine[J].Acta Pharm Sin，1990，25：573-577.

CloningandExpressionAnalysisof4α-methylOxidase1cDNAinTripterygiumwilfordii

GUANHongyu1，HUTianyuan1，ZHAOYujun2，SUPing2，TONGYuru2，ZHANGYifeng1，ZHANGXianan1，GAOWei1*，HUANGLuqi2*

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China； 2.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbs，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700,China)

Objective：To obtain the full-length cDNA of 4α-methyl oxidase 1(TwSMO1)fromTripterygiumwilfordii，and further demonstrate the sequence information and function.Methods：Based on the transcriptome data ofT.wilfordii，the rapid-amplification of cDNA ends (RACE) technology was used to clone 4α-methyl oxidase gene (SMO1).The bioinformatics software was used to analyze the information of nucleic acid sequence and the coding amino acids sequence.T.wilfordiisuspension cells were induced by methyl jasmonic acid (MeJA)，and the genetic differential expression ofTwSMO1 were detected through RT-PCR method.Results：The full-length cDNA sequence ofTwSMO1 gene was 1505 bp，containing a 900 bp open reading frame and encodes 299 amino acids.The prediction of molecular weight of coding protein was 34.55 kDa and the theory of isoelectric point was 6.89.Multiple sequence alignment results showed that the amino acid sequence of TwSMO1 had a high homology with other species，including three conservative domains of SMO1 gene family.Phylogenetic tree analysis indicated that the gene was classified as first family of 4α-methyl oxidase gene，hence we named itTwSMO1.RT-PCR results showed that,after induced by MeJA,the level ofTwSMO1 gene expression was about 450 times higher than the control group at 1 h.Conclusion：TheTwSMO1 gene was cloned fromT.wilfordiifirstly,the bioinformation of the sequence was analyzed and the enzyme function was verified.The results laid the foundation for further research on its gene function and sterol biosynthetic pathway ofT.wilfordii.

Tripterygiumwilfordii；4α-methyl oxidase；cloning；Bioinformatics analysis；inducible expression

國(guó)家自然科學(xué)優(yōu)秀青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81422053)；國(guó)家杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81325023)

] 高偉，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子生藥學(xué)與中藥資源學(xué)，Tel：(010)83911633，E-mail：weigao@ccmu.edu.cn；黃璐琦,院士，研究方向：分子生藥學(xué)與中藥資源學(xué)，Tel：(010)64014411，E-mail：huangluqi01@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.004

2016-09-30)

*[