孫曉麗，王威

(1.河北省易縣婦幼保健院，河北 保定 074200；2.河北省張家口市婦幼保健院，河北 張家口 075000)

·中藥工業(yè)·

剪刀股中揮發(fā)油的穩(wěn)定性及抑菌作用研究

孫曉麗1*，王威2

(1.河北省易縣婦幼保健院，河北 保定074200；2.河北省張家口市婦幼保健院，河北 張家口075000)

目的：優(yōu)化剪刀股揮發(fā)油的提取方法，測(cè)定其穩(wěn)定性，研究其抑菌作用。方法：通過正交試驗(yàn)優(yōu)化剪刀股揮發(fā)油的提取條件；采用初均速法，以折光率為測(cè)定指標(biāo)，確定剪刀股揮發(fā)油穩(wěn)定性；測(cè)定剪刀股揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌等菌種的抑菌作用。結(jié)果：采用揮發(fā)油提取器提取剪刀股揮發(fā)油的最佳提取條件為氯化鈉溶液濃度6%，浸泡時(shí)間1h，料液比10∶1，提取時(shí)間5h；平均提取率為0.466%，RSD為0.3277%；剪刀股揮發(fā)油在25℃時(shí)的半衰期為8.74年；剪刀股揮發(fā)油在濃度為0.6%時(shí)，抑菌作用與氯霉素相當(dāng)。結(jié)論：剪刀股中揮發(fā)油穩(wěn)定性較好，并對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定抑菌作用。

剪刀股；揮發(fā)油；提?。环€(wěn)定性；抑菌作用

剪刀股(IxerisdebilisA.Gray)屬于菊科苦荬菜屬植物，廣泛生長于我國北方各地，是我國北方重要的藥食兩用植物，民間主要用于肺熱咳嗽、喉痛、口腔潰瘍、急性結(jié)膜炎、闌尾炎等癥的輔助治療[1]。筆者經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，剪刀股中含有一定量的揮發(fā)油。本實(shí)驗(yàn)對(duì)剪刀股中揮發(fā)油的提取、穩(wěn)定性作進(jìn)一步的研究，并以氯霉素為對(duì)照進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化剪刀股揮發(fā)油的提取方法，了解剪刀股揮發(fā)油的穩(wěn)定性，闡明其抑菌特性，為剪刀股的綜合利用開辟一條新途徑，也為從剪刀股中提取高效低毒的抑菌成分提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器

DK-8B型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；阿貝折光儀(上海光學(xué)儀器廠)；GNP-9080隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2試藥

大腸桿菌(Escherichiacoli)、綠膿桿菌(Pseudomnas)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusareus)均由河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)室友情饋贈(zèng)；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)菌，所用培養(yǎng)基均符合GB4789.28-94標(biāo)準(zhǔn)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為三重蒸餾水。

剪刀股采自河北省張家口市郊區(qū)，由河北北方學(xué)院趙恒誠教授鑒定為菊科植物IxerisdebilisA.Gray正品。

2 方法

2.1剪刀股揮發(fā)油的提取

2.1.1 水蒸汽蒸餾法提取剪刀股揮發(fā)油的工藝流程 將剪刀股地上部分室溫干燥后，粉碎為粗粉。取剪刀股粗粉適量，加入一定量NaCl溶液浸泡后，置于揮發(fā)油提取器中提取5 h，收集揮發(fā)油[2]，按照下列公式計(jì)算揮發(fā)油提取率。

剪刀股揮發(fā)油提取率(%)=提取出的揮發(fā)油質(zhì)量(g)/剪刀股質(zhì)量(g)×100%

(1)

2.1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溶劑NaCl溶液濃度、浸泡時(shí)間及液料比3個(gè)因素作為考察對(duì)象，以揮發(fā)油提取率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算剪刀股揮發(fā)油的提取率，優(yōu)化提取工藝，因素和水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 取剪刀股粗粉適量，共3份，按照正交試驗(yàn)確定的最佳提取工藝進(jìn)行提取，計(jì)算剪刀股揮發(fā)油提取率。2.2剪刀股揮發(fā)油穩(wěn)定性研究

精密量取剪刀股揮發(fā)油8份，各0.5 mL，置于5 mL的具塞試管中，按照表2分別在不同溫度下，水浴至一定時(shí)間，進(jìn)行恒溫加速破壞。到設(shè)定時(shí)間后，立即取出試管停止加熱，置于冷水中降至室溫，保證反應(yīng)能夠立即停止，測(cè)定恒溫加熱后揮發(fā)油的折光率[3-4]。

2.3剪刀股揮發(fā)油抑菌作用的研究

2.3.1含菌平皿的制備 將斜面活化好的大腸桿菌、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌菌種用無菌水分別稀釋制成含菌數(shù)約103CFU·mL-1的菌懸液，各取1mL與牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制成含菌平皿，備用。

表2 不同溫度下剪刀股揮發(fā)油的折光率

2.3.2 揮發(fā)油體外抑菌活性 將剪刀股揮發(fā)油用丙三醇稀釋配成0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的系列濃度的溶液。按照相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]所做抑菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)量抑菌圈的直徑。同時(shí)，用氯霉素(終濃度為0.01%)和蒸餾水代替剪刀股揮發(fā)油加入到培養(yǎng)基中作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1揮發(fā)油提取結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。由表3可見,對(duì)剪刀股揮發(fā)油提取率影響最大的是液料比，其次為NaCl溶液濃度，其中液料比對(duì)剪刀股揮發(fā)油提取率的影響有顯著性(P<0.05)，剪刀股最佳提取工藝為A3B2C3，即NaCl溶液濃度6%，浸泡時(shí)間1 h，液料比10∶1。按照正交試驗(yàn)確定的最佳提取工藝進(jìn)行3次提取，剪刀股揮發(fā)油提取率分別為0.465%、0.466%、0.468%，平均提取率為0.466%，RSD=0.327 7%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

3.2剪刀股揮發(fā)油穩(wěn)定性研究結(jié)果

3.2.1數(shù)據(jù)處理 根據(jù)數(shù)學(xué)模型[7]，數(shù)據(jù)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)法處理。用公式Vi=(ni-n0)/ti計(jì)算不同溫度下的平均速度(即初速度)。

其中n0為室溫下剪刀股揮發(fā)油的折光率，ni為不同溫度下經(jīng)相應(yīng)時(shí)間恒溫破壞后測(cè)得的剪刀股揮發(fā)油折光率，ti為不同溫度下對(duì)應(yīng)的時(shí)間(h)，其中i分別是1、3、4、5、6、7和9。

3.2.2回歸方程的繪制 縱軸Y取(Vi+10)×5代表ki，橫軸X取1/T×103，作Arrhenius圖，得線性回歸方程Y=-37.861X+118.99，相關(guān)系數(shù)r=0.998。

3.2.3剪刀股揮發(fā)油的半衰期 根據(jù)Arrhenius公式ki=-Ea/RT+lnA，求得活化能Ea=314.776KJ·mol-1。由Arrhenius回歸方程求出V298K，則k298K=9.057×10-6h-1。根據(jù)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式分別求得298K時(shí)，t0.9=1.33年，t0.8=2.81年，t0.7=4.50年，t0.5=8.74年，即揮發(fā)油消耗10%需要1.33年，消耗20%需要2.81年，消耗30%需要4.50年，半衰期為8.74年。表明剪刀股揮發(fā)油在室溫穩(wěn)定。

3.3剪刀股揮發(fā)油抑菌作用的研究結(jié)果

剪刀股揮發(fā)油抑菌效果見表5。

表5 剪刀股揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌的抑菌效果(以抑菌圈直徑表示，mm)

注：“-”表示無抑菌效果。

由表5可知，剪刀股揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，并且其抑菌作用隨著濃度的增大而增強(qiáng)。其中濃度為0.6%的剪刀股揮發(fā)油的抑菌效果與0.01%氯霉素的抑菌效果相當(dāng)。

4 討論和結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用水蒸汽蒸餾的方法提取剪刀股揮發(fā)油，由于前期研究發(fā)現(xiàn)剪刀股揮發(fā)油水溶性較高，為避免損失，采用氯化鈉溶液為溶劑，通過鹽析作用使其能夠更好地從水中分離出來[8]。實(shí)驗(yàn)證明，氯化鈉濃度為6%時(shí)，能獲得較好的分離效果。提取前用溶劑浸泡藥材一定時(shí)間，有助于組織細(xì)胞間隙增大，促進(jìn)揮發(fā)油由細(xì)胞轉(zhuǎn)移至溶劑中，對(duì)提取有一定的作用，但浸泡時(shí)間過長可能導(dǎo)致?lián)]發(fā)油的揮發(fā)增加，降低提取率。本實(shí)驗(yàn)證明，剪刀股揮發(fā)油的提取中用氯化鈉溶液浸泡1 h即可獲得較好的提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，液料比對(duì)剪刀股揮發(fā)油的提取率具有較顯著的影響，應(yīng)該與剪刀股揮發(fā)油在水中的溶解度較高有關(guān)。預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間超過5 h，提取率基本不再增加，因此本實(shí)驗(yàn)將提取時(shí)間統(tǒng)一定為5 h，未在正交試驗(yàn)中加以考察。

揮發(fā)油受熱后分解，則其多項(xiàng)物理性質(zhì)發(fā)生變化。本研究以剪刀股揮發(fā)油在受熱后的折光率變化為測(cè)定指標(biāo)[9]，采用初均速法測(cè)定剪刀股揮發(fā)油的半衰期，跟經(jīng)典恒溫加速實(shí)驗(yàn)法比較，初均速法效率更高，取樣次數(shù)少，更為簡單快捷，操作難度降低。實(shí)驗(yàn)證明，剪刀股揮發(fā)油在25 ℃的半衰期為8.74年，穩(wěn)定性較好，能夠滿足藥用的要求。

剪刀股揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、金葡菌具有一定的抑制作用，特別是當(dāng)其濃度達(dá)到0.6%時(shí)，與濃度為0.01%的氯霉素相當(dāng)，此結(jié)果從實(shí)驗(yàn)層面驗(yàn)證了剪刀股“清熱解毒”的活性，為剪刀股的開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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StudyonStabilityofVolatileOilsfromIxerisdebilisandItsAntibacterialEffect

SUN Xiaoli1*，WANG Wei2

(1.Women and Children Hospital of Yixian，Hebei，Baoding 074200，China；2.Pharmacy of Women and Children of Zhangjiakou，Hebei，Zhangjiakou 075000，China)

Objective：To optimize the extraction of volatile oils inIxerisdebilisand study its stability and antibacterial effect.Method：The best extraction process of the inI.debiliswas evaluated by orthogonal design.The refractive index were measured to predict the stability using initial average rate stability test.The growth inhabiting effect of the volatile oilsonEscherichiacoli，PseudomnasandTaphylococcusareuswas determined.Result：The best condition of extracting thevolatile oils fromI.debiliswas follows：soaking in 10 times (volume/quality) sodium chloride solution (6%) for 1h，and heating for 5 h.The Extraction yield of thevolatile oils inI.debiliswas 0.466% (RSD=0.327 7%).The t1/2of the volatile oils in the temperature of 298 k was 8.74 years.The effect of antibacterial growth inhibition of the volatile oils (0.6%) was similar to chloromycetin (0.01%).Conclusion：Thevolatile oils is stable and has obvious effect of growth inhibition onEscherichiacoli，PseudomnasandTaphylococcusareus.

Ixeris debilis A.Gray；volatile oils；extract；stability；Bacteriostatic action

] 孫曉麗，副主任藥師，研究方向：中藥新藥研究；e-mail：xiaoli_sunbaoding @163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.028

2016-12-03)

*[