蘇春燕，魏江春，，胡永建，，羅毅，高微微*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，河南 鄭州 450002)

·中藥農(nóng)業(yè)·

三種根類藥材上污染真菌的分離方法優(yōu)化△

蘇春燕1，魏江春1，2，胡永建1，3，羅毅1，高微微1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京100193；2.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽110016；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，河南 鄭州450002)

目的：優(yōu)化藥材上主要污染真菌的分離方法，并分析三七、柴胡和黨參的污染真菌情況。方法：采用L9(34)正交實驗方法結(jié)合稀釋平板法考察藥材種類(A)、搖床轉(zhuǎn)速(B)、振搖時間(C)和培養(yǎng)基種類(D)對真菌總數(shù)、曲霉菌和青霉菌分離效果的影響，曲霉菌和青霉菌根據(jù)形態(tài)進行鑒定。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法(UPLC-MS/MS)檢測三種藥材上黃曲霉毒素(AFs)的污染情況。結(jié)果：藥材上真菌總數(shù)和曲霉菌的最優(yōu)分離條件為轉(zhuǎn)速130r·min-1，振搖時間15min，YES培養(yǎng)基；青霉菌的最優(yōu)分離條件為轉(zhuǎn)速160r·min-1，振搖時間30min，PDA培養(yǎng)基。黨參上的真菌總數(shù)高于三七和柴胡，三種藥材上曲霉菌數(shù)均高于青霉菌數(shù)。柴胡上檢測到黃曲霉毒素B1的含量為4.54μg·kg-1，三七和黨參上未檢出AFs。結(jié)論：分離條件對分離結(jié)果有一定影響，三種藥材上曲霉屬真菌的污染值得重視。

三七；柴胡；黨參；真菌總數(shù)；曲霉；青霉；正交實驗

中藥材在生產(chǎn)、加工和儲藏過程中容易受到真菌污染出現(xiàn)發(fā)霉的現(xiàn)象，從而影響藥材質(zhì)量，霉菌中的曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)中的一些種可以產(chǎn)生黃曲霉毒素(AFs)、赭曲霉毒素、展青霉素、桔霉素等真菌(霉菌)毒素[1-2]，進而影響中藥材的安全。

菌株分離是污染真菌研究中的第一個環(huán)節(jié)，在以往文獻報道中，中藥材表面真菌的分離多參考糧食、堅果等振搖式分離結(jié)合稀釋平板培養(yǎng)的方法，采用搖床轉(zhuǎn)速從60 r·min-1到130 r·min-1不等[3-4]，振搖時間從3 min到30 min不等[3，5-7]，選用的培養(yǎng)基也有所不同[8-10]，尚沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本文采用正交實驗設(shè)計，分析不同的分離條件對藥材表面污染真菌，特別是青霉屬和曲霉屬真菌分離效果的影響，旨在建立根類藥材表面真菌的適宜分離方法，為藥材上產(chǎn)毒真菌及后續(xù)的真菌毒素研究提供方法學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1供試藥材

三七和柴胡飲片，購自河北安國市藥材交易大廳，貯藏時間為2年；黨參藥材于購自湖北板橋縣黨參種植基地的藥材倉庫，貯藏時間1年。3種藥材各購買1kg，用無菌密封袋獨立密封，放置于室溫下，1周內(nèi)完成分離及檢測。

1.2正交實驗設(shè)計

采用L9(34)正交實驗，設(shè)計藥材種類(A)、轉(zhuǎn)速(B)、處理時間(C)和分離培養(yǎng)基(D)4個因素，每個因素各設(shè)3個水平，制定因素水平表(表1)，以真菌總數(shù)，曲霉屬和青霉屬真菌數(shù)為指標(biāo)，確定藥材上污染真菌的最佳分離方法。

表1 正交實驗因素水平表L9(34)

1.3培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基(200g土豆，20g葡萄糖，15g瓊脂，1000mL蒸餾水)，MEA培養(yǎng)基(20g麥芽浸粉，20g葡萄糖，1g蛋白胨，15g瓊脂，1000mL蒸餾水)，酵母蔗糖培養(yǎng)基(YES)(20g酵母浸粉，150g蔗糖，0.5gMgSO4·7H2O，20g瓊脂，1000mL蒸餾水)，于121℃滅菌30min。

1.4真菌分離及培養(yǎng)

采用稀釋平板法進行污染菌分離。將每種藥材充分混勻，稱取10g藥材，加入含90mL無菌水的三角瓶中，放置到搖床(ZWY-240，上海智城分析儀器制造有限公司)上，按正交實驗設(shè)計進行不同轉(zhuǎn)速和不同振搖時間處理。振搖結(jié)束后靜置5min，將上清液進行10倍梯度稀釋，至濃度為10-4。分別取原液和各濃度稀釋液1mL，接種于不同培養(yǎng)基上，每個濃度設(shè)5個重復(fù)。接種后的平板于25℃恒溫培養(yǎng)3d。選擇每個平板上的菌落數(shù)在10～60個范圍的濃度用于菌落計數(shù)。

1.5真菌形態(tài)學(xué)鑒定

將純化的菌株，接種于MEA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7d，觀察菌落形態(tài)和顯微形態(tài)，參考《中國真菌志》[11-12]，鑒定曲霉屬和青霉屬真菌，并分別記錄各自菌落數(shù)。

1.6黃曲霉毒素(AFs)提取及含量測定

藥材樣品于50℃烘干至恒重，粉碎。精密稱取10g藥材粉末，加入50mL85%甲醇，超聲提取30min，抽濾，濾液用氮氣吹干，殘渣用2mL甲醇溶解，于6000r·min-1離心5min，所得上清溶液用水定容到5mL后過C18柱凈化，洗脫液用氮氣吹干，殘渣溶解至1mL甲醇中，用0.22μm尼龍濾膜過濾，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)檢測AFs的含量。UPLC-MS/MS采用ShimadzuLC20ADXR液相色譜儀(日本島津公司)串聯(lián)5500QTRAP質(zhì)譜儀(美國ABSciex公司)。色譜柱采用ZORBAXElipseC18反相柱(50mm×2.1mm，1.8μm，美國安捷倫科技有限公司)，流動相為(A)0.1%甲酸+5mmol·L-1乙酸銨水溶液-(B)0.1%甲酸乙腈，洗脫梯度為0.00～4.00min(70%～20%B)；4.00～5.00min(20%～70%B)；5.00～6.00min(70%B)，流速0.2mL·min-1，柱溫30℃，進樣量5μL。質(zhì)譜條件為正離子模式，電噴霧離子源(ESI)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電噴霧電壓5500V；離子源溫度550℃。用于定量AFs分子的離子對信息：AFB1為m/z313.0～285.1，m/z313.0～241.3，m/z313.0～185.1；AFB2為m/z315.0～259.0，m/z315.0～287.0，m/z315.0～243.0；AFG1為m/z329.0～243.0，m/z329.0～311.0，m/z329.0～283.0；AFG2為m/z331.0～235.1，m/z331.0～257.0，m/z331.0～189.0[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1分離方法的優(yōu)化結(jié)果

正交實驗結(jié)果表明，4個因素對污染真菌的分離效果有較大影響。對于真菌總數(shù)，極差值(R1)A>B>C>D，說明藥材種類(A)是影響真菌總數(shù)的決定因素，即不同藥材受污染的程度有較大差異；搖床轉(zhuǎn)速(B)次之，再次為振搖時間(C)，培養(yǎng)基(D)的影響最小(表2)。對于曲霉菌數(shù)，極差值(R2)D>C>A>B，表明培養(yǎng)基種類和振搖時間的影響大于藥材種類和轉(zhuǎn)速(表2)。對于青霉菌數(shù)，極差值(R3)A>D>C>B，表明藥材種類是主要因素，培養(yǎng)基種類次之，轉(zhuǎn)速和振搖時間的影響較小(表2)。綜合分析，確定分離藥材上總真菌和曲霉的最佳分離方法為B2C1D3，即轉(zhuǎn)速為130r·min-1，振搖時間為15min，培養(yǎng)基為YES。青霉的最佳分離方法為B3C2D1，即轉(zhuǎn)速為160r·min-1，振搖時間為30min，培養(yǎng)基為PDA。方差分析表明4個因素的影響均不顯著(表3)。

表2 正交實驗結(jié)果

2.2三種藥材的污染真菌對比

從三七，柴胡和黨參三種藥材樣品上均分離到真菌，真菌污染率為100%(表2)，所有樣品上的真菌總數(shù)均大于103cfu·g-1。黨參上的真菌總數(shù)多于三七和柴胡。柴胡和黨參上均分離到了曲霉屬和青霉屬真菌，且不同處理方法得到的曲霉菌數(shù)大于青霉菌數(shù)；從三七樣品上只分離到曲霉屬真菌(表2)。

表3 正交實驗方差分析結(jié)果

注：F(2，2)=19.0。

2.3分離方法對3種藥材分離結(jié)果的影響

將柴胡的3個處理組(4、5、6)進行對比，真菌總數(shù)、曲霉菌數(shù)和青霉菌數(shù)在不同處理組間的差異較大(表2)，說明柴胡上的真菌分離結(jié)果受分離方法的影響較大；黨參的情況也類似。然而三七的不同處理組間分離到的真菌總數(shù)和曲霉菌數(shù)差異較小，說明分離方法對三七表面真菌分離的結(jié)果影響較小。可能是三七表面較光滑，且質(zhì)地堅硬，真菌孢子一般被局限在藥材表面，且容易脫落，搖床轉(zhuǎn)速和振搖時間的改變對污染真菌的分離效果影響較小。

2.4三種藥材上AFs的含量

從柴胡樣品上檢測到黃曲霉毒素B1(AFB1)，含量為4.54μg·kg-1，未檢測到黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2)；三七和黨參樣品上均未檢出以上4種毒素。

3 討論

根類藥材飲片一般表面粗糙，結(jié)構(gòu)上木質(zhì)纖維多，有較大的間隙，附著的真菌孢子往往不容易被分離。本實驗選擇三七、柴胡和黨參等3種表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的根類藥材，采用正交實驗的方法，優(yōu)化藥材上污染真菌的分離條件，并考察藥材上真菌污染情況。實驗結(jié)果表明，針對真菌總數(shù)、曲霉菌數(shù)和青霉菌數(shù)，各因素對分離結(jié)果的影響大小順序不同。對于真菌總數(shù)和青霉菌來說，藥材種類為主要影響因素，說明污染真菌受寄主影響較大；對于曲霉菌來說，培養(yǎng)基種類為主要因素，說明曲霉屬真菌對營養(yǎng)條件的要求更為嚴(yán)格，張初署等[13]報道黃曲霉在高鹽分的培養(yǎng)基上生長旺盛，YES培養(yǎng)基因具有高糖和高鹽的特點，可能是中藥材上曲霉屬真菌比較好的分離培養(yǎng)基。另外，實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速及振搖時間并不是越長越好，兩者的增加可能會因為加大了真菌孢子與藥材和三角瓶壁的碰撞力度，造成孢子細胞被破壞而喪失活力。

分析三種藥材上真菌污染情況，黨參的三個處理得到的真菌總數(shù)最多，這可能跟藥材來源于湖北，經(jīng)過夏季高溫高濕的貯藏條件及質(zhì)地有關(guān)。本文中三七上的優(yōu)勢屬為曲霉屬，宋美芳等[14]報道三七在西雙版納儲藏6個月后的優(yōu)勢屬為擬青霉屬(Paecilomyces)；王文麗等[5]從黨參上只分離到一株散囊屬真菌(Eurotium)和一株青霉屬真菌；以上文獻中的結(jié)果與本實驗結(jié)果不同，可能與藥材的采集地，及貯藏的條件不同有關(guān)。柴胡上污染真菌的情況以往未見報道。

三種藥材的毒素測定結(jié)果表明，僅柴胡上檢測到含AFB1(4.54μg·kg-1)，以往也有研究者[15-16]檢測到柴胡上有AFB1污染，且污染水平大于10μg·kg-1，本文在三七上未檢測到AFs，與鄭榮等[17]的結(jié)果一致；在黨參上未檢測到AFs污染，與郝愛魚等[18]的結(jié)果一致，而譚婧等[19]曾檢測到黨參上有AFG2的污染，達到為471μg·kg-1。結(jié)合藥材上真菌污染情況，雖然黨參上真菌總數(shù)和曲霉菌數(shù)較多，卻沒有檢測到AFs，原因是AFs主要來源于曲霉屬中的黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)，而本實驗對分離的真菌沒有鑒定到種，黨參上分離得到的曲霉菌可能不是產(chǎn)毒菌，但不排除產(chǎn)毒菌的存在。柴胡上的AFs污染需要引起重視，應(yīng)該加強產(chǎn)毒菌的相關(guān)研究。在接下來的工作中，需要對得到真菌做進一步種水平上的鑒定。

[1] Varga J，Baranyi N，Chandrasekaran M，et al.Mycotoxin producers in theAspergillusgenus：an update[J].Acta Biologica Szegediensis，2015，59(2)：151-167.

[2] Frisvad J C，Smedsgaard J，Larsen T O，et al.Mycotoxins，drugs and other extrolites produced by species inPenicilliumsubgenusPenicillium[J].Stud Mycol，2004，49：201-241.

[3] 宋美芳，陳娟，李學(xué)蘭，等.云南地區(qū)三七和草果上真菌污染的初步分析[J].中國中藥雜志，2012，37(12)：1734-1737.

[4] Vitullo M，Ripabelli G，F(xiàn)anelli I，et al.Microbiological and toxicological quality of dried herbs[J].Lett Appl Microbiol，2011，52(6)：573-580.

[5] 王文麗，徐暉，陳慧芝，等.15種中藥材表面污染真菌的分離與分子鑒定[J].中國中藥雜志，2013，38(12)：1910-1914.

[6] Hashem M，AlamriS.Contamination of common spices in Saudi Arabia markets with potential mycotoxin-producing fungi[J].Saudi J Boil Sci，2010，17(2)：167-175.

[7] Singh P，Srivastava B，Kumar A，et al.Fungal contamination of raw materials of some herbal drugs and recommendation ofCinnamomumcamphoraoil as herbal fungitoxicant[J].Microbial Ecol，2008，56(3)：555-560.

[8] Chen A J，Jiao X，Hu Y，et al.Mycobiota and mycotoxins in traditional medicinal seeds from China[J].Toxins，2015，7(10)：3858-3875.

[9] Ahmad B，Ashiq S，Hussain A，et al.Evaluation of mycotoxins，mycobiota，and toxigenic fungi in selected medicinal plants of Khyber Pakhtunkhwa，Pakistan[J].Fungal Biol，2014，118(9)：776-784.

[10]Zheng R，Wang W，Tan J，et al.An investigation of fungal contamination on the surface of medicinal herbs in China[J].Chin Med，2017，12(1)：1-8.

[11]齊祖同.中國真菌志·曲霉屬及其相關(guān)有性型：第5卷[M].北京：科學(xué)出版社，1997.

[12]孔華忠.中國真菌志·青霉屬及其相關(guān)有性型屬：第35卷[M].北京：科學(xué)出版社，2007.

[13]張初署，劉陽，邢福國，等.七種培養(yǎng)基對黃曲霉分離效果的比較[J].核農(nóng)學(xué)報，2013，27(2)：208-212.

[14]宋美芳，張忠廉，李學(xué)蘭.3種云南主產(chǎn)中藥材上污染真菌在貯藏過程中的變化[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26(4)：955-957.

[15]李汶，莊學(xué)聰.ELISA法檢測常用中藥黃曲霉毒素B1[J].中國藥事，2000，14(2)：101-102.

[16]李延生，陳建民.ELISA試劑盒定量檢測中藥材和中成藥的黃曲霉毒素B1[J].中草藥，2000，31(8)：586-587.

[17]鄭榮，毛丹，王少敏，等.11種中藥材中黃曲霉毒素 G2，G1，B2，B1的 HPLC 法測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41(5)：368-372.

[18]郝愛魚，趙麗元，劉英慧，等.HPLC 柱后光衍生熒光法測定中藥飲片中黃曲霉毒素殘留量[J].藥物分析雜志，2012，32(12)：2203-2207.

[19]譚婧，鄭潤生，王文麗，等.中藥飲片中黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的液質(zhì)聯(lián)用檢測分析[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，23(10)：2469-2472.

OptimizationofIsolationMethodofContaminationFungionThreeRootMedicinalHerbs

SU Chunyan1，WEI Jiangchun1，2，HU Yongjian1，3，LUO Yi1，GAO Weiwei1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110001，China；3.InstituteofAgriculturalQualityStandardsandTestingTechnology，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China)

Objective：To obtain the optimal condition of isolation method of contamination fungi from medicinal herbs，and compare the contaminated fungi onPanaxpseudoginseng，Astragalusmembranaceus，andCodonopsispilosula.Methods：According to the orthogonaltest L9(34)，the effect of four factors including herb species (A)，shaking speed (B)，shaking time (C) and medium (D) on the fungal counts of total fungi，AspergillusandPenicilliumwere measured by using the dilution plating method.All isolates ofAspergillusandPenicilliumwere identified based on morphological criteria using macro- and micro-characters.The root samples were further tested for aflatoxins using UPLC-MS/MS.Results：The optimal isolation method for both total fungi andAspergilluswas 130 r·min-1of shaking speed，15 min of shaking time，and YES medium.The optimal isolation method forPenicilliumwas 160 r·min-1of shaking speed，30 min of shaking time，and PDA medium.The fungal count of total fungi onC.pilosulawas higher than that of the other two root medicinal herbs.Moreover，the fungal count ofAspergilluson three root medicinal herbs were higher than that ofPenicillium.With respect of aflatoxins occurrence，A.membranaceuswas contaminated with AFB1at concentration of 4.54 μg·kg-1，while no AFs were detected fromP.pseudoginsengandC.pilosula.Conclusion：The isolation method affected fungi isolation results.The contamination of three herbs withAspergillusshould be paid more attention.

Panaxpseudoginseng；Astragalusmembranaceus；Codonopsispilosula；fungal count；Aspergillus；Penicillium；orthogonal test

國家自然科學(xué)基金(81274071和81473345)；國家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項目(ZYBZH-Y-JIN-34)

] 高微微，研究員，研究方向：中藥質(zhì)量與安全、中藥資源生態(tài)、藥用植物病理；Tel：(010)57833423，E-mail：wwgao411@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.019

2017-02-13)

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