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(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

低聚半乳糖對植物乳桿菌生長及部分代謝的影響

孫思睿,張晟,孟祥晨*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

以一株能產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌KLDS1.0391為研究對象,將MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖用等量的低聚半乳糖替代,采用體外發(fā)酵方式,研究37 ℃培養(yǎng)36 h過程中活菌數(shù)、pH和滴定酸度的變化,同時(shí)分別測定培養(yǎng)28 h和24 h時(shí)有機(jī)酸和細(xì)菌素的產(chǎn)量。結(jié)果表明:隨培養(yǎng)時(shí)間的延長,培養(yǎng)物的pH先迅速下降,至12 h后下降速度逐步平穩(wěn),以低聚半乳糖作為碳源時(shí)促生長作用顯著高于葡萄糖(p<0.05),且菌體衰退較為緩慢。而且該菌株代謝低聚半乳糖時(shí)所產(chǎn)生的有機(jī)酸及抑菌活性均更高,其中有機(jī)酸主要為乳酸、乙酸和丙酸。

植物乳桿菌,增殖,有機(jī)酸,細(xì)菌素

植物乳桿菌屬于乳桿菌屬,大都從植物中分離獲得,有廣泛用途。植物乳桿菌KLDS1.0391是一株分離自內(nèi)蒙古天然發(fā)酵乳制品——焦克的乳酸菌,經(jīng)鑒定后,保藏于國家工業(yè)微生物菌種保藏中心(CGMCC No.3151)。該菌對模擬消化道環(huán)境具有較好的耐受性,也有良好的益生特性[1],能代謝合成細(xì)菌素,該細(xì)菌素耐酸耐熱性能良好,對G+和G-細(xì)菌的生長均具有較強(qiáng)的抑制作用[2]。低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)由半乳糖與葡萄糖主要經(jīng)β-1,6糖苷鍵連接而成,是一種益生元,在上消化道不能被消化吸收,可作為持續(xù)碳源[3],在下消化道促進(jìn)乳桿菌和雙歧桿菌增殖,維持菌群平衡,改善腸道環(huán)境[4]。

目前關(guān)于植物乳桿菌利用低聚糖的研究,主要是將低聚糖作為全部或部分碳源,進(jìn)而分析其促生長作用及相關(guān)益生特性。向培養(yǎng)基中添加一定量的水蘇糖可促進(jìn)植物乳桿菌RB1的增殖作用[5];很多時(shí)候,與相同濃度的葡萄糖相比,適量添加低聚糖對儲藏期內(nèi)或者極酸性胃液環(huán)境下的菌體能起到很好的保護(hù)作用[6]。除此之外,植物乳桿菌C88與人參多糖的聯(lián)合可顯著調(diào)節(jié)抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)活性[7],而植物乳桿菌Sc52和牛蒡低聚果糖的聯(lián)合則能明顯地改善和治療Ⅱ型糖尿病[8]。

對于能產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌,低聚糖不僅可以促進(jìn)其生長,還可以影響細(xì)菌素的合成量。已經(jīng)發(fā)現(xiàn):碳源、氮源組成以及磷酸鹽濃度等[9]都顯著影響乳酸鏈球菌素nisin的合成,菊糖刺激副干酪乳桿菌CMGB16分泌細(xì)菌素[10],也有實(shí)驗(yàn)表明:低聚糖可以有效地調(diào)節(jié)微生物的生長,同時(shí)刺激細(xì)菌素的產(chǎn)生[11],但是低聚糖、菌株的個(gè)體差異性會導(dǎo)致產(chǎn)生不同的效果,而且尚不清楚具體機(jī)制。

低聚半乳糖是目前唯一一種能夠被八大有益菌利用的低聚糖,前期在比較不同低聚糖對植物乳桿菌代謝影響時(shí),發(fā)現(xiàn):低聚半乳糖對植物乳桿菌促生長作用最強(qiáng),但是還不清楚植物乳桿菌KLDS1.0391對低聚半乳糖的代謝特點(diǎn)以及低聚半乳糖如何影響該菌細(xì)菌素合成。因此,本研究將以植物乳桿菌KLDS1.0391為研究對象,進(jìn)一步研究其對低聚半乳糖的代謝特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部乳品科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保藏;枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC6633 購自中國藥品生物制品檢定所;MRS培養(yǎng)基:配制方法參照文獻(xiàn)[12];改良MRS培養(yǎng)基(modified MRS,mMRS):將MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖用等量的低聚半乳糖代替,其余成分均相同;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏5 g,氯化鈉10 g,蒸餾水1 L。pH調(diào)至7.4;標(biāo)準(zhǔn)酸(乳酸、乙酸、丙酸)色譜純 Sigma公司;濃硫酸 天津化學(xué)試劑一廠;低聚半乳糖 上海源葉生物(S11138-100 g,BR,98%);過氧化氫酶 Sigma公司。

高效液相色譜儀Waters2695 Waters公司;色譜柱HPX-87H,BIO-RAD;微孔濾膜0.22 μm MILLIPORE公司;KQ-800GKDV超聲波水浴儀 昆山市超聲儀器有限公司;LGJ-1冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠;GL-21高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所;Delta320pH計(jì) 瑞士梅特勒托利多有限公司;HVE-8D全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化與培養(yǎng) 將于-80 ℃冰箱中保藏的植物乳桿菌KLDS1.0391和枯草芽孢桿菌ATCC6633分別在MRS培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中活化傳代3次后,置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)16 h,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2 活菌數(shù)的測定 采用平板菌落計(jì)數(shù)法[13],選取適宜的稀釋梯度,計(jì)算其不同生長時(shí)期的活菌數(shù)。

1.2.3 pH及滴定酸度測定 分別采用pH計(jì)直接測定pH和氫氧化鈉滴定法測量滴定酸度。

1.2.4 有機(jī)酸含量測定 通過高效液相色譜法測定培養(yǎng)物中乳酸、乙酸和丙酸的含量。

色譜條件:流動(dòng)相5 mmol/L硫酸,在使用前進(jìn)行超聲處理30 min,參數(shù)設(shè)定為流速0.5 mL/min,柱溫55 ℃,進(jìn)樣量20 μL。取發(fā)酵液經(jīng)離心過濾膜后注射于樣品瓶中待測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精確配制不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品,經(jīng)HPLC確定出各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 抑菌活性的測定 先將培養(yǎng)至一定時(shí)間的菌液離心得到無細(xì)胞發(fā)酵上清液,隨即用6 mmol/L氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至6.5來排除有機(jī)酸的干擾,并向上清液中添加已配制好的過氧化氫酶乙酸鈉溶液,于37 ℃水浴鍋中水浴2 h以排除過氧化氫的干擾。處理后的上清液過濾膜后冷凍干燥,用無菌水將凍干樣品復(fù)溶,采用雙層平板打孔法測定抑菌活性[14]。

1.2.6 低聚半乳糖對植物乳桿菌生長的影響 將植物乳桿菌以2%的接種量分別接種到MRS和mMRS培養(yǎng)基中,在37 ℃下培養(yǎng)36 h,并每隔4 h取樣一次,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),繪制出該菌株的生長曲線,同時(shí)計(jì)算對數(shù)生長期的生長速率。

1.2.7 植物乳桿菌代謝低聚半乳糖產(chǎn)生有機(jī)酸分析 根據(jù)滴定酸度曲線,取培養(yǎng)至28 h的酸度恒定時(shí)的上清液經(jīng)一系列處理后進(jìn)行HPLC分析,測定主要有機(jī)酸的種類及產(chǎn)量。標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度為橫坐標(biāo),峰面積值為縱坐標(biāo)[15]。

1.2.8 植物乳桿菌代謝低聚半乳糖產(chǎn)細(xì)菌素分析 通過課題組的前期研究[16],當(dāng)培養(yǎng)至24 h左右細(xì)菌素的產(chǎn)量基本趨于穩(wěn)定,因此在本實(shí)驗(yàn)中選擇該時(shí)間點(diǎn)來比較該菌株在兩種培養(yǎng)基中抑菌活性的強(qiáng)弱。

1.3數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用SPSS 17.0對結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1植物乳桿菌KLDS1.0391在含低聚半乳糖MRS培養(yǎng)基中的生長

植物乳桿菌KLDS1.0391分別以低聚半乳糖和葡萄糖作為碳源時(shí),培養(yǎng)36 h的生長情況見圖1。

圖1 植物乳桿菌在兩種含糖培養(yǎng)基中生長情況Fig.1 The growth of Lactobacillus plantarum in two sugar-containing medium

從圖中可以看出,植物乳桿菌KLDS1.0391在MRS培養(yǎng)基中生長時(shí),無明顯遲滯期,0～4 h生長速度較快,并于培養(yǎng)12 h時(shí)活菌數(shù)最高,達(dá)1.64×109CFU/mL,隨后數(shù)量逐漸減少,其在對數(shù)期的生長速率為0.6245 h-1。而在含低聚半乳糖的mMRS培養(yǎng)基中,雖然有較為明顯的適應(yīng)期,但進(jìn)入對數(shù)期后生長速率較MRS培養(yǎng)基快,為0.7271 h-1,并在培養(yǎng)20 h時(shí)活菌數(shù)最高為5.5×109CFU/mL。此外,在mMRS中衰亡期開始時(shí)間晚于對照組,且其衰亡速度與MRS培養(yǎng)基相比也較為緩慢。至培養(yǎng)結(jié)束時(shí),在MRS培養(yǎng)基和mMRS培養(yǎng)基中的活菌數(shù)分別為:3.4×108CFU/mL和1.42×109CFU/mL。此結(jié)果說明:低聚半乳糖對植物乳桿菌KLDS1.0391不僅有明顯的促增殖作用,且在含低聚半乳糖培養(yǎng)基中生長的菌體衰亡更為緩慢。

2.2植物乳桿菌在含低聚半乳糖培養(yǎng)基中生長時(shí)pH及滴定酸度的變化

植物乳桿菌分別在MRS和mMRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h過程中的產(chǎn)酸情況見圖2。

圖2 植物乳桿菌在兩種含糖培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸情況Fig.2 The acid production of Lactobacillus plantarum in two sugar-containing medium

MRS和mMRS培養(yǎng)基初始pH為5.48,接菌培養(yǎng)后,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,pH迅速降低,滴定酸度快速升高,并于培養(yǎng)16 h后產(chǎn)酸變化速度逐漸變緩,在培養(yǎng)至28 h時(shí)產(chǎn)酸量趨近穩(wěn)定,此時(shí)pH分別為3.66和3.61,滴定酸度為210.276 °T和224.136 °T。在整個(gè)培養(yǎng)期間,兩實(shí)驗(yàn)組滴定酸度及pH變化無顯著差異(p>0.05)。

2.3植物乳桿菌在不同培養(yǎng)基中生長時(shí)產(chǎn)生的主要有機(jī)酸

植物乳桿菌分別在MRS和mMRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期28 h,取培養(yǎng)上清液,處理后采用高效液相色譜法測定乳酸、乙酸和丙酸的量,結(jié)果見表1。

表1 植物乳桿菌代謝兩種糖產(chǎn)生主要有機(jī)酸的量Table 1 The contents of organic acids produced by Lactobacillus plantarum in two sugar-containing medium

注:同行數(shù)據(jù)字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):植物乳桿菌代謝低聚半乳糖后,所產(chǎn)生的乳酸、乙酸和丙酸均顯著高于代謝葡萄糖時(shí)所產(chǎn)生的量,且代謝產(chǎn)生有機(jī)酸中乳酸量最高,其次是乙酸和丙酸。

2.4低聚半乳糖對植物乳桿菌KLDS1.0391抑菌活性的影響

植物乳桿菌KLDS1.0391在mMRS和MRS培養(yǎng)基中生長24 h后,所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌圈分別為(11.41±0.03) mm和(10.38±0.02) mm(p<0.05),說明該菌株在含低聚半乳糖培養(yǎng)基中生長時(shí),更利于其細(xì)菌素的合成。

3 討論

無論是體外還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn),都證實(shí)低聚糖對乳桿菌具有良好的促增殖作用,且相比之下,低聚半乳糖的效果最優(yōu)[17],本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了低聚半乳糖對植物乳桿菌KLDS1.0391有促增殖作用,同時(shí)延緩其衰亡速度。

乳酸菌是一類可以發(fā)酵碳水化合物從而產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌,其代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸主要為乳酸,其次是各種短鏈脂肪酸,主要包括甲酸、乙酸、丙酸和丁酸。本研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌KLDS1.0391在利用低聚半乳糖后所產(chǎn)生的乳酸、乙酸和丙酸的量都有所提高。不同種屬在不同的發(fā)酵時(shí)間以及低聚糖添加量不同的情況下,產(chǎn)生有機(jī)酸的種類和比例差異較大。例如向干酪乳桿菌的培養(yǎng)基中添加0.5%低聚果糖(F)、1.5%低聚果糖(F)、3%低聚果糖(F)和0.5%葡萄糖(G),在培養(yǎng)的任意時(shí)間段,乳酸產(chǎn)量均是低聚果糖培養(yǎng)基高于葡萄糖培養(yǎng)基;而就乙酸而言,不同時(shí)間段四種培養(yǎng)基中乙酸產(chǎn)量多少的排列順序各不同,并不是低聚果糖培養(yǎng)基始終高于葡萄糖培養(yǎng)基,例如當(dāng)培養(yǎng)至8 h時(shí),乙酸產(chǎn)量依次為1.5% F、0.5% F<0.5% G<3% F[18]。

本實(shí)驗(yàn)中的植物乳桿菌KLDS1.0391是一株能產(chǎn)細(xì)菌素的菌株,我們研究發(fā)現(xiàn):該菌株能夠利用低聚半乳糖促進(jìn)細(xì)菌素的合成,但具體機(jī)制不清。報(bào)道中也有一些乳酸菌不能有效的利用某些低聚糖,這樣它在生長過程中就會遭受到其自身誘導(dǎo)合成細(xì)菌素的脅迫[19]。Reminta[20]等人在研究中選用三種低聚糖分別與不同菌株聯(lián)合培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)菌株LL2在以葡萄糖作為碳源時(shí)菌體密度雖為α環(huán)狀糊精為碳源時(shí)的二倍,但是其抑菌活性明顯低于環(huán)狀糊精,且8 h后效價(jià)下降明顯,這表明促生長作用強(qiáng)并不一定能促進(jìn)細(xì)菌素的合成。而Muoz等人[21]的研究結(jié)果表明某些乳酸桿菌在含低聚果糖的培養(yǎng)基中生長時(shí)活菌數(shù)以及細(xì)菌素的產(chǎn)量均高于在葡萄糖培養(yǎng)基中。細(xì)菌素的產(chǎn)生與乳酸菌的生長呈現(xiàn)出一定相關(guān)性[22],但是不同乳酸菌的生長曲線以及代謝產(chǎn)生細(xì)菌素的規(guī)律也會略有差異,這可能是由于菌株不同所產(chǎn)生的個(gè)體差異,且研究中所利用的底物低聚糖也不同,因而會造成不同的變化規(guī)律。而在本實(shí)驗(yàn)中,低聚半乳糖不僅對植物乳桿菌KLDS1.0391有促生長作用,同時(shí)還會促進(jìn)其細(xì)菌素的合成。下一步我們將會深入挖掘其中所涉及的機(jī)制。

4 結(jié)論

低聚半乳糖對植物乳桿菌KLDS1.0391具有顯著的促生長作用,并且能夠有效延緩該菌株在生長后期的衰亡。植物乳桿菌KLDS1.0391在代謝低聚半乳糖時(shí)產(chǎn)生的有機(jī)酸量以及抑菌活性均顯著高于葡萄糖,其中所涉及的機(jī)理仍有待于進(jìn)一步研究。

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InfluenceofgalactooligosaccharidesonthegrowthandmetabolismofLactobacillusplantarum

SUNSi-rui,ZHANGSheng,MENGXiang-chen*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultrual University,Harbin 150030,China)

InLactobacillusplantarumKLDS1.0391 which can produce the bacteriocins,the effect of galactooligosaccharides(GOS)which substituted for glucose in MRS media were studiedinvitrofermentation. The titratable acidity,pH value and amounts of viable bacteria were determined during fermentation of 36 h at 37 ℃ in both of MRS and mMRS(GOS substituted for glucose). The contents of organic acids and bacteriocins were also determined at the cultivation of 28 h and 24 h respectively. The results showed that the pH value decreased rapidly with the cultivation and then changed sloely after cultivation of 12 h,and the growth-stimulating effect of galactooligosaccharides(GOS)was significantly higher than that of glucose(p<0.05),meanwhile the decline was slower. Moreover,the concentrations of organic acids and antimicrobial activity of the bacteriocins in mMRS were higher than that in MRS,and the main organic acids were lactate,acetate and propionate.

Lactobacillusplantarum;proliferation;organic acids;bacteriocins

2017-02-21

孫思睿(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：siruiSun@126.com。

*通訊作者:孟祥晨(1970-)，女，博士，教授，研究方向：乳品科學(xué)及食品微生物，E-mail：xchmeng@163.com。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(3167101455)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0095-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.019