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不同處理條件對馬鈴薯糖蛋白Patatin構象的影響研究

2017-09-21 06:14,,,
食品工業(yè)科技 2017年17期
關鍵詞:構象緩沖液尿素

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(1.哈爾濱商業(yè)大學旅游與烹飪學院,黑龍江 哈爾濱150000;2.黑龍江出入境檢驗檢疫局技術中心,黑龍江 哈爾濱 150001;3.哈爾濱商業(yè)大學旅游與烹飪學院,黑龍江 哈爾濱150000;4.東北農業(yè)大學食品學院,黑龍江 哈爾濱150030)

不同處理條件對馬鈴薯糖蛋白Patatin構象的影響研究

孫瑩1,魏冬旭2,姚春艷3,江連洲4

(1.哈爾濱商業(yè)大學旅游與烹飪學院,黑龍江 哈爾濱150000;2.黑龍江出入境檢驗檢疫局技術中心,黑龍江 哈爾濱 150001;3.哈爾濱商業(yè)大學旅游與烹飪學院,黑龍江 哈爾濱150000;4.東北農業(yè)大學食品學院,黑龍江 哈爾濱150030)

運用熒光和圓二色光譜手段研究了不同物理和化學條件處理后,馬鈴薯糖蛋白Patatin二級和三級結構的變化。結果表明:當pH4~5時,Patatin的二級結構以α-螺旋為主。當pH6~9時,Patatin的二級結構以β-折疊為主;隨著pH增加,熒光強度下降,最大發(fā)射波長藍移,并且pH對Patatin結構的影響是可逆的;在溫度為20~60 ℃時,Patatin的二級結構以β-折疊結構為主,當溫度達到80 ℃時,Patatin的二級結構以無規(guī)則卷曲結構為主;隨著溫度升高,熒光強度下降,最大發(fā)射波長紅移;當Patatin處于不同濃度的DTT環(huán)境時熒光強度下降,當Patatin處于不同濃度的尿素環(huán)境時熒光強度增加,出現(xiàn)紅移。在變性劑存在條件下,無規(guī)則卷曲結構逐漸取代β-折疊結構成為含量最多的構型。

Patatin,空間構象,熒光光譜,圓二色光譜

Patatin占馬鈴薯塊莖中可溶性蛋白的40%左右[1-2],是一種具有多種生理功能的天然糖蛋白,如抗氧化和抗腫瘤增殖活性,所以引起了研究者的廣泛興趣[3-5]。在一定環(huán)境下,蛋白質會因為帶電基團的定位及基團間的靜電作用,發(fā)生構象變化,從而使其功能性質發(fā)生變化。Kelly[6]等研究表明尿素和鹽酸胍可以引起蛋白質折疊展開。然而不同處理條件對馬鈴薯糖蛋白Patatin結構的影響還不十分清楚。

熒光光譜技術是觀測蛋白質構象變化動力學過程的一種重要工具[7-8]。蛋白質的內源熒光主要是由Trp和Tyr殘基所發(fā)射[9]。熒光強度和最大吸收波長的改變反應了色氨酸殘基的變化程度和所處的微環(huán)境的變化。蛋白質變性的過程就是其內部的疏水性氨基酸逐漸向外暴露的過程,所以可以借助于疏水性較強的色氨酸或酪氨酸殘基的微環(huán)境變化來預測蛋白質表面疏水性的變化以對其變性過程進行動態(tài)研究[10-11]。蛋白質是鏈狀生物大分子,通過氨基酸分子構成,天然狀態(tài)的蛋白質分子通常不以長鏈分子的狀態(tài)存在,而是長鏈分子折疊后形成的具有一定規(guī)律的三維結構。蛋白質主鏈的構象代表蛋白質的二級結構,有四種空間結構,分為α-螺旋,β-折疊,β-轉角和無規(guī)卷曲[12-13]。蛋白質的圓二色性是由其酰胺鍵(肽鍵)的相互作用引起的,可在190~250 nm的紫外區(qū)段來測量蛋白質的圓二色譜。不同的蛋白質二級結構,引起不同的酰胺鍵的相互作用,產生不同的圓二色光譜特征[13]。目前由于圓二色譜具有信息量大,干擾小,結果更直觀等特點,已經成為測定生物大分子結構的有力手段。

本研究利用熒光光譜和圓二色譜分析馬鈴薯糖蛋白Patatin在不同pH、溫度、尿素和DDT誘導下二級和三級結構的變化,旨在準確地表征蛋白質構象,為今后研究馬鈴薯蛋白質結構和功能的關系奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

馬鈴薯汁水 內蒙古華歐淀粉廠;Con A-Sepharose 4B和Q-Sepharose Fast Flow 美國GE Healthcare公司;鹽酸胍、尿素和DDT Sigma公司,其他所用化學藥品為分析純。

AKTA層析系統(tǒng) 美國GE公司;Jasco-810圓二色光譜儀日本 JASCO公司;F-4500型熒光分光光度計 日本日立公司。

1.2實驗方法

1.2.1 糖蛋白Patatin的制備 以馬鈴薯汁水為原料,采用MWCO 200 kDa超濾膜進行過濾。將超濾截留液干燥后得到的馬鈴薯濃縮蛋白粉進行色譜分離。稱取三份200 mg超濾濃縮蛋白粉分別用pH7的5 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解。10000 r/min離心30 min后取上清液上離子交換Q-Sepharose Fast Flow(1.6 cm×25 cm)柱,用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(溶解樣品時的pH)平衡,收集離子交換穿透峰,再用平衡液沖洗5個柱體積,然后用含1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)B液洗脫。100% B液直接洗脫。收集離子交換洗脫峰。將離子交換洗脫峰濃縮后,上Con A-Sepharose 4B(2.6 cm× 20 cm)柱。用含1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡,用1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡5個柱體積后,改用含0~100 mmol/Lα-甲基-D-葡萄糖苷和1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)C液洗脫。流速為1.5 mL/min。在280 nm下檢測吸光度。收集親和層析洗脫峰,5000 Da超濾離心管離心10 min,干燥后存于-20 ℃冰箱中備用[14]。

1.2.2 熒光光譜測定 參照Rahma等[15]人方法,略作修改。采用F-4500型熒光分光光度計測定Patatin的三級結構變化。激發(fā)波長為295 nm,發(fā)射光檢測范圍為300~400 nm,掃描速度為1200 nm/min,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm,掃描5次。數(shù)據(jù)分析軟件采用FL Solutions 2.0。

1.2.3 圓二色光譜測定 參照李雪琴等[16]人方法,稍作修改。采用遠紫外區(qū)域圓二色光譜研究不同pH對蛋白二級結構的影響。配制一定濃度的蛋白溶液,室溫下將樣品放置1 h。采用Jasco-810圓二色光譜儀在190~250 nm之間掃描,分辨率1 nm,空白為樣品所處的緩沖液,實驗值為5次掃描的均值。蛋白二級結構組成估算軟件為Jasco。

1.2.4 不同pH對Patatin構象的影響 將Patatin分別用pH4、pH5、pH6、pH7、pH8和pH9的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液溶解,用相應的緩沖液調節(jié)pH到精確的值,保證蛋白質的濃度為1 mg/mL,取樣測定不同pH對熒光光譜和圓二色光譜的影響。然后從不同pH的樣品體系中取樣,小心調節(jié)pH為7.0,進行熒光光譜檢測。

1.2.5 不同溫度對Patatin構象的影響 將Patatin用pH7.0,0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液溶解在離心管中,保證蛋白質的濃度為1 mg/mL,然后將離心管分別在20、40、60、80、100 ℃水浴中加熱30 min后迅速放入冰浴中冷卻。取樣測定不同溫度對熒光光譜和圓二色光譜的影響。

1.2.6 不同變性劑對Patatin構象的影響 將Patatin分別用0、2、4、6、8 mol/L尿素(pH7.0,1 mol/L Tris-HCl)和0、2、4、6、8 mmol/L DTT(pH7.0,1 mol/L Tris-HCl)溶液溶解,靜置2 h后取樣測定尿素和DTT對Patatin熒光光譜的影響。并用6 mol/L尿素和2 mmol/L DTT溶解Patatin,靜置2 h后,取樣用于圓二色譜的檢測。

1.3數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復三次,實驗結果用平均數(shù)±SD表示。采用SPSS 12.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理,采用Origin8.0作圖。

2 結果與分析

2.1不同pH對Patatin構象的影響

由圖1可知,在pH4和pH5的酸性環(huán)境下,Trp熒光強度最高,且在pH4 和pH5時的熒光圖譜差別很小。隨著pH的升高,Trp的熒光強度逐漸減弱,在pH9時,幾乎看不到明顯的峰型。實驗測得Trp的最大發(fā)射波長為355 nm,說明在pH4~9范圍內Patatin中的Trp殘基較大程度上位于疏水的環(huán)境中。當pH再次調為7.0時,不同pH環(huán)境中Trp的熒光強度近似一致(圖1)。說明pH引起的側鏈氨基酸殘基微環(huán)境的變化可能是可逆的,但是pH本身也會造成熒光強度的變化[17]。

圖1 不同pH條件下Patatin溶液pH調整為7時的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of Patatin recorded at pH adjusted to pH7

pH對Patatin二級結構含量的影響如圖2所示。當pH<6時,β-折疊結構的含量隨著pH的增加而迅速增加,在pH6時達到最大;當pH>7時,再提高pH對β-折疊結構的含量影響不大;α-螺旋結構的含量隨著pH的升高逐漸下降;無規(guī)則卷曲結構含量逐漸增加;β-轉角在pH7時最低,在pH7兩側輕微增加;在pH4和pH5條件下,α-螺旋和β-折疊結構含量相近,為主要的二級結構類型;在pH6~9范圍內,Patatin的二級結構以β-折疊為主,α-螺旋、β-轉角和無規(guī)則卷曲結構次之。蛋白質分子中α-螺旋和β-折疊的穩(wěn)定性主要取決于分子內部的氫鍵。溶液pH的變化造成蛋白分子的內部氫鍵發(fā)生改變,致使二級結構發(fā)生改變[18-19]。結合熒光光譜分析結果可知,在pH4和pH5條件下的Patatin結構相似;pH6~9條件下的Patatin結構相似。

圖2 不同pH對Patatin二級結構含量的影響Fig.2 Effect of pH on secondary structure content of Patatin

2.2不同溫度對Patatin構象的影響

圖3是不同溫度對Patatin熒光光譜的影響。由圖可知,溫度在20 ℃和40 ℃時,Trp熒光強度變化很小,兩者的峰型相同,最大發(fā)射峰波長相近。在60 ℃時,Trp的熒光強度與20 ℃和40 ℃時相差不大,但是最大發(fā)射波長發(fā)生了輕微紅移。在80 ℃和100 ℃高溫條件下,Trp熒光強度顯著下降,并且發(fā)生顯著紅移。溫度升高,分子間的碰撞加劇,分子內的振動增強,蛋白質分子中不同部位的弱鍵逐漸被破壞,Trp殘基向極性環(huán)境轉移程度增加。溫度升高導致蛋白質分子的空間結構逐步松散,產生紅移[20]。在不同溫度下蛋白質分子處于不同的變性態(tài)能量發(fā)生轉移,另外,在高溫下分子聚集,Patatin構象發(fā)生一定程度的變化,導致熒光猝滅[21]。因此,Patatin內源熒光強度都是隨著溫度升高逐步降低的。

圖3 不同加熱溫度條件下Patatin熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of Patatin recorded at different temperature

圖4 不同溫度對Patatin二級結構的影響Fig.4 Effect of temperature on secondary structure content of Patatin

當Patatin所處體系的溫度低于40 ℃時,α-螺旋、β-折疊、β-轉角以及無規(guī)則卷曲的含量比例變化不大,說明在此范圍內Patatin的結構變化不顯著。當溫度繼續(xù)升高時,α-螺旋含量迅速下降,無規(guī)則卷曲含量迅速增加。當溫度達到80 ℃時,無規(guī)則卷曲結構占主導地位。田素燕[22]采用遠紫外圓二色譜法研究了細胞紅蛋白的環(huán)境溫度對細胞紅蛋白二級結構的影響,溫度達到368 K,它仍保持有20%的α-螺旋結構,說明該蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性。本研究中,Patatin在80 ℃時(353 K)時α-螺旋含量仍然保持在10%以上,在高溫下Patatin仍然具有一定量的二級結構,說明Patatin也是一種高熱穩(wěn)定性蛋白。

2.3不同變性劑對Patatin構象的影響

Patatin經過0、2、4、6、8 mol/L尿素處理后,熒光光譜的變化如圖5所示,在激發(fā)波長295 nm條件下,未經過變性劑處理的Patatin最大發(fā)射波長為341 nm,經過2、4、6、8 mol/L尿素處理后,Patatin最大發(fā)射波長發(fā)生紅移,分別紅移了1、4、5、7 nm。熒光強度從527.6增加為683.9、657.9、805.2和819.2。

圖5 尿素對Patatin熒光光譜的影響Fig.5 Effect of urea on fluorescence spectra of Patatin

尿素能夠破壞Patatin分子中的氫鍵,尿素常被用于蛋白質的解離和亞基的分離,在8 mol/L尿素作用下,大多數(shù)蛋白質由折疊態(tài)變成完全伸展的狀態(tài),尿素通過破壞氫鍵而使蛋白質從有序變?yōu)闊o序,發(fā)生去折疊現(xiàn)象。隨著濃度的增加,熒光強度增加,說明尿素不僅破壞了疏水相互作用,還能促進使Patatin分子中的色氨酸殘基部分暴露在極性環(huán)境中,處于蛋白質分子的表面或者部分位于蛋白質分子表面,從而引起熒光強度和最大發(fā)射波長的改變,使Patatin構象發(fā)生變化,從而使熒光強度增加。

DTT處理對Patatin其熒光光譜的影響如圖6所示。在激發(fā)波長295 nm時,不同濃度的DTT并沒有引起最大發(fā)射波長的改變,但隨著DTT濃度的增加,熒光強度下降。當DTT濃度為2、4、6、8 mmol/L時,熒光強度與未經過DTT處理的溶液相比,分別下降23.1%,40.7%,45.2%和49.5%。蛋白質內部的二硫鍵的數(shù)量影響蛋白質的穩(wěn)定性,DTT主要作用于蛋白質的二硫鍵,使整個蛋白質分子結構變成一種松散的狀態(tài),色氨酸殘基移動向其分子表面,使其構象發(fā)生變化,蛋白質的結構從有序變?yōu)闊o序,色氨酸殘基暴露在極性環(huán)境中,從而引起熒光強度的下降[23-24]。

圖6 DTT對Patatin熒光光譜的影響Fig.6 Effect of DTT on fluorescence spectra of patatin

圖7 變性劑對Patatin二級結構的影響Fig.7 Effect of DTT and urea on secondary structure content of Patatin

考察變性劑對二級結構含量的影響時,選擇6 mol/L尿素和2 mmol/L DTT處理Patatin,并與未經過變性劑處理的Patatin相比較。由圖7可知,Patatin經6 mol/L尿素和2 mmol/L DTT 處理后α-螺旋、β-折疊和β-轉角結構含量大幅度下降,無規(guī)則卷曲結構含量增加,無規(guī)則卷曲含量接近50%,表明經過6 mol/L尿素和2 mmol/L DTT處理后Patatin幾乎完全失去二級結構,蛋白質結構變得更加松散無序,蛋白質發(fā)生變性。α-螺旋、β-折疊和β-轉角穩(wěn)定性主要取決于分子內部氫鍵,當?shù)鞍踪|經過變性劑處理后由于它們能與水分子或者蛋白質分子中游離氨基和羧基形成氫鍵,造成分子內部氫鍵發(fā)生改變,從而對蛋白質二級結構造成巨大破壞[13,22,25]。

3 結論

采用熒光分光光譜和圓二色光譜兩種測試手段,檢測了馬鈴薯糖蛋白Patatin在不同外界條件處理下的二級和三級結構,研究表明:pH會對糖蛋白Patatin的結構產生影響,但影響是可逆的,在pH4和pH5條件下,α-螺旋和β-折疊結構含量相近,為主要的二級結構類型;在pH6~9范圍內,Patatin的二級結構以β-折疊為主;隨著溫度的升高,蛋白質分子中不同部位的弱鍵逐漸被破壞,當溫度達到80 ℃時,主要為無規(guī)則卷曲結構;在變性劑尿素和DDT的處理下,Patatin的二級結構已經發(fā)生顯著變化,特別是尿素對二級結構的影響更加明顯。

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EffectofdifferenttreatmentconditionsontheconformationchangesofPatatin

SUNYing1,WEIDong-xu2,YAOChun-yan3,JIANGLian-zhou4

(1.College of Tourism and Culinary Science,Harbin University of Commerce,Harbin 150000,China;2.Technical Centre of Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine,Harbin 150001,China;3.College of Economics,Harbin University of Commerce,Harbin 150000,China;4.Food College of the Northeast Agriculture University,Harbin 150000,China)

In this study,the tertiary and secondary structures of Patatin under different physico-chemical treatments were investigated by fluorescence and circular dichrosim. Patatin was rich inα-helix at pH4~5,but theα-helix was gradually instead by theβ-sheet at pH6~9. With the increasing pH,the strength of fluorescence became apparently lower. A blue shift in the maximum emission wavelength was observed,and the effect of pH on struction was reversible. Patatin was rich inβ-sheet from 20 ℃ to 60 ℃. When the temperature reached to 80 ℃,the random coil content reached to maximum. With the increasing temperature,the fluorescence intensity decreased signifcantly. A red shift in the maximum emission wavelength was observed and the fluorescence intensity decreased in Patatin treated by DTT but increased by urea. A red shift in the maximum emission wavelength was observed,and theβ-sheet gradually instead by the random coil under the condition of DTT and urea.

Patatin;structure characteristic;fluorescence;circular dichrosim

2016-12-27

孫瑩(1982-),女,博士,講師,研究方向:植物蛋白質的功能性,E-mail:sunying625@163.com。

黑龍江省自然科學基金項目(C2015067);哈爾濱商業(yè)大學青年創(chuàng)新人才項目(2016QN060)。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)17-0080-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.016

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