王青樂， 張志勇， 施裕新， 朱召芹， 馮艷玲， 張興偉， 馮 峰， 張昊凌， 曾蒙蘇， 陳 剛*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院放射科，上海市影像醫(yī)學(xué)研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院影像醫(yī)學(xué)系，上海 2000322.復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心影像科，上海 2015083.南通市腫瘤醫(yī)院影像科，南通 226361

·論著·

Micro-CT對急性肺結(jié)核小鼠模型動態(tài)演變的監(jiān)測價值

王青樂1， 張志勇1， 施裕新2， 朱召芹2， 馮艷玲2， 張興偉1， 馮 峰3， 張昊凌1， 曾蒙蘇1， 陳 剛1*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院放射科，上海市影像醫(yī)學(xué)研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院影像醫(yī)學(xué)系，上海 2000322.復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心影像科，上海 2015083.南通市腫瘤醫(yī)院影像科，南通 226361

目的： 探討micro-CT對急性肺結(jié)核小鼠動態(tài)演變過程的監(jiān)測價值。方法： 用滴鼻法建立急性感染C57BL/6J小鼠肺結(jié)核模型，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，同時設(shè)立對照組。兩組分別在實(shí)驗(yàn)組滴鼻后第1、4、8、12周進(jìn)行micro-CT掃描，并與病理學(xué)檢查結(jié)果對比。結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)組共40只小鼠，死亡9只，3只肺內(nèi)陰性，余28只小鼠分為4個亞組(分別7、6、8、7只)。對照組4亞組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組小鼠感染第1周，71.4%表現(xiàn)為磨玻璃密度影(GGO)，57.1%表現(xiàn)為支氣管充氣征，對應(yīng)病理表現(xiàn)為肺泡腔滲出和肺泡間隔增寬；感染第4周，micro-CT主要表現(xiàn)為GGO和小灶性實(shí)變(66.7%)，對應(yīng)病理表現(xiàn)為肺泡腔滲出和實(shí)變，可見類上皮細(xì)胞、多核巨細(xì)胞和泡沫細(xì)胞；感染第8周，結(jié)節(jié)、支氣管充氣征和實(shí)變3種表現(xiàn)比例相當(dāng)，病理對應(yīng)實(shí)變和結(jié)核小結(jié)；感染第12周，結(jié)節(jié)出現(xiàn)比例最高(57.1%)，對應(yīng)病理表現(xiàn)為結(jié)核肉芽腫形成。結(jié)論： 急性小鼠肺結(jié)核模型的肺部micro-CT及病理動態(tài)演變基本一致，可用于模擬人類肺結(jié)核感染過程，評估疾病進(jìn)程。

肺結(jié)核；動物模型；X線計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)；病理學(xué)

近年來，由于人口老齡化、空氣污染加重、HIV感染率上升及多重耐藥等因素的影響，全球范圍內(nèi)肺結(jié)核發(fā)病率不斷上升，嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。肺結(jié)核的防治成為目前研究的熱點(diǎn)。借助動物模型模擬肺結(jié)核在人體的感染歷程是結(jié)核病研究的常用手段，但目前缺乏較好的動態(tài)監(jiān)測手段[3-4]。因此，本研究采用micro-CT動態(tài)觀察肺結(jié)核模型小鼠的病情進(jìn)展，并與不同時期小鼠肺結(jié)核病理學(xué)結(jié)果進(jìn)行對照，探討其潛在的應(yīng)用價值，為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物及儀器 SPF級C57BL/6J雌性小鼠60只(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，許可證號為SCXK(滬)2008-0016，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF級。采用標(biāo)準(zhǔn)人型結(jié)核菌株H37Rv。Micro-CT (eXplore Locus)，購自加拿大GE Healthcare。

1.2 結(jié)核小鼠模型的制備 ABSL-3級實(shí)驗(yàn)室滴鼻法(H37Rv)感染40只小鼠，菌液濃度1×107CFU/mL[3-4]，每只小鼠滴鼻20 μL；隨機(jī)分為4亞組，分別在感染后第1、4、8、12周后進(jìn)行micro-CT掃描和病理分析。對照組小鼠20只飼養(yǎng)于SPF級動物房，不進(jìn)行滴鼻感染,隨機(jī)分為4亞組(n=5)，在實(shí)驗(yàn)組開始實(shí)驗(yàn)后的24 h內(nèi)對其進(jìn)行micro-CT掃描和病理分析。

1.3 Micro-CT掃描 將實(shí)驗(yàn)組小鼠麻醉完全后放置于掃描瓶內(nèi)，經(jīng)外表面消毒、紫外線照射15 min后傳出ABSL-3級實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行micro-CT掃描。Micro-CT掃描參數(shù)：管電壓50 kV，管電流450 μAs，角增量0.7°，曝光時間300 ms，平均幀數(shù)為2幀；探測器組件模式4×4，掃描時間16 min，錐體束方法重建。二維電荷耦合探測器(CCD)單元大小為27 μm，有效像素94.0 μm，分辨率45.0 μm×45.0 μm×45.0 μm。圖像后處理軟件為GE Micro View[4]。

1.4 菌落計(jì)數(shù)及病理分析 將掃描完成后回ABSL-3級實(shí)驗(yàn)室的小鼠脫頸處死，取肺組織，肉眼觀察標(biāo)本，表面可見白色結(jié)節(jié)或顆粒樣病灶。選取約1/3肺葉組織(盡量含肉眼可見病灶)，加入PBS Tween-80 1 mL，勻漿機(jī)最大轉(zhuǎn)速勻漿180 s，離心后吸取上清100 μL，稀釋為1 000倍的混懸液，吸取100 μL涂布到平板培養(yǎng)基，置于ABSL-3級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)37℃培養(yǎng)箱中，3周后計(jì)數(shù)菌落。約1/2肺葉組織-80℃凍存?zhèn)溆茫挥啻蟛糠址稳~組織分別做H-E染色及抗酸染色。對照組小鼠同樣處理。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠生存情況 40只感染小鼠中，共計(jì)死亡9只，肺內(nèi)未出現(xiàn)陽性病灶者3只，剔除后，第1、4、8、12周各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)目分別為7、6、8、7只；對照組小鼠每組5只，無死亡。

2.2 結(jié)核桿菌培養(yǎng)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組可觀察到淺黃色的菌落生長，而對照組未發(fā)現(xiàn)菌落生長。僅在感染12周時，2例結(jié)核桿菌為陰性，余均可見菌落生長。結(jié)核菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見圖1。

圖1 小鼠感染結(jié)核菌肺組織荷菌量(log 10 CFU)變化

2.3 肺結(jié)核micro-CT表現(xiàn) 對照組小鼠在第1、4、8、12周micro-CT掃描肺內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)異常病灶(圖2A)。實(shí)驗(yàn)組感染第1周，7只小鼠表現(xiàn)為邊界模糊的磨玻璃密度影(ground glass opacity GGO,圖2B)或?qū)嵶?。感染?周，4只肺部可見GGO及斑片狀實(shí)變影(圖2C)，累及肺體積的50%，2例表現(xiàn)為多個孤立結(jié)節(jié)。感染第8周時，8只小鼠肺內(nèi)病變范圍增大，3例以多灶性或彌漫性實(shí)變?yōu)橹鳎奂胺误w積約80%(圖2D)；3例表現(xiàn)為大小不等的多發(fā)結(jié)節(jié)伴有大小不等的實(shí)變灶；2例肺內(nèi)無明顯病灶，僅表現(xiàn)為胸膜增厚。感染第12周，3只小鼠表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)肺彌漫實(shí)變(幾乎累及全肺)，伴有支氣管充氣征，肺周未見受累(圖2E)，伴散在小結(jié)節(jié)影，而余4例肺內(nèi)以散在小結(jié)節(jié)影為主(圖2F)，邊較清晰，伴或不伴斑片樣實(shí)變影。

實(shí)驗(yàn)組小鼠隨感染時間延長其micro-CT表現(xiàn)如表1所示：感染第1周，71.4%小鼠表現(xiàn)為GGO，57.1%出現(xiàn)支氣管充氣征；感染第4周，66.7%表現(xiàn)為GGO和小灶性實(shí)變；感染第8周，結(jié)節(jié)樣增殖性病變表現(xiàn)比例增高，且與其他征象出現(xiàn)比例相當(dāng)；感染第12周，結(jié)節(jié)比例最高，約57.1%。

圖2 對照組及實(shí)驗(yàn)組小鼠micro-CT表現(xiàn)

A:對照組小鼠感染第12周肺內(nèi)未見異常；B:感染1周，小鼠肺結(jié)核micro-CT示右下肺(小鼠仰臥位，圖左側(cè)示小鼠右側(cè))顯示邊界不清的小斑片狀GGO；C:感染4周，小鼠肺結(jié)核micro-CT示左上肺小斑片狀實(shí)變，邊界不清；D:感染8周，小鼠肺結(jié)核micro-CT示兩肺多發(fā)團(tuán)片樣實(shí)變，可見支氣管充氣征，右側(cè)葉間胸膜增厚；E:感染12周，1只小鼠兩肺彌漫實(shí)變伴支氣管充氣征，幾乎累及全肺；F:感染12周，另1只小鼠micro-CT掃描可見右肺內(nèi)見多個結(jié)節(jié)(箭頭)

表1 實(shí)驗(yàn)組各亞組小鼠micro-CT影像表現(xiàn)分析 n(%)

2.4 病理結(jié)果

2.4.1 大體病理解剖 感染1周時，小鼠肺組織肉眼觀察未見明確病灶。感染4周時，小鼠肺組織表面見散在分布的小結(jié)節(jié)狀、顆粒狀灰白色病灶。感染8周時，可見多發(fā)結(jié)節(jié)連續(xù)呈斑片狀。感染12周時肉眼見片狀、結(jié)節(jié)狀灰白色病灶(圖3)，其中1例肺組織腫脹、體積增大，病灶不規(guī)則呈淡灰色，結(jié)核桿菌培養(yǎng)結(jié)果陽性；5例肉眼觀未見明確病灶，但其中3例結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性。對照組各組小鼠肺肉眼均未見病灶。

圖3 小鼠肺組織大體標(biāo)本

2.4.2 H-E及抗酸染色 對照組小鼠僅進(jìn)行H-E染色，均未發(fā)現(xiàn)病變(圖4A)。急性感染初即感染第1周，H-E染色7只小鼠均可見肺泡間隔增寬，大量淋巴細(xì)胞浸潤，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞散在分布，3只并見類上皮細(xì)胞和泡沫細(xì)胞(圖4B)。感染4周后，4只小鼠鏡下見肺組織大量巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞，其中2只micro-CT表現(xiàn)為結(jié)節(jié)的小鼠在實(shí)變組織內(nèi)見散在類上皮細(xì)胞形成，偶見多核巨細(xì)胞，并有結(jié)核小結(jié)形成趨勢(圖4C)。感染8周后，3只表現(xiàn)為多發(fā)斑片狀實(shí)變，實(shí)變范圍較感染4周時擴(kuò)大，伴大量泡沫細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤；另3只并見類上皮細(xì)胞和多核巨細(xì)胞增多，有結(jié)核小結(jié)形成趨勢(圖4D)。感染12周后，4只表現(xiàn)為彌漫實(shí)變，與感染8周時病理所見相同，實(shí)變內(nèi)可見肉芽腫樣病變形成，鏡下見多核巨細(xì)胞或類上皮細(xì)胞周圍多發(fā)淋巴細(xì)胞浸潤，而micro-CT上的小結(jié)節(jié)對應(yīng)為孤立結(jié)核結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周圍肺泡壁不厚(圖4E、4F)?？顾崛旧姴∽儏^(qū)域、巨噬細(xì)胞內(nèi)或肺泡腔內(nèi)散在或成簇分布紅色條狀結(jié)核分枝桿菌(圖5)。

圖4 小鼠肺組織H-E染色結(jié)果

A～F示對照組及實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織病理表現(xiàn)，與圖2A～2F基本對應(yīng). A:對照組正常小鼠肺組織；B:感染1周時，鏡下顯示肺泡間隔明顯增寬；C:感染4周時，肺泡腔內(nèi)充填滲出物，成斑片狀實(shí)變；D:感染8周時，高倍鏡下可見實(shí)變背景下肺泡腔內(nèi)巨噬細(xì)胞形成；E,F:感染12周時，小鼠肉芽腫,低倍鏡下見結(jié)核肉芽腫形成，周圍為正常肺泡(E)，高倍鏡下見上皮樣肉芽腫由多個Langhans巨細(xì)胞聚集而成，周圍有淋巴細(xì)胞和纖維母細(xì)胞浸潤(F). Original magnification: ×100(A,B,C,E), ×400(D,F)

圖5 小鼠肺組織抗酸染色結(jié)果

病灶內(nèi)成簇聚集的多條紅色條狀結(jié)核桿菌. Original magnification: ×400

3 討 論

動物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然不能直接應(yīng)用于人，但可以提供假說和確切的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。選用C57BL/6J小鼠作為感染對象，是因?yàn)樾∈篌w型小、種群數(shù)量龐大，易于維持生物安全三級實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，且C57BL/6J小鼠是近交系小鼠中對結(jié)核分枝桿菌最敏感的動物[5-6]。

感染組小鼠荷菌量第1周即達(dá)(6.30±0.02)log 10 CFU，可能與滴鼻法大量的菌液直接入肺，對肺組織的物理損傷與結(jié)核感染互相促進(jìn)，造成了嚴(yán)重急性肺感染。第4周和第8周菌量穩(wěn)定，維持在同一水平，而不是隨感染時間的延長呈對數(shù)上升趨勢[7-9]。感染12周的結(jié)核桿菌培養(yǎng)結(jié)果亦低于其他研究[10]，荷菌量未維持在高水平平臺期。這可能與感染過程中小鼠自身免疫力產(chǎn)生及實(shí)驗(yàn)操作有關(guān)。

對照micro-CT表現(xiàn)和H-E染色病理結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)小鼠感染急性肺結(jié)核存在其演變規(guī)律。感染初期以GGO和小斑片影為主，對應(yīng)病理改變?yōu)榉闻蓍g隔增厚、中性粒細(xì)胞浸潤，感染4周時micro-CT表現(xiàn)的局限性實(shí)變對應(yīng)病理學(xué)肺泡塌陷，巨噬細(xì)胞聚集、類上皮細(xì)胞和泡沫細(xì)胞形成。感染8周與感染12周小鼠肺結(jié)核病灶開始出現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)歸。(1)感染加重：實(shí)變范圍擴(kuò)大，且隨感染時間延長而加重；(2)修復(fù)：形成結(jié)核肉芽腫，或僅表現(xiàn)為胸膜增厚，后者與文獻(xiàn)[11-12]報道相符，滲出病變會隨疾病發(fā)展而消散。肉芽腫周圍為正常的未塌陷肺泡，可能與細(xì)胞免疫控制了結(jié)核分枝桿菌增殖和疾病進(jìn)展有關(guān)，也可能由于小鼠機(jī)體存在一定的修復(fù)能力，抵抗力較強(qiáng)[13]。

本研究成功建立了小鼠肺結(jié)核模型，并分析了隨結(jié)核感染時間的延長在micro-CT上的動態(tài)演變及病理學(xué)改變。各時期的影像學(xué)及病理學(xué)表現(xiàn)較準(zhǔn)確地反映了小鼠肺結(jié)核病理改變，可用于模擬人類感染肺結(jié)核過程。在進(jìn)行結(jié)核動物模型的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，可適當(dāng)應(yīng)用micro-CT觀察造模情況及實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，減少對小鼠的不必要處死；而在影像學(xué)靶向造影劑研究等對影像表現(xiàn)的把握則起到關(guān)鍵的作用。

本研究仍存在不足之處：(1)同批處理小鼠數(shù)目較多，在感染第12周處理時ABSL-3級實(shí)驗(yàn)室操作時間限制，未能及時涂板進(jìn)行結(jié)核桿菌培養(yǎng)，而是在-80℃凍存后涂板，可能造成部分結(jié)核桿菌死亡，影響計(jì)數(shù)結(jié)果；(2)由于micro-CT掃描設(shè)備限制，掃描時間過長，同時結(jié)核感染小鼠掃描時須放在隔離瓶中，麻醉是否滿意及呼吸運(yùn)動等因素對圖像質(zhì)量造成的影響難以控制；(3)micro-CT分辨率較差，難以觀察到人類結(jié)核高分辨率CT的諸多征象[14]。但是，隨著CT技術(shù)的發(fā)展，新的micro-CT有望克服這些不足，在成像速度和成像清晰度方面都會有很大的提高。

[ 1 ] SALGAME P, GEADAS C, COLLINS L, et al. Latent tuberculosis infection--revisiting and revising concepts[J].Tuberculosis (Edinb), 2015,95(4):373-384.

[ 2 ] 朱薇珊.菌陰肺結(jié)核126例臨床分析[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2014,21(4): 469-471.

[ 3 ] 李任翔, 劉先洲, 唐志佼, 等.結(jié)核分枝桿菌急性感染小鼠模型的建立[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué), 2007,18(5):12-14.

[ 4 ] 張昊凌, 施裕新, 錢 雋, 等.靶向CT對比劑在結(jié)核急性感染動物模型中的初步觀察[J].中華放射學(xué)雜志, 2012,46(12):1132-1137.

[ 5 ] 張昊凌, 張志勇. 結(jié)核分枝桿菌感染動物模型的研究進(jìn)展[J]. 微生物與感染, 2012,07(3):184-189.

[ 6 ] 袁 偉, 秦 川. 結(jié)核病動物模型研究進(jìn)展[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2010,20(9):55-59.

[ 7 ] LAZAREVIC V, NOLT D, FLYNN J L. Long-term control of Mycobacterium tuberculosis infection is mediated by dynamic immune responses[J]. J Immunol, 2005,175(2):1107-1117.

[ 9 ] 張交兒, 周向梅, 孫 斌, 等. 結(jié)核分枝桿菌感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚J]. 中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報, 2008, 16(5):385-390.

[10] SUGAWARA I, YAMADA H, MIZUNO S. Pathological and immunological profiles of rat tuberculosis[J]. Int J Exp Pathol, 2004,85(3):125-134.

[11] ORDONEZ A A, DEMARCO V P, KLUNK M H, et al. Imaging chronic tuberculous lesions using sodium[(18)F]fluoride positron emission tomography in mice[J]. Mol Imaging Biol, 2015,17(5):609-614.

[12] LEONG F J, DARTOIS V, DICK T. A color atlas of comparative pathology of pulmonary tuberculosis[M]. CRC Press, New York, 2011.

[13] RAMAKRISHNAN L. Revisiting the role of the granuloma in tuberculosis[J]. Nat Rev Immunol[J]. Nat Rev Immunol, 2012,12(5):352-366.

[14] YEH J J, CHEN S C, TENG W B, et al. Identifying the most infectious lesions in pulmonary tuberculosis by high-resolution multi-detector computed tomography[J]. Eur Radiol, 2010,20(9):2135-2145.

[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

The value of micro-CT in monitoring the dynamic evolution of acute pulmonary tuberculosis in mice

WANG Qing-le1, ZHANG Zhi-yong1, SHI Yu-xin2, ZHU Zhao-qin2, FENG Yan-ling2, ZHANG Xing-wei1, FENG Feng3, ZHANG Hao-ling1, ZENG Meng-su1, CHEN Gang1*

1. Department of Radiology, Zhongshan Hospital, Fudan University; Shanghai Institute of Image Medicine; Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China2. Department of Radiology, Fudan University Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China3. Department of Radiology, Nantong Tumor Hospital, Nantong 226361, Jiangsu, China

Objective： To study the value of micro-CT in monitoring the dynamic evolution of acute pulmonary tuberculosis in mice.Methods： Establish the murine tuberculosis model of C57BL/6J in intranasal as the experiment group. The control group was set at the SPF level. Micro-CT scans were undertaken 1, 4, 8, 12 weeks later， respectively. And then the mice were sacrificed and the lung tissue was taken for pathological analysis.Results： In the experiment group, nine mice died and three were negative. So, totally 28 mice were enrolled. There were 7,6,8,7 mice in each subgroup, respectively. One week after infection, ground glass opacity (GGO) was 71.4% and consolidation was 57.1% in the experiment group. Corresponding pathology showed alveolar exudate and alveolar septum widened. Four weeks after infection, the imaging findings included GGO and patchy opacities (in 66.7%) in the experiment group. Microscopically, alveolar effusion and consolidation, with epithelioid cells, multinucleated giant cells and foam cells were found. Eight weeks after infection, nodules, air bronchogram and consolidation had equal proportion in the experiment group. Microscopically, it showed consolidation and tuberculosis nodules. 12 weeks after infection, nodules had the highest proportion, about 57.1% in the experiment group. Microscopically, the nodules showed granulomas.Conclusions： The images of acute pulmonary tuberculosis murine model can reflect the pathological changes, which can be used to simulate the course of human pulmonary tuberculosis and evaluate the disease process.

pulmonary tuberculosis; animal models; X-ray computed tomography; pathology

R 521

A

2017-07-18 [接受日期] 2017-07-26

國家自然科學(xué)基金(81601634). Supported by National Natural Science Foundation of China(81601634).

王青樂，博士，住院醫(yī)師. E-mail: wangql1986@163.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: chen.gang@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170599