楊英鐸，陸大洪，楊冬梅，袁小晶，秦海燕*

(1.綿陽外國語學(xué)校 高三七班，四川 綿陽 621000；2.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010)

·中藥基礎(chǔ)·

香樟精油對金黃色葡萄球菌的抑菌活性及抑菌機(jī)理研究△

楊英鐸1，陸大洪2，楊冬梅2，袁小晶2，秦海燕2*

(1.綿陽外國語學(xué)校 高三七班，四川 綿陽 621000；2.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010)

目的：探討香樟精油對金黃色葡萄球菌的抑菌活性及其抑菌機(jī)理。方法：采用抑菌圈實驗和試管二倍稀釋法對香樟精油的抑菌活性、最低抑菌濃度(MIC)進(jìn)行測定；通過測定菌液中還原糖含量、蛋白質(zhì)含量以及電導(dǎo)率的變化，研究香樟精油對金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理。結(jié)果：香樟精油對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為12.5%；香樟精油能影響金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性，香樟精油作用4 h時，香樟精油組菌液中還原糖含量比對照組分別增加了25.48%、31.02%、31.25%(P<0.05)，菌液中蛋白質(zhì)含量比對照組分別增加了26.86%、31.43%、31.23%(P<0.05)。結(jié)論：金黃色葡萄球菌對香樟精油中度敏感，其抑菌機(jī)制可能在于破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起內(nèi)含物滲漏，導(dǎo)致菌體缺乏營養(yǎng)物質(zhì)而死亡。

香樟精油；抑菌活性；抑菌機(jī)理；抑菌圈直徑

香樟Cinamomumcamphora(Linn.)Presl.系樟科樟屬常綠喬木，是我國亞熱帶綠闊葉林的主要樹種之一，也是常用的芳香綠化樹種，資源十分豐富。樟樹性味辛溫?zé)o毒，其根、皮、葉、果實均作為藥用，具有散寒止痛、溫中健脾、補(bǔ)火助陽等功效，可用于治療各種痛癥、脾胃虛寒、腎陽虛衰、瘀血內(nèi)阻等[1-2]。樟樹的根、莖、葉和果實均含精油，其精油具有抗菌、抗炎、抗癌、止痛、驅(qū)蟲、終止妊娠的作用[3]，樟油也是工業(yè)和醫(yī)藥上生產(chǎn)樟腦、龍腦的主要原料。我國的樟樹精油開發(fā)利用歷史悠久，使樟樹精油在我國天然精油中占據(jù)了舉足輕重的地位。近年，關(guān)于樟樹精油的提取、成分分析及抑菌效果有較多的研究報道[4-7]，但對于樟樹精油抑菌機(jī)理研究卻不多見。本文在測定香樟精油抑菌活性的基礎(chǔ)上，以金黃色葡萄球菌為供試菌，通過研究精油對金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜通透性、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量的影響，揭示香樟精油的抑菌作用機(jī)制，為充分挖掘我國豐富的揮發(fā)油類中藥及促進(jìn)樟樹精油最大程度的利用提供理論依據(jù)。

1 材料

供試菌種金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC26112，中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心)；香樟精油(江西金海天然香料油科技公司，藥用級，批號：JH20150147)，經(jīng)西南科技大學(xué)袁小紅教授鑒定為天然香樟精油；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、丙酮、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸等購自成都科龍化學(xué)試劑公司。

2 方法

2.1 精油稀釋液的制備

精確稱取一定量香樟精油置于燒杯中，加入蒸餾水與聚山梨酯-80，攪拌，使精油均勻分散于水中，再加入蒸餾水定容至100 mL后，得香樟精油質(zhì)量濃度為180 mg·mL-1、聚山梨酯-80體積分?jǐn)?shù)為10 μL·mL-1的香樟精油溶液，裝入棕色瓶作為母液，稀釋配制一系列質(zhì)量濃度的香樟精油溶液。

2.2 菌懸液的制備

將供試菌種在斜面培養(yǎng)基上活化2代后，用接種環(huán)從斜面上輕刮菌苔一環(huán)，收集到內(nèi)盛10 mL無菌水的三角瓶中，配成終濃度為106CFU·mL-1的菌懸液，備用。

2.3 香樟精油的抑菌活性測定

以丙酮作為稀釋劑，取0.5 mL精油，加入0.5 mL丙酮配置成體積分?jǐn)?shù)為50%的溶液，震蕩搖勻，丙酮二倍稀釋法配制一系列體積分?jǐn)?shù)的精油溶液。待培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基凝固后，在無菌條件下，取0.2 mL菌懸液涂布到培養(yǎng)皿上。將直徑6 mm的無菌濾紙片在香樟精油中浸泡2 h，瀝干，平鋪在培養(yǎng)皿上，每平板鋪3片，空白對照組無菌濾紙片在丙酮中浸泡2 h。于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后觀察，并測定抑菌圈的直徑。平行實驗3次。抑菌圈實驗判定標(biāo)準(zhǔn)：濾紙片直徑為6 mm時，抑菌圈直徑大于20 mm，極敏；15～20 mm，高敏；10～15 mm，中敏；7～9 mm，低敏；小于7 mm，不敏感[8]。

2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定[9]

將2.3項下所得的不同體積分?jǐn)?shù)的香樟精油溶液各1 mL加入15 mL融化的固體培養(yǎng)基中混合均勻，待培養(yǎng)基凝固后，即得含不同體積分?jǐn)?shù)的香樟精油供試樣品的平板。在平板上畫線接種菌液，37 ℃培養(yǎng)1 d。觀察菌體生長情況，生長菌體為陽性(+)，不生長菌體為陰性(-)，以不生長菌的試驗樣品的最低濃度為香樟精油最低抑菌濃度(MIC)，以1 mL丙酮加入15 mL融化的固體培養(yǎng)基作為空白對照，重復(fù)2次。

2.5 菌液電導(dǎo)率的測定

經(jīng)過電導(dǎo)率預(yù)實驗，量取含聚山梨酯-80的質(zhì)量濃度為30、60、90 mg·mL-1香樟精油，加入培養(yǎng)至對數(shù)期的金黃色葡萄球菌菌液中，震蕩培養(yǎng)，按錢麗紅等[10]的方法每隔30 min取菌液，離心，得到上清液，用數(shù)字電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率值。以不加精油只加同等體積蒸餾水和助溶劑聚山梨酯-80作為對照組(聚山梨酯-80在對照組中的終體積分?jǐn)?shù)為0.05 μL·mL-1)。平行實驗3次，取平均值。

2.6 菌液中還原糖的測定

根據(jù)王林嵩[11]的方法，取生長到對數(shù)期的金黃色葡萄球菌液22.5 mL分別與25 mL質(zhì)量濃度為30、60、90的香樟精油混合，振蕩培養(yǎng)，分別在0、1、2、3、4、5 h 時取5 mL 混合液，離心(3000 r·min-1，6 min)，取上清液2 mL，50 ℃恒溫水浴中保溫20 mim，移取1 mL樣品溶液、1 mL蒸餾水和1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸，搖勻，在520 nm波長下測吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線；以無菌水及聚山梨酯-80作為空白對照(聚山梨酯-80在對照組中的終體積分?jǐn)?shù)為0.05 μL·mL-1)。平行實驗3次。

2.7 菌液蛋白質(zhì)的測定

根據(jù)王林嵩[11]的研究方法，取生長到對數(shù)期的金黃色葡萄球菌22.5 mL 分別與25 mL質(zhì)量濃度為30、60、90 mg·mL-1的香樟揮發(fā)油混合搖勻，37 ℃振蕩培養(yǎng)，分別在0、1、2、3、4、5 h 時移取3 mL樣品，1200 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心5 min，分別取上清液0.1 mL，加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250配制的蛋白質(zhì)試劑，充分振蕩混合，2 min后于595 nm處測定吸光值，以0.1 mL蒸餾水加5.0 mL蛋白質(zhì)試劑為空白對照。以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以同等體積的無菌水及聚山梨酯-80作為空白對照組(聚山梨酯-80在對照組中的終體積分?jǐn)?shù)為0.05 μL·mL-1)。平行實驗3次。

2.8 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 香樟精油對金黃色葡萄球菌抑菌活性測定結(jié)果

香樟精油對金黃色葡萄球菌抑菌活性測定結(jié)果見表1、2和圖1、2，不同體積分?jǐn)?shù)香樟精油對金黃色葡萄球菌抑菌活性不同。純精油對金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大，為(12.6±1.23)mm，在10～15 mm，屬中敏。精油抑菌圈直徑隨體積分?jǐn)?shù)的增大而增強(qiáng)。最小抑菌濃度MIC值是測定抗菌物質(zhì)抗菌活性大小的指標(biāo)。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)降到12.5%時，平板中沒有檢出菌落，6.25%時平板中檢出少量菌落，當(dāng)香樟精油的體積分?jǐn)?shù)大于12.5%時，可完全抑制金黃色葡萄球菌的生長，故其對金黃色葡萄球菌的MIC為12.5%。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)香樟精油的抑菌圈直徑(n=9)

表2 香樟精油對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度(MIC)的測定結(jié)果

注：-表示培養(yǎng)基未出現(xiàn)菌落，+表示培養(yǎng)基有菌落生長。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)香樟精油的抑菌圈活性

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)香樟精油金黃色葡萄球菌菌落生長情況

3.2 香樟精油對金黃色葡萄球菌菌懸液電導(dǎo)率的影響

細(xì)胞膜是細(xì)菌的一個屏障，既可以阻擋外源物質(zhì)的進(jìn)入，也可以防止內(nèi)部物質(zhì)的流出。當(dāng)細(xì)胞膜受到損壞，胞內(nèi)物質(zhì)就會釋放出來，小分子如鉀離子、鈉離子、磷酸根離子等電解質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升，因此，菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化[12]。圖3顯示了經(jīng)不同質(zhì)量濃度香樟精油處理不同時間后，對金黃色葡萄球菌菌液電導(dǎo)率的測定結(jié)果。由圖3可知，在不同處理時間下菌液的電導(dǎo)率均高于對照，對照組菌液電導(dǎo)率隨處理時間的延長變化量不大；精油處理組隨著作用時間的增加，菌液電導(dǎo)率顯著上升，且與抑菌成分的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，即質(zhì)量濃度越高，電導(dǎo)率值越大。隨著精油與細(xì)菌作用時間的增加，菌液的電導(dǎo)率明顯增加。與對照組相比，當(dāng)作用4 h時，香樟精油組培養(yǎng)液電導(dǎo)率顯著增加(P<0.05)，但各組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。說明精油對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜逐漸產(chǎn)生破壞作用，使小分子的離子(K+、Ca2+、Na+等)從細(xì)菌細(xì)胞中大量滲出，致使菌液的電導(dǎo)率逐漸上升，從而達(dá)到抑菌的目的。

注：與對照組相比，*P<0.05；下同。圖3 香樟精油作用金黃色葡萄球菌后培養(yǎng)液電導(dǎo)率的變化

3.3 香樟精油對細(xì)菌培養(yǎng)液還原糖的影響

糖類是微生物首要的碳源和能源儲備物質(zhì)。當(dāng)細(xì)菌處于正常生理狀態(tài)時，會吸收利用外源的營養(yǎng)成分，而當(dāng)膜結(jié)構(gòu)遭到破壞時，細(xì)胞內(nèi)容物包括糖類發(fā)生外泄，通過測定細(xì)菌培養(yǎng)液中糖質(zhì)量濃度的變化，可以了解細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)的完整性[10]。

由圖4可以看出，香樟精油處理過的金黃色葡萄球菌胞外環(huán)境中糖質(zhì)量濃度不斷升高，這是胞內(nèi)的糖類物質(zhì)滲漏到胞外，而使得培養(yǎng)基中糖質(zhì)量濃度增加，對照組金黃色葡萄球菌胞外環(huán)境中糖質(zhì)量濃度不斷降低，這是由于隨著細(xì)菌的生長繁殖，培養(yǎng)基中的糖類物質(zhì)不斷地被吸收利用而減少。當(dāng)香樟精油作用4 h時，與對照組相比，30、60、90 mg·mL-1香樟精油組菌液還原糖含量分別增加了25.48%、31.02%、31.25%(P<0.05)，達(dá)到了統(tǒng)計學(xué)差異水平，60、90 mg·mL-1組間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。這也說明了香樟精油不僅可以影響細(xì)菌對還原糖的吸收利用，還促使菌體內(nèi)的糖泄露，使菌體失去能源物質(zhì)，從而發(fā)揮其抑菌作用。

圖4 不同質(zhì)量濃度香樟精油對菌液還原糖含量的影響

3.4 香樟精油對細(xì)菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量的影響

不同質(zhì)量濃度香樟精油對菌液蛋白質(zhì)含量的影響見圖5，隨培養(yǎng)時間的增加，對照組細(xì)菌處于對數(shù)生長期，消耗的蛋白質(zhì)量增加，所以菌液中蛋白質(zhì)的含量下降；經(jīng)香樟精油作用后的菌液中的蛋白質(zhì)含量較對照組顯著增高，表明菌液中的金黃色葡萄球菌可能被抗菌成分損傷，菌體中的可溶性蛋白滲出，且超過了被菌體消耗掉的那部分蛋白質(zhì)，使菌液中的蛋白質(zhì)含量升高；且隨香樟精油濃度的增加，菌液中的蛋白質(zhì)含量也相應(yīng)升高，表明精油濃度與金黃色葡萄球菌菌體蛋白質(zhì)的滲透呈正相關(guān)；培養(yǎng)4 h后，與對照組相比，30、60、90 mg·mL-1香樟精油組菌液蛋白質(zhì)含量分別增加了26.86%、31.43%、31.23%(P<0.05)，達(dá)到了統(tǒng)計學(xué)差異水平，60、90 mg·mL-1組間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義?？梢?，添加香樟精油的培養(yǎng)菌液中其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于對照組，證明了香樟精油可改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，致使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)滲漏到體外的培養(yǎng)液中。

圖5 不同質(zhì)量濃度香樟精油對菌液蛋白質(zhì)含量的影響

4 討論

香樟精油抑菌活性實驗結(jié)果與馬英姿等[6]、李愛民等[7]的研究一致，表明樟樹精油對金黃色葡萄球菌都具有較好的抑菌效果。本研究結(jié)果顯示，香樟精油具有明顯的抑菌活性，其最低抑菌濃度為12.5%。

藥物對細(xì)菌的抑菌作用機(jī)制，主要是通過破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性、抑制三羧酸循環(huán)途徑、抑制蛋白和核酸的合成等方面來實現(xiàn)的[13]。香樟精油主要成分為樟腦、β-芳樟醇、桉油醇、α-松油醇、蛇床-6-烯-4-醇[5]，其中，芳樟醇具有抗細(xì)菌、抗真菌和抗病毒作用[14]，是樟樹葉精油中的主要抗菌成分。香樟精油能夠使菌液中電導(dǎo)率值、還原糖含量以及蛋白質(zhì)含量發(fā)生明顯的變化，但發(fā)生明顯變化的突變點各不相同。其中對電導(dǎo)率最大的影響在1.5 h左右，還原糖含量的影響從2 h后開始，蛋白質(zhì)含量的影響從3 h開始，且糖和蛋白質(zhì)的變化率明顯高于電導(dǎo)率變化率，說明對應(yīng)于這些變化的內(nèi)部原因并不是同時發(fā)生的，而是有其時間先后性的，即先從細(xì)胞中緩慢滲透出小分子物質(zhì)使細(xì)胞代謝受到影響；隨著作用時間增加，細(xì)胞膜表面的糖鏈及膜上鑲嵌的蛋白質(zhì)脫離細(xì)胞游離到菌液中；隨著細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，致使菌體受損進(jìn)一步增加，蛋白質(zhì)和糖大量泄露出胞體。蛋白質(zhì)外泄對菌體細(xì)胞中的生理機(jī)能產(chǎn)生重要影響，糖大量外泄使菌體失去能源物質(zhì)，使生物體的生長和繁殖受阻，甚至死亡。因而推斷香樟精油破壞了細(xì)胞膜的完整性，使胞內(nèi)無機(jī)鹽離子、蛋白質(zhì)、糖外漏，細(xì)胞膜是其抑菌作用靶點之一。

我國樟樹資源非常豐富，但至今為止多只把它作為一種園林綠化樹種來發(fā)展，對其精油抗菌活性及其機(jī)理的研究加深了樟樹作為芳香類藥材開發(fā)利用的廣度和深度，為提高樟樹綜合經(jīng)濟(jì)效益提供參考。

致謝：西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院免疫實驗室及分析測試中心提供便捷的實驗條件。

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AntibacterialActivityandMechanismofEssentialOilfromCinamomumcamphoraonStaphylococcusaureus

YANGYingduo1，LUDahong2，YANGDongmei2，YUANXiaojing2，QINHaiyan2*

(1.ClassSeven，SeniorGradeThree，MiangYangForeignLanguagesSchool，Mianyang621010，China;2.SchoolofLifeScienceandEngineering，SouthwestUniversityofScienceandTechnology，Mianyang621010，China)

Objective：To investigate the antibacterial activity and mechanism of the essential oil fromCinamomumcamphoraonStaphylococcusaureus.Methods：The inhibition zone experiment and tube double dilution method were used to determine the essential oil’s antimicrobial activity and the minimum inhibitory concentration(MIC).The antibacterial mechanism experiments were carried out by determining changes of reducing sugar content，protein content and electric conductivity.Results：The MIC toS.aureuswas 12.5%.The essential oil could affect the membrane permeability ofS.aureus.After treated with the essential oil for 4 hours，the reducing sugar content of the experimental groups was increased by 25.48%，31.02%，31.25%(P<0.05)than that of the control group，respectively，and the total content of proteins increased by 26.86%，31.43%，31.23%(P<0.05)，respectively.The difference was significant.Conclusion：The essential oil showed obvious antibacterial activity againstS.aureus.The antimicrobial mechanism is inferred that bacterial cell structure is damaged，cell membrane permeability increased.

Essential oil；antimicrobial activities；antibacterial mechanism；inhibition zone diameters.

2016-12-18)

四川省教育廳基金項目(14zd1126)；西南科技大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金(CX16-069)

*

秦海燕，講師，研究方向：藥用植物活性資源開發(fā)；Tel：(0816)6089532，E-mail：qinhaiyan03@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.013