楊 丹， 賈桂枝， 楚明會， 戴紅良△

(錦州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 3護(hù)理學(xué)院， 遼寧 錦州 121001)

染料木黃酮對氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB活化的影響*

楊 丹1， 賈桂枝2， 楚明會3， 戴紅良3△

(錦州醫(yī)科大學(xué)1附屬第一醫(yī)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，3護(hù)理學(xué)院， 遼寧 錦州 121001)

目的： 探討染料木黃酮對氨所致星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB活化的影響及其機(jī)制。方法: 以氯化銨刺激原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，建立高血氨模型，Western blot檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞中ERK、Akt及核因子κB(NF-κB)的活化。結(jié)果: AG1478及染料木黃酮可顯著抑制氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK及Akt的活化。LY294002、染料木黃酮及AG1478可顯著抑制氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位。結(jié)論: 染料木黃酮可顯著抑制氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK活化和Akt介導(dǎo)的NF-κB活化，這可能是該天然物質(zhì)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的重要機(jī)制。

染料木黃酮； 氨； 星形膠質(zhì)細(xì)胞； 核因子κB

高氨血癥可引起多種疾病，其中最為重要的當(dāng)屬肝性腦病(hepatic encephalopathy，HE)和急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)[1]。HE會發(fā)生于多數(shù)的肝病病人身上，其中慢性HE是最為常見的肝性腦病類型，患者會出現(xiàn)人格和情緒改變、智力降低及肌張力異常等變化；ALF誘發(fā)的HE一般由藥物毒性引起，患者突然出現(xiàn)心理功能的降低及全身炎癥，最終引發(fā)多器官衰竭和昏迷。腦水腫是伴隨HE出現(xiàn)的重要神經(jīng)病理改變，嚴(yán)重的腦水腫可引起顱內(nèi)壓升高，其死亡率極高[2]。星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫是高氨血癥誘發(fā)腦水腫/顱內(nèi)壓升高的原因[3]。研究顯示，當(dāng)腦組織氨濃度達(dá)到3～5 mmol/L水平時即可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫和肝性腦病。許多研究也均以3～5 mmol/L氨刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫,從而建立肝性腦病體外模型[4-5]。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)屬酪氨酸激酶受體，該受體的激活是氨刺激誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的重要機(jī)制[5]。染料木黃酮(4’,5,7-三羥基異黃酮)是大豆及其制品中一種含量豐富的植物雌激素，具有廣譜的受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)抑制活性，可抑制包括EGFR在內(nèi)的多種RTK的活化[6]。之前我們的研究顯示染料木黃酮可顯著抑制氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫[7]，但其機(jī)制未明。在本研究中，我們擬利用體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，從NF-κB活化角度探討染料木黃酮對氨刺激下星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。

材料和方法

1材料

氯化銨購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胎牛血清購于HyClone；DMEM培養(yǎng)基購于Corning；抗細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、磷酸化ERK (p-ERK)、Akt、磷酸化Akt (p-Akt)Ⅰ抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗購于Santa Cruz； 抗NF-κB I 抗購自Abcam；抗Lamin BⅠ抗購于Pierce。染料木黃酮、EGFR抑制劑AG1478、ERK抑制劑U0126和PI3K抑制劑LY294002均購自Sigma。

2方法

2.1星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及處理 取出生24 h內(nèi)的SD大鼠大腦皮層，剝離腦膜及血管后，將腦組織切碎，加入0.125%胰蛋白酶37 ℃消化6 min，待細(xì)胞分散后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。將組織懸液先后用孔徑為80 μm和10 μm的尼龍網(wǎng)過濾。將所得到的細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整密度為1×108～1×109/L, 置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換液1次，第9天將培養(yǎng)的的星形膠質(zhì)細(xì)胞置于水浴恒溫振蕩器上，在37 ℃、260 r/min條件下振搖 2 h以去除貼壁不牢的小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。仍貼壁的星形膠質(zhì)細(xì)胞用0.25%的胰酶消化分散后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳2～3代后進(jìn)行實(shí)驗。經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)鑒定，星形膠質(zhì)細(xì)胞純度在95%以上(圖1)。星形膠質(zhì)細(xì)胞以3 mmol/L氯化銨刺激，AG1478(1 μmol/L)、染料木黃酮(70 μmol/L)、U0126(10 μmol/L)及LY294002(25 μmol/L)于加入氯化銨前30 min加入。

Figure 1. Identification of the purity of astrocyte cultures.

圖1星形膠質(zhì)細(xì)胞純度鑒定

2.2Western blot實(shí)驗 細(xì)胞以預(yù)冷PBS洗3遍，加入RIPA細(xì)胞裂解液 [臨用前加入0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)] 提取細(xì)胞總蛋白，或用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白。BCA法測定蛋白濃度后行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳完成后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene di-fluoride，PVDF)膜。用1% BSA封閉1 h，接著加待檢測蛋白的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。TBST充分洗膜后，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗室溫孵育2 h。TBST洗膜后，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液顯色。 利用Quantity One軟件(Bio-Rad)對條帶灰度進(jìn)行分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1AG1478及染料木黃酮對氨所致星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK活化的作用

與對照組相比，3 mmol/L氯化銨刺激組星形膠質(zhì)細(xì)胞的p-ERK蛋白水平顯著增加。EGFR特異性抑制劑AG1478組及染料木黃酮組的p-ERK蛋白水平與對照組無顯著區(qū)別。AG1478+氯化銨組及染料木黃酮+氯化銨組的p-ERK蛋白水平與氯化銨組比較明顯降低，見圖2。

2AG1478及染料木黃酮對氨所致星形膠質(zhì)細(xì)胞Akt活化的作用

與對照組相比，3 mmol/L氯化銨刺激組星形膠質(zhì)細(xì)胞p-Akt的蛋白水平顯著增加。EGFR特異性抑制劑AG1478組及染料木黃酮組的p-Akt蛋白水平與對照組無顯著區(qū)別。AG1478+氯化銨組及染料木黃酮+氯化銨組的p-Akt蛋白水平與氯化銨組比較明顯降低，見圖3。

Figure 2. The effects of AG1478 (A) and genistein (B) on ammonia-induced ERK activation in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsNH4Cl.

圖2AG1478及染料木黃酮對氨所致星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK活化的影響

Figure 3. The effects of AG1478 and genistein on ammonia-induced Akt activation in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsNH4Cl.

圖3AG1478及染料木黃酮對氨所致星形膠質(zhì)細(xì)胞Akt活化的影響

3U0126、LY294002、染料木黃酮及AG1478對氨致星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB活化的作用

與對照組相比，3 mmol/L氯化銨刺激組星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB的核轉(zhuǎn)位顯著增加。U0126不影響氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位，但LY294002、染料木黃酮及AG1478則可顯著抑制氨誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位，見圖4。

討 論

EGFR是存在于細(xì)胞表面的、能夠介導(dǎo)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的RTK型受體。除了直接由其同源配體EGF誘導(dǎo)活化外，還可被H2O2、各種細(xì)胞因子及G蛋白偶聯(lián)受體等間接激活。激活后的EGFR將信號整合至下游的各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8-9]。

Figure 4. The effects of LY294002, U0126, genistein and AG1478 on ammonia-induced NF-κB nuclear translocation in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNH4Cl group.

圖4U0126、LY294002、染料木黃酮及AG1478對氨所致星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響

我們之前研究證實(shí)，EGFR轉(zhuǎn)激活在氨致星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫中具有重要作用。EGFR磷酸化激活后可誘導(dǎo)其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活化，如Ras/Raf/MEK/ERK及PI3K/Akt。MEK特異性抑制劑U0126及PI3K特異性抑制劑可抑制氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫[5]。作為一種廣譜的酪氨酸激酶抑制劑，研究人員更多地關(guān)注染料木黃酮的抗腫瘤活性[10-11]?；谇捌谘芯?，我們最近嘗試將染料木黃酮用于對氨刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)，發(fā)現(xiàn)該天然物質(zhì)可顯著抑制氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫[6]。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)染料木黃酮對星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的抑制可能與其對氨刺激下ERK和Akt活化的抑制有關(guān)。

作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB可調(diào)控各種應(yīng)激刺激下DNA的轉(zhuǎn)錄。其基本過程為受到刺激后，IκBα首先磷酸化降解，從而釋放出與其結(jié)合的NF-κB p65亞單位，游離的p65隨后便轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)[12-13]。研究顯示，氨可刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)IκB的降解和NF-κB的核轉(zhuǎn)位，而阻止NF-κB的轉(zhuǎn)位則可完全抑制氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫，說明NF-κB的活化是氨介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性的重要機(jī)制[13]。雖然已有研究顯示染料木黃酮可通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位活化發(fā)揮其藥理活性，但目前對該天然物質(zhì)是否影響氨誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)位活化尚不清楚。在本研究中我們證實(shí)染料木黃酮對氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB的活化具有顯著的抑制作用。同時 ，我們還發(fā)現(xiàn)LY294002對氨誘導(dǎo)的NF-κB也具有顯著的抑制作用。據(jù)此，我們推測染料木黃酮抑制NF-κB活化的機(jī)理可能源于其對Akt的抑制。

近年來，天然藥物因其低毒高效的特點(diǎn)日益引起了科研人員的關(guān)注[14-15]。目前，臨床上所使用的治療肝性腦病的藥物副作用大，且效果并不確定[4]。本研究證實(shí)染料木黃酮可顯著抑制氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK活化，以及Akt介導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位活化，這些作用可能是該天然物質(zhì)抑制氨誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的重要機(jī)制。而且，需要特別指出的是，由于肝性腦病經(jīng)常出現(xiàn)于肝細(xì)胞癌晚期的病人身上[16]，而染料木黃酮具有抗肝細(xì)胞癌的活性[6,17]，因而價格低廉、副作用少的染料木黃酮可能尤其適用于肝癌合并肝性腦病的患者。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of genistein on ammonia-induced NF-κB activation in astrocytes

YANG Dan1, JIA Gui-zhi2, CHU Ming-hui3, DAI Hong-liang4

(1The First Affiliated Hospital,2Department of Physiology, College of Basic Medical Sciences,3School of Nursing, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China. E-mail: jy2006hldai@sohu.com)

AIM: To explore the effect of genistein on ammonia-induced nuclear factor-κB (NF-κB) activation and the underlying mechanism.METHODS: Primary astrocyte cultures were prepared and challenged with NH4Cl to establish a hyperammonemic model. The activation of ERK, Akt and NF-κB was examined by Western blot.RESULTS: AG1478 and genistein significantly inhibited ammonia-induced activation of ERK and Akt. Ammonia-induced NF-κB nuclear translocation was significantly inhibited by the pretreatment of LY294002, genistein and AG1478.CONCLUSION: Genistein significantly inhibited ammonia-induced ERK activation and Akt-mediated NF-κB activation, which might represent the important mechanism by which this naturally occurring substance exerts its swelling-inhibiting effect.

Genistein; Ammonia; Astrocytes; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2017)09- 1598- 04

2016- 12- 11 [

] 2017- 05- 27

遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(No. 2015020360)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金-奧鴻博澤基金(No. XZJJ20140111)；2015年遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(乙類)(No. 201510160000035)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金-奧鴻博澤大學(xué)生科技創(chuàng)新基金(No. 2015D20)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.010

△通訊作者 Tel: 0416-4673688; E-mail: jy2006hldai@sohu.com