鄧益斌， 肖樹榮， 許桂丹， 黃贊松

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣西 百色 533000)

反義鎖核酸封閉c-myc第二外顯子翻譯起始區(qū)對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響*

鄧益斌， 肖樹榮， 許桂丹， 黃贊松△

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣西 百色 533000)

目的： 探討針對(duì)c-myc第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義鎖核酸對(duì)肝癌細(xì)胞活力和凋亡的影響。方法: 設(shè)計(jì)合成能特異性封閉c-myc基因第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義寡核苷酸、硫代寡核苷酸和鎖核酸，分別以陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)c-Myc的mRNA表達(dá)變化；Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)c-Myc的蛋白表達(dá)變化；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；MTT法檢測(cè)反義鎖核酸的細(xì)胞毒性作用。結(jié)果: 轉(zhuǎn)染第5天后，反義鎖核酸組c-Myc的mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.335±0.016，明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.448±0.037，也明顯低于對(duì)照組(P<0.01)；凋亡細(xì)胞比例為32%±6%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論: 針對(duì)c-myc第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義鎖核酸能有效促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。

肝細(xì)胞癌；c-myc基因； 反義鎖核酸

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤之一，占我國肝癌的90%以上，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，自20世紀(jì)90年代起，我國肝癌死亡率上升為腫瘤的第2位。c-myc是細(xì)胞原癌基因之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，位于人類染色體8q24區(qū)，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，其中第1外顯子無編碼序列，只起調(diào)控作用，第2、3外顯子共同編碼包含439個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，該蛋白主要與Max形成異二聚體后再與DNA核心序列結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[1-3]。據(jù)此推測(cè)，針對(duì)c-myc第二外顯子翻譯起始區(qū)設(shè)計(jì)合成反義鎖核酸有可能會(huì)影響c-Myc的mRNA及蛋白的表達(dá)，通過影響腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，在前期研究基礎(chǔ)上[4-7]，我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成能特異性封閉c-myc基因第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義鎖核酸(antisense locked nucleic acid，anti-LNA)，以陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，觀察其對(duì)c-Myc的mRNA及蛋白表達(dá)的影響，以期為抗肝癌基因治療尋找一種新型分子藥物。

材料和方法

1細(xì)胞系

HepG2肝癌細(xì)胞株由中國人民解放軍廣州軍區(qū)空軍醫(yī)院劉光澤博士惠贈(zèng)，常規(guī)培養(yǎng)于含G418和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下5～6 d傳代1次。

2主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基和G418(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen)；RNA抽提試劑盒(Sangon)；寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸、禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq酶、緩沖液、三磷酸脫氧核苷酸等(TaKaRa)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司)；BCA蛋白定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉(SDS)、硝酸纖維膜、ECL發(fā)光液等(Sigma)。實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI)；FACS AriaTM流式細(xì)胞分析儀(BD)；半干電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(Bio-Rad)。

3方法

3.1反義LNA設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)反義寡核苷酸作用原理及設(shè)計(jì)原則，利用RNAstructure 5.0軟件設(shè)計(jì)并篩選出一條總自由能最低的互補(bǔ)于c-myc第2外顯子翻譯起始區(qū)(368～390 nt)的寡核苷酸片段，修飾如下：(1)LNA：5′-TGA△AGCT△ACCGT△ACT△ACGA△C-3′；(2)硫代寡核苷酸：5′-TGA#AGCT#ACCGT#ACT#ACGA#C-3′；(3)未修飾寡核苷酸：5′-TGAAGCTACCGTACTACGAC-3′；(4)無關(guān)序列：5′-CGCTATGTAATGCGCTATGG-3′。其中，△代表LNA修飾，#代表硫代修飾。各序列經(jīng)BLAST排除與人同源后由GeneLink合成修飾并純化。

3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組為空白對(duì)照(blank)組。實(shí)驗(yàn)組包括未修飾寡核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)組、硫代寡核苷酸(phosphorothioate oligodeoxynucleotide，S-ODN)組和anti-LNA組。將HepG2細(xì)胞按1×108/L接種于16孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，共設(shè)6個(gè)組，每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，分別在各組每孔中加入含LNA(或寡核苷酸)的脂質(zhì)體-DMEM混合液1 mL，培養(yǎng)后第5天收集細(xì)胞進(jìn)行mRNA、蛋白等指標(biāo)檢測(cè)。轉(zhuǎn)染按脂質(zhì)體說明書操作。

3.3c-Myc的mRNA檢測(cè) (1)RNA提?。河诩?xì)胞收集管中加入RNA抽提試劑1 mL，迅速置于冰上，加入0.2 mL氯仿，室溫靜置15 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入0.5 mL異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入75%焦碳酸二乙酯乙醇溶液1 mL，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min；棄上清液室溫干燥5 min，溶于焦碳酸二乙酯無菌水中。(2)RNA逆轉(zhuǎn)錄：根據(jù)目的基因片段堿基序列利用軟件設(shè)計(jì)并評(píng)價(jià)引物，交由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成純化。在微反應(yīng)管中配制模板RNA和引物(各組均取上下游引物)混合液，總體積為12 μL。65 ℃ 5 min后，冰上迅速冷卻。加入2×PCR預(yù)反應(yīng)液8 μL，輕輕混勻，室溫靜置10 min，移入42 ℃恒溫箱中保溫60 min后，升至70 ℃保溫10 min，移到冰中冷卻2 min。(3)cDNA擴(kuò)增：上述反應(yīng)管移入PCR擴(kuò)增儀中(上游引物為5′-TCAACGTTAGCTTCACCAAC-3′，下游引物為5′-TGGGCGAGCTGCTGTCGT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為245 bp)。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并與內(nèi)參照β-actin(550 bp)電泳條帶比較，計(jì)算相對(duì)灰度比值。

3.4c-Myc蛋白的檢測(cè) 收集細(xì)胞棄上清，用RIPA細(xì)胞裂解液[0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.5)，0.15 mol/L NaCl，1% Triton X-100，0.1% SDS (pH 7.4)，臨用前加入PMSF 100 mmol/L]重懸，轉(zhuǎn)入Eppendorf管，冰上靜置1 h，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。取上清于新Eppendorf管，提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量，于-70 ℃保存。取30 μg蛋白質(zhì)樣品與緩沖液[100 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)，200 mmol/L DTT，4% SDS，0.2%溴酚藍(lán)，20%甘油]混合煮沸5 min,變性后點(diǎn)樣于預(yù)先制備好的12% SDS-PAGE電泳膠板上，30～40 mA電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠板底部時(shí)停止電泳。取預(yù)處理過的2張3 mm濾紙和1張硝酸纖維膜，按濾紙、凝膠、硝酸纖維膜、濾紙的順序放入半干電轉(zhuǎn)儀的正極板上，接好負(fù)極板后，10～12 V電轉(zhuǎn)30 min。采用ECL發(fā)光液試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，并利用凝膠圖像分析系統(tǒng)曝光、拍照和定量分析。

3.5HepG2細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡情況。根據(jù)雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖來判斷結(jié)果:左上象限(Q1)為損傷細(xì)胞,右上象限(Q2)為壞死細(xì)胞,左下象限(Q3)為活細(xì)胞,右下象限(Q4)為凋亡細(xì)胞。嚴(yán)格按試劑盒說明書和儀器說明書操作。

3.6反義LNA的細(xì)胞毒性的檢測(cè) 采用MTT比色法檢測(cè)反義LNA對(duì)細(xì)胞活性的影響。采用含10%胎牛血清培養(yǎng)液配制單細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)5 d后，每孔加MTT溶液(5 g/L，pH 7.4)200 μL，孵育4 h后，終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)值。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。各組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析的SNK-q檢驗(yàn)和Kruskal Wallis H檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1反義LNA對(duì)c-MycmRNA表達(dá)的抑制作用

與對(duì)照組相比，硫代寡核苷酸組和反義鎖核酸組肝細(xì)胞中c-Myc的mRNA表達(dá)量均明顯下調(diào)，其中反義鎖核酸組下調(diào)尤為明顯(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The relative mRNA expression of c-Myc in the HepG2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsanti-LNA group.

圖1各組肝癌細(xì)胞c-Myc的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2反義LNA對(duì)c-Myc蛋白表達(dá)的抑制作用

與對(duì)照組相比，反義鎖核酸組肝細(xì)胞中c-Myc蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.01)，見圖2。

3反義LNA對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染第5天后，硫代寡核苷酸組和反義鎖核酸組的凋亡細(xì)胞比例均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，反義鎖核酸組的凋亡細(xì)胞比例更高一些，見圖3。

Figure 2. c-Myc protein expression level in HepG2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsAnti-LNA group.

圖2各組肝細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)水平

Figure 3. The apoptotic rate of HepG2 cells induced by anti-LNA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsanti-LNA group.

圖3各組肝癌細(xì)胞的凋亡情況

4反義LNA對(duì)細(xì)胞的毒性作用

用藥5 d后，采用MTT比色法測(cè)定各組A值，未修飾寡核苷酸組、硫代寡核苷酸組和反義鎖核酸組的A值分別為1.18±0.05、1.16±0.04和1.15±0.05，與空白對(duì)照組(1.39±0.04)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

Figure 4. The absorbance values of the HepG2 cells. Mean±SD.n=6.

圖4各組肝癌細(xì)胞吸光度值

討 論

目前認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化是一個(gè)由多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異?；罨苟喾N癌基因或抑癌基因表達(dá)異常，進(jìn)一步促進(jìn)癌癥細(xì)胞異常增殖的多環(huán)節(jié)、多階段、多步驟的復(fù)雜過程，而癌基因突變則是腫瘤細(xì)胞增殖的分子基礎(chǔ)[8]。常見的癌基因有c-myc(增殖相關(guān)基因)、N-ras(轉(zhuǎn)化基因)等，其中c-myc是新近研究發(fā)現(xiàn)的與肝細(xì)胞癌變密切相關(guān)的癌基因，是myc基因家族的重要成員之一，其編碼蛋白屬于核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)細(xì)胞生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞凋亡與增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用[9-11]。因而推測(cè)，封閉c-myc第二外顯子翻譯起始區(qū)的基因表達(dá)有可能會(huì)影響c-Myc mRNA及蛋白的表達(dá)，進(jìn)而可能會(huì)影響腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)合成能特異性封閉c-myc基因第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義鎖核酸片段，以陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、Western blot等分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)c-Myc的mRNA及蛋白表達(dá)情況，評(píng)估反義鎖核酸的抗病毒效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反義鎖核酸作用 5 d后，c-Myc的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均較對(duì)照組明顯下降，且細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯增多。因此認(rèn)為，針對(duì)c-myc基因第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義鎖核酸可有效干擾c-myc基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 宋延君)

Effect of antisense locked nucleic acid blocking translation initiation region of c-myc exon 2 on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells

DENG Yi-bin, XIAO Shu-rong, XU Gui-dan, HUANG Zan-song

(Center for Medical Laboratory Science, The Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, China. E-mail: 1019846481@qq.com)

AIM: To observe the effect of antisense locked nucleic acid (anti-LNA) blocking the translation initiation region ofc-mycexon 2 on the viability and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.METHODS: The anti-LNA that was complementary to the translation initiation region ofc-mycexon 2 was designed, synthesized, and introduced into the HepG2 cells by cationic liposome-mediated transfection. The mRNA and protein levels of c-Myc in the cells were determined by RT-PCR and Western blot. The change of cell apoptosis was analyzed by flow cytometry, and the toxicity of anti-LNA to the cells was detected by MTT assay.RESULTS: Five days after transfection, the mRNA level of c-Myc in anti-LNA group was 0.335±0.016, and the protein level was 0.448±0.037, significantly lower than those in control group (bothP<0.05). The ratio of apoptotic cells in anti-LNA group was 32%±6%, which was higher than that in control group (P<0.05).CONCLUSION: Antisense locked nucleic acid targeting at the translation initiation region ofc-mycexon 2 shows strong inhibitory effects on the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.

Hepatocellular carcinoma;c-mycgene; Antisense locked nucleic acid

1000- 4718(2017)09- 1602- 04

2016- 09- 12 [

] 2017- 05- 02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81460123)；廣西衛(wèi)生廳立項(xiàng)課題(No. Z2010084)；自治區(qū)級(jí)研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(No. 201601005)

R961； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.011

△通訊作者 Tel: 0776-2846532； E-mail: 1019846481@qq.com