范蕊芳， 鄒麗媛， 郝秀蘭， 盧佩梅， 曾軍榮， 蔡東蘭， 劉相富

(中山大學附屬第三醫(yī)院 1預防保健科， 2產(chǎn)科， 3輸血科， 廣東 廣州 510630)

Pim-1激酶抑制劑SMI-4a抑制U937細胞增殖并誘導凋亡*

范蕊芳1， 鄒麗媛1， 郝秀蘭2， 盧佩梅1， 曾軍榮1， 蔡東蘭1， 劉相富3△

(中山大學附屬第三醫(yī)院1預防保健科，2產(chǎn)科，3輸血科， 廣東 廣州 510630)

目的： 研究絲/蘇氨酸蛋白激酶Pim-1抑制劑SMI- 4a對人類急性髓系白血病細胞株U937的生長抑制、促凋亡作用及其可能機制。方法: CCK-8法檢測不同濃度SMI- 4a作用不同時間對U937細胞的生長抑制率；Annexin V-PI及Hoechst 33342染色法檢測SMI- 4a作用前后細胞凋亡情況，集落形成實驗檢測SMI- 4a對U937細胞集落形成能力的影響；Western blot法檢測SMI- 4a對U937細胞核及細胞漿內(nèi)β-catenin表達變化及細胞內(nèi)凋亡相關蛋白的表達變化；免疫熒光法檢測β-catenin在細胞內(nèi)的表達變化。結果: CCK-8結果顯示SMI- 4a可以抑制U937細胞的活力，并呈時間和劑量依賴性；Annexin V-PI及Hoechst 33342染色結果顯示SMI- 4a可以促進U937細胞凋亡；集落形成實驗證實SMI- 4a可以抑制U937細胞的集落形成能力；Western blot實驗結果顯示SMI- 4a 作用于U937細胞48 h后細胞漿內(nèi)的β-catenin表達增加，細胞核內(nèi)的β-catenin表達減少，細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax和PARP表達增強，抑凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減弱；免疫熒光進一步驗證了SMI- 4a 作用后的U937細胞核內(nèi)的β-catenin表達量明顯減少。結論: SMI- 4a誘導U937細胞凋亡是通過上調(diào)促凋亡基因的表達、下調(diào)凋亡抑制基因的表達來實現(xiàn)的。

Pim-1激酶； SMI- 4a； 急性髓細胞白血?。?細胞凋亡

Pim-1激酶是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其編碼基因pim-1最早是作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入點而被發(fā)現(xiàn)的[1]。Pim-1的異常表達可以阻斷多種凋亡誘導通路，使得異常細胞得以存活，同時還可以干擾細胞周期的正常調(diào)控，誘發(fā)染色體分離失敗及多倍性出現(xiàn)，最終形成各種惡性腫瘤[2]。Pim-1對正常造血細胞和造血系統(tǒng)惡性腫瘤細胞的增殖和分化均有重要調(diào)節(jié)作用[3- 4]，靶向Pim-1為我們提供了一個治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的新策略。SMI- 4a為選擇性Pim-1小分子抑制劑，研究表明SMI- 4a在體內(nèi)和體外均能顯著抑制Pim-1活性，SMI- 4a既可以通過抑制H3磷酸化進而抑制RNA合成，又可以通過降低4EBP1的磷酸化水平而抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程[5]。此外，SMI- 4a可以調(diào)節(jié)多種信號轉導通路，誘導腫瘤細胞的凋亡[6]。本課題主要研究SMI- 4a對人類急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)細胞株U937的生長抑制、誘導凋亡作用，檢測SMI- 4a對β-catenin在細胞內(nèi)轉位的影響及其下游相關蛋白表達情況，探討SMI- 4a可能的抗白血病作用機制。

材料和方法

1主要試劑

SMI- 4a和Hoechst 33342購自Sigma；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone；CCK-8試劑盒購自Dojindo；Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；細胞漿與細胞核蛋白提取試劑盒購自碧云天；各種 I 抗購自Cell Signaling Technology；HRP標記的 II 抗購自 Protein Group；Alexa Fluor 594熒光Ⅱ抗購自Invitrogen；甲基纖維素購自R&D；其它生化試劑為進口分裝或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2主要方法

2.1細胞培養(yǎng) U937細胞株為中山大學附屬第三醫(yī)院血液科實驗室保存，使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗并根據(jù)實驗需要分組。

2.2CCK-8法檢測藥物對U937細胞活力的影響 U937細胞培養(yǎng)于96孔板，分別給予不同濃度 (0、5、10、20、40、60和80 μmol/L) 的SMI- 4a作用24和48 h，從急性髓系白血病患者骨髓提取單個核細胞，健康志愿者外周血提取單個核細胞稀釋后按照每孔1×104細胞培養(yǎng)于96孔板中，加入上述濃度SMI- 4a作用24 h，檢測前每孔加入10 μL CCK-8溶液， 繼續(xù)孵育4 h，于 450 nm 波長的酶標儀測定吸光度值。

2.3Annexin V-PI法檢測細胞凋亡 收集細胞后予PBS洗滌2次，1 000 r/min 離心 5 min，將細胞重懸于500 μL的binding buffer，先后加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，輕輕混勻，避光放置15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，實驗重復3次。

2.4細胞凋亡的形態(tài)學觀察 收集細胞后予PBS洗滌1次，加入Hoechst 33342(10 mg/L)染液500 μL，混勻后置于37 ℃ 水浴鍋中孵育15 min，PBS洗滌3次，在有紫外光的熒光顯微鏡下觀察，并隨機拍照，計數(shù)凋亡細胞的數(shù)量，實驗重復3次。

2.5甲基纖維素集落形成實驗 將空白對照(control)組及藥物處理后的U937細胞培養(yǎng)于甲基纖維素中，5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后觀察集落形成情況。

2.6Western blot檢測細胞相關蛋白的表達 收集細胞后加入細胞裂解液充分裂解細胞，離心取上清即為細胞內(nèi)總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，細胞漿與細胞核蛋白提取試劑盒提取細胞漿與細胞核蛋白，BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白上樣，8%～12% SDS-PAGE 進行蛋白分離，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，TBST洗滌1次，麗春紅染色后置于5% 牛血清白蛋白封閉液中封閉1 h，加入相應 I 抗孵育4 ℃ 過夜，TBST洗滌3次后加入 II 抗孵育1 h，于暗室中曝光。β-actin作為胞漿蛋白的內(nèi)參照，組蛋白H3作為核蛋白的內(nèi)參照。

2.7免疫熒光法檢測細胞核內(nèi)β-catenin的表達變化 收集細胞后用PBS洗滌1次，離心，PBS重懸調(diào)整細胞濃度為1.0×109/L，甩片，4% 多聚甲醛固定，4 ℃ 放置固定40 min，然后加入0.1% Triton X-100破膜，室溫下用3% BSA封閉1 h；PBS洗滌后用3% BSA稀釋 I 抗(1∶40)，4 ℃ 孵育過夜，PBS洗3次后滴加熒光標記的 II 抗，室溫避光孵育1 h。把Hoechst (1 000×)用PBS稀釋，每片50 μL，避光染色10 min，用PBS洗3次后封片(mounting medium)，拍照。

3統(tǒng)計學處理

使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時，組間多重比較采用LSD-t檢驗，方差不齊，組間多重比較采用秩和檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1SMI-4a對U937細胞活力的抑制作用

CCK-8法檢測結果顯示，經(jīng)5、10、20、40、60和80 μmol/L的SMI- 4a作用24和48 h后U937細胞的活力與對照組相比均顯著降低(P<0.01)，并可見SMI- 4a對U937細胞的生長抑制作用呈時間和劑量依賴性，見圖1A。不同濃度的SMI- 4a作用于AML患者原代細胞24 h后細胞活力均顯著低于同濃度的SMI- 4作用于正常人外周血單個核細胞24 h后的細胞活力(P<0.05或P<0.01)，表明SMI- 4a對AML患者原代細胞活力的抑制作用明顯大于對正常人外周血單個核細胞活力的抑制作用，見圖1B。

Figure 1. SMI- 4a inhibited the viability of AML cells. A: U937 cells were treated with various concentration of SMI- 4a for 24 h and 48 h; B: mononuclear cells in bone marrow from the patients with AML and peripheral blood mononuclear cells from normal individuals were exposed to different concentrations of SMI- 4a for 24 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01vsnormal group.

圖1SMI-4a抑制AML細胞活力

2SMI-4a誘導U937細胞凋亡

Annexin V-PI雙染流式細胞術檢測結果顯示，與對照組相比，20、40和80 μmol/L的SMI- 4a作用于U937細胞24和48 h的凋亡率均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，可見SMI- 4a可以誘導U937細胞凋亡，見圖2A。Hoechst 33342染色結果顯示，20、40和80 μmol/L的SMI- 4a處理了48 h的U937細胞，可以在顯微鏡下觀察到部分細胞核碎裂，計數(shù)100個細胞，凋亡率均顯著高于對照組(P<0.01)，進一步證實SMI- 4a可以誘導U937細胞凋亡，見圖2B。

3SMI-4a抑制U937細胞集落形成

甲基纖維素集落形成實驗結果顯示，經(jīng)過7 d培養(yǎng)，20和40 μmol/L SMI- 4a處理過的細胞集落形成率均顯著低于對照組(P<0.01)，而80 μmol/L SMI- 4a組未見集落形成，提示SMI- 4a可以抑制U937細胞的集落形成能力，見圖3。

4SMI-4a對U937細胞內(nèi)相關蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示20、40和80 μmol/L的SMI- 4a作用于U937細胞48 h后，與對照組相比， PARP和Bax蛋白的表達增加，Bcl-2蛋白的表達下降，細胞漿內(nèi)的β-catenin逐漸增加，細胞核內(nèi)的β-catenin逐漸減少，說明SMI- 4a可以抑制U937細胞內(nèi)β-catenin的轉位，見圖4。免疫熒光實驗進一步驗證了SMI- 4a處理過的U937細胞核內(nèi)β-catenin熒光表達量逐漸減少，見圖5。

討 論

急性髓系白血病是一種多基因異常所致的造血干細胞克隆性疾病，其生物學行為主要包括癌基因及抑癌基因的突變、各種生長因子及其受體的異常，這些異常引起其下游信號傳導通路的改變從而影響細胞的生長與分化，導致腫瘤的發(fā)生[7]。隨著新藥的不斷研發(fā)、治療方案和策略的逐漸優(yōu)化、支持治療條件的改善，急性髓系白血病的治療效果明顯提高，但仍有70%左右獲得緩解的患者最終復發(fā)并演變?yōu)殡y治性白血病，導致治療失敗而死亡[8]。白血病化療失敗最重要的原因是白血病細胞耐藥，因此，尋找新的分子靶點,對于提高急性髓系白血病的療效,改善其預后具有重要的臨床意義。

Pim激酶是一種絲/蘇氨酸激酶[9]。慢性髓細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和急性髓系白血病患者中Pim激酶的表達接近正常的3倍，在慢性淋巴細胞白血病患者細胞內(nèi)Pim mRNA的水平接近正常的2倍[10-11]；在套細胞淋巴瘤患者中Pim激酶高表達與不良預后有關[12]。在持續(xù)表達酪氨酸激酶活性的白血病(TEL/JAK2、BCR/ABL、H4/PDGFβR)中Pim-1和Pim-2激酶的表達水平明顯升高，敲除pim-1可以明顯抑制這些白血病細胞的生長[4]。

Figure 2. SMI- 4a induced apoptosis in the U937 cells. A: U937 cells treated with SMI- 4a were stained with Annexin Ⅴ-PI and subjected to flow cytometry analysis; B: U937 cells treated SMI- 4a for 48 h were stained with Hoechst 333342 and examined under a fluorescence microscope (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2SMI-4a誘導U937細胞凋亡

Figure 3. SMI- 4a reduced colony formation capacity of AML cells. U937 cells treated with various concentrations of SMI- 4a were incubated in methylcellulose culture for 1 week and observed under microscope (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3SMI-4a抑制U937細胞集落形成能力

SMI- 4a是Pim-1激酶的小分子抑制劑，在體內(nèi)外均可顯著抑制Pim-1激酶活性。我們研究表明隨著SMI- 4a藥物濃度的增加，U937細胞的活力受到不同程度地抑制，這種抑制作用呈時間和劑量依賴性，而對正常人外周血單個核細胞的活力無明顯抑制作用。Annexin V-PI和Hoechst檢測結果均證實SMI- 4a可以誘導U937細胞凋亡，隨著藥物濃度增加及作用時間延長，SMI- 4a誘導凋亡作用越來越明顯，Wes-tern blot實驗結果顯示隨著SMI- 4a藥物濃度的增加，PARP和Bax的蛋白表達量是逐漸增加的，而Bcl-2的表達逐漸減少，考慮SMI- 4a可能是通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，與文獻報道一致[11]。β-catenin的轉位對于Wnt/β-catenin這條信號轉導通路的激活至關重要，我們檢測不同濃度SMI- 4a作用于U937細胞后細胞漿和細胞核內(nèi)β-catenin表達水平的變化，發(fā)現(xiàn)隨著SMI- 4a濃度的增加，U937細胞漿內(nèi)β-catenin表達水平逐漸增加，而細胞核內(nèi)β-catenin表達水平逐漸降低，免疫熒光檢測結果證實SMI- 4a作用后細胞核內(nèi)β-catenin表達量明顯減少，說明SMI- 4a對β-catenin的轉位有影響，SMI- 4a是否通過抑制β-catenin轉位進而調(diào)節(jié)凋亡相關基因的表達尚需進一步實驗驗證。

Figure 4. The effects of SMI- 4a on the protein expression in the U937 cells. A: the effects of SMI- 4a on the expression of apoptosis-related proteins； B: the effects of SMI- 4a on the expression of β-catenin in the cytosol and nucleus of U937 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4SMI-4a對U937細胞內(nèi)蛋白表達的影響

Figure 5. The expression of β-catenin in U937 cells. U937 cells were treated with 80 μmol/L SMI- 4a for 48 h and the expression level of β-catenin was examined by immunofluorescence (×400). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5SMI-4a對U937細胞核內(nèi)β-catenin表達的影響

本研究初步證實，SMI- 4a可以抑制U937細胞生長并誘導其凋亡。這將為單用或者聯(lián)合化療藥物治療急性髓系白血病提供理論基礎，為臨床提供新的治療選擇。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Pim-1 kinase inhibitor SMI- 4a inhibits proliferation and induces apoptosis in U937 cells

FAN Rui-fang1, ZOU Li-yuan1, HAO Xiu-lan2, LU Pei-mei1, ZENG Jun-rong1, CAI Dong-lan1, LIU Xiang-fu3

(1Prevention Department of Health,2Department of Obstetrics,3Department of Blood Transfusion, The Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, China. E-mail: etoly@163.com)

AIM: To study the growth-inhibiting and proapoptotic effects of Pim-1 kinase inhibitor SMI- 4a on human acute myeloid leukemia cell line U937.METHODS: The effect of SMI- 4a on U937 cell viability was measured by CCK-8 assay. The apoptotic rate was assessed by flow cytometry with Annexin V-PI staining and by fluorescence microscopy with Hoechst 33342 staining. Methylcellulose was used to assess colony formation ability of the cells. The expression of β-catenin in the cell cytosol and nucleus was detected by Western blot, and the expression of apoptosis-related proteins in the U937 cells was also examined. Intracellular distribution of β-catenin was detected by the method of immunofluorescence.RESULTS: SMI- 4a inhibited the viability of U937 cells. Annexin V-PI staining showed that SMI- 4a induced apoptosis in dose- and time-dependent manners. Hoechst 33342 staining also verified the apoptosis. SMI- 4a significantly inhibited the colony formation capacity of the U937 cells. The results of Western blot demonstrated that SMI- 4a upregulated the expression of PARP and Bax, downregulated the expression of Bcl-2 and change the distribution of β-catenin in intracellular compartment. Immunofluorescence observation found that SMI- 4a decreased the expression level of β-catenin in the U937 cells.CONCLUSION: SMI- 4a induces U937 cell apoptosis through regulating the expression of apoptosis-related genes.

Pim-1 kinase； SMI- 4a; Acute myeloid leukemia; Apoptosis

1000- 4718(2017)09- 1625- 06

2017- 03- 07 [

] 2017- 06- 07

廣東省科技計劃(No. 2011B2080701008)

R733.7； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.015

△通訊作者 Tel: 020-85252234; E-mail: etoly@163.com