木 魁，姜 楠，溫海燕，李 響，高祥志，姜雙林

阜陽師范學院1.生命科學學院，2.胚胎發(fā)育與生殖調節(jié)安徽省重點實驗室，阜陽,236037

碳黑和碳黑與鉛復合物對人肺腺癌細胞A549毒性作用的比較

木 魁1,2，姜 楠1,2，溫海燕1,2，李 響1,2，高祥志1，姜雙林1,2

阜陽師范學院1.生命科學學院，2.胚胎發(fā)育與生殖調節(jié)安徽省重點實驗室，阜陽,236037

【目的】比較碳黑和碳黑與鉛復合物對人肺腺癌細胞A549的氧化損傷和凋亡方面的毒性。【方法】分別將濃度為40 μg/mL的碳黑和碳黑與鉛的復合物(硝酸鉛∶碳黑為250 ng∶1 g)暴露A549細胞，MTT法測定24、48、72 h時的細胞毒性；檢測細胞上清中乳酸脫氫酶(LDH)活力，胞內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)的活性和總蛋白含量；熒光染色法檢測細胞產生的活性氧(ROS)的含量；Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡?！窘Y果】處理組暴露24 h后A549細胞的存活率均降低，碳黑與鉛復合物最低，處理48 h和72 h與處理24 h的趨勢一致；處理組LDH和MDA均顯著高于對照組(P<0.05)，其中碳黑與鉛復合物最高；處理組CAT活性、SOD活性和GSH-Px含量均顯著低于對照組(P<0.01)，碳黑與鉛復合物最低；碳黑處理組ROS高于對照組，碳黑與鉛復合物處理組ROS最高；碳黑處理組凋亡率是空白組的2.73倍，碳黑與鉛復合物處理組凋亡率是對照組的4倍?！窘Y論】碳黑與鉛復合物和碳黑對A549細胞均產生細胞毒性，導致胞內抗氧化酶下降，細胞凋亡率增高，碳黑與鉛復合物比碳黑對A549細胞具有更強的毒性損傷。

碳黑；A549；毒性

我國黑碳顆粒的排放約占全球的四分之一，總量達到181.1×104t[1-2]。黑碳顆粒是PM2.5的主要組分之一，也是PM2.5傳輸和吸附有毒有害物質的載體，能誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生[3]。它的孔隙發(fā)達,粒徑小,比表面積大，能極強地吸附重金屬離子(如Pb、Cd、Zn、Mn、Cr等)，形成黑碳-污染物復合體[4]。

空氣中的鉛主要來源于燃油和燃煤排放，它與空氣中的黑碳結合，形成二次黑碳粒子，即黑碳與鉛復合物。Liu等通過黑碳(一次性黑碳)暴露于O3后制備的二次黑碳(黑碳-臭氧復合體)，氧化損傷和細胞毒性效應明顯增強[5]。Diabaté等研究了黑碳標準品、粉煤灰及其不同組分誘發(fā)人肺上皮細胞炎癥反應的機制，發(fā)現粉煤灰中不溶性過渡金屬組分Pb、Zn、Fe能誘導ROS的含量升高，并誘導產生HO-1、Nrf2以及IL-6、IL-8、COX-2和TNF-α等細胞因子基因的高表達；黑碳也能誘導ROS的產生，但不能誘導產生HO-1[6]。

本實驗采用商品化碳黑和碳黑與鉛復合物暴露A549細胞，通過對A549細胞內產生的活性氧含量、生理生化指標和凋亡率檢測，從而評估其毒性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

A549細胞培養(yǎng)液:RPMI1640培養(yǎng)基(南京建成生物工程研究所)，10%標準胎牛血清(南京建成生物工程研究所)，胰蛋白酶(Sigma公司)，噻唑藍(MTT,上海生物工程公司)，三聯溶解液(10%SDS，5%異丁醇，0.01 mol/L HCL)，總蛋白、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所)，細胞凋亡試劑盒(BD Pharmingen)，噻唑藍(上海生物工程公司)，Multiskan GO型酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2 碳黑和碳黑與鉛復合物懸液制備

實驗用碳黑為商品化碳黑C824455(麥克林)，碳黑與鉛的復合物在常溫下與硝酸鉛標準液混合，80℃水浴加熱攪拌至碳黑懸浮于溶液中，蒸干至恒重，然后轉到坩堝再置于馬弗爐中300℃加熱3 h制備成硝酸鉛與碳黑比例為250 ng∶1 g的樣品。經過與硝酸鉛復合的碳黑能穩(wěn)定結合，粒徑增大。用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基配置碳黑和碳黑與鉛的復合物1 mg·mL-1濃儲液，超聲30 min后備用。

1.3 細胞培養(yǎng)與暴露

用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，在CO2為5%，溫度為37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細胞。

1.4 MTT法檢測細胞活性

將上述1 mg·mL-1的濃儲備液稀釋成終濃度為40 μg·mL-1，以完全培養(yǎng)基作為空白對照，取對數期A549細胞，用0.25%的胰酶消化，然后離心、去上清、重懸、計數，制備成密度為1.0×105個/mL的細胞懸浮液，在96孔板上每個濃度設置4個重復和1個空白孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加入MTT 10 μL后繼續(xù)37℃孵育4 h，加入三聯溶解液100 μL再次37℃孵育4 h，直接在570 nm 處用酶標儀測量光度值。

1.5 細胞生理生化指標檢測

A549細胞分別暴露在空白組、40 μg/mL的碳黑和碳黑與鉛的復合物下24 h，收集上清，按照LDH試劑盒說明書操作，棄上清的細胞經過裂解液裂解收集，按照試劑盒說明書操作，測MDA、GSH-Px、CAT、SOD和總蛋白定量。

1.6 細胞內活性氧含量的檢測

A549細胞分別暴露在空白組、40 μg/mL的碳黑和碳黑與鉛的復合物下24 h，加入DCFH-DA探針，37℃孵育1 h，去除培養(yǎng)基，PBS沖洗兩次，加入胰酶消化，經過離心后棄掉細胞上清液，然后加入PBS吹打，使細胞重懸后進行熒光檢測。

1.7 細胞凋亡檢測

A549細胞分別暴露在空白組、40 μg/mL的碳黑和碳黑與鉛的復合物下24 h，按照試劑盒說明書操作，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.8 統(tǒng)計分析

用GraphPad Prism軟件對實驗數據進行分析。差異顯著性用2way ANOVA分析方法進行比較，其中P<0.05表明具有顯著性差異，P<0.01表示具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞活性的影響

圖1表明，碳黑處理24 h組A549細胞活性明顯低于空白組，碳黑與鉛復合物組A549細胞最低；處理時間為48 h和72 h與處理24 h碳黑和碳黑與鉛復合物趨勢一致，均表現為A549細胞活性降低的趨勢。說明碳黑與鉛復合物對A549細胞的毒性比碳黑更強。

圖1 碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞活性影響

2.2 碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞生化指標的影響

2.2.1 碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞損傷指標

如圖2A，碳黑處理組和碳黑與鉛復合物處理組LDH活性水平均顯著高于空白對照組(P<0.05)，碳黑與鉛復合物處理組LDH活性水平高于其他兩組(P<0.05)。如圖2B，碳黑處理組和碳黑與鉛復合物處理組MDA含量均顯著高于空白對照(P<0.01)，碳黑處理組比對照組MDA含量高1.8倍，碳黑與鉛復合物處理組比對照組MDA含量高1.9倍。各組間具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

圖2 碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞LDH和MDA含量影響

2.2.2 碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞酶活力的影響

如圖3A，碳黑處理組和碳黑與鉛復合物處理組SOD含量均低于對照組(P<0.01)，碳黑處理組比對照組SOD活性低17.40%，碳黑與鉛復合物處理組比對照組SOD活性低34.39%。如圖3B，碳黑處理組和碳黑與鉛復合物處理組GSH-Px活性均低于對照組，碳黑處理組比對照組GSH-Px活性低29.06%，碳黑與鉛復合物處理組比對照組GSH-Px活性低67.93%。如圖3C，碳黑處理組和碳黑與鉛復合物處理組CAT活性均低于對照組，碳黑處理組比對照組CAT活性低30.55%，碳黑與鉛復合物處理組比對照組CAT活性低74.10%，各組間具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

圖3 碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞酶活力影響

2.3 碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞ROS的影響

如圖4，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm，碳黑處理組ROS熒光強度高于對照組，碳黑與鉛復合物處理組ROS熒光強度明顯高于碳黑組和對照組。

2.4 碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞凋亡的影響

如圖5，采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞凋亡的影響，對照組僅有4.5%的細胞發(fā)生凋亡，碳黑處理組凋亡率為12.3%，碳黑與鉛復合物處理組為18.0%，均明顯高于對照組。

圖4 碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞凋亡的影響

圖5 碳黑和碳黑與鉛復合物對A549細胞凋亡的影響

3 結束語

黑碳是大氣細顆粒物PM2.5的主要組分之一，由生物質或化石燃料不完全燃燒產生的一種含碳的混合物[7]，能極強地吸附有毒有害物質(如重金屬離子、多環(huán)芳烴族、無機鹽等)，形成黑碳—污染物復合體[4]。黑碳顆粒形成的粒徑小于2.5 μm的大氣細顆粒物能隨呼吸進入肺泡，嚴重影響人體健康。關于PM2.5的毒性效應已得到學術界的廣泛證實，由于其組成復雜多樣，對其危害機理研究存在一定的困難。本文選取商品化碳黑，讓其與典型重金屬鉛的復合，比較兩者在A549細胞毒性影響，從而為研究PM2.5毒性損傷機理提供參考。

由于碳黑具有良好的吸附性，能吸附空氣中微量重金屬鉛，形成碳黑與鉛復合物。將此復合物暴露A549細胞后，導致A549細胞內產生大量ROS，胞內SOD、GSH-Px、CAT活性均顯著下降，細胞培養(yǎng)基上清LDH和胞內MDA含量顯著升高，細胞膜損傷，引起細胞大量凋亡。用MTT法檢測，存活細胞明顯減少，細胞毒性等各項指標顯著高于碳黑處理組。以上研究為PM2.5的毒性效應及其產生機制研究提供了一個新思路。關于碳黑與鉛復合物毒性顯著高于碳黑的機理尚需作進一步研究。

[1] Streets DG, Gupta S, Waldhoff ST, et al. Black carbon emissions in China[J].Atmos Environ, 2001, 35: 4281-4296

[2] Menon S,Hansen J,Nazarenko L,et al.Climate effects of black carbon aerosols in China and India[J].Science,2000,297:2250-2253

[3] Dockery DW, Pope CA, Xu X. An association between air pollution and mortality in six US cities[J]. N Engl J. Med,2003,329:1753-1759

[4] Pope CA,Hansen ML.Ambient particulate air pollution,heart rate variability,and blood markers of inflammation in a panel of elderly subjects[J].Environ.Health Persp, 2004,112:339-345

[5] Liu Y,Liu C,Ma Q,et al.Structural and hygroscopic changes of soot during heterogeneous reaction with O3[J]. Phys Chem Chem Phys,2010,12:10896-10903

[6] Diabaté S,Britta BB,Plaumann D,et al.Anti-oxidative and inflammatory responses induced by fly ash particles and carbon black in lung epithelial cells[J]. Anal Bioanal Chem, 2011,401:3197-3212

[7] Goldberg E D.Black carbon in the environment:properties and distribution[J].NewYork:John Wiley,2000

(責任編輯：汪材印)

X171.5

：A

：1673-2006(2017)07-0121-05

10.3969/j.issn.1673-2006.2017.07.032

2017-03-29

國家自然科學基金重大研究計劃項目“黑炭和黑炭-污染物復合體誘發(fā)肺部炎癥反應的作用機理研究”(91643113)。

木魁(1990-)，安徽亳州人，在讀碩士研究生，研究方向：環(huán)境毒理學。