徐玉剛 （山東省東平縣畜牧獸醫(yī)局 271500）

單味中藥對豬致病性腸道大腸桿菌抑菌作用觀察

徐玉剛 （山東省東平縣畜牧獸醫(yī)局 271500）

無菌采取發(fā)病仔豬的新鮮糞便，經(jīng)細菌的培養(yǎng)、分離、鑒定和小鼠致病性試驗，確定為致病性大腸桿菌。將21種中藥分別經(jīng)熬制處理后，制成濃度為1g/ml的藥液備用，采用紙片擴散法對分離所得的大腸桿菌進行體外抑菌試驗，并檢測抑菌效果較強中藥的最低抑菌濃度。結(jié)果表明，12種單味中藥對致病性大腸桿菌具有較強的抑菌作用。

大腸桿菌 分離鑒定 中藥 抑菌

豬大腸桿菌病(Colibocillosis)是由致病性大腸桿菌引起的一類仔豬腸道傳染病的總稱，該病在臨床上主要表現(xiàn)為嚴重腹瀉、脫水或敗血癥，該病嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展、公共衛(wèi)生和動物源性食品的安全[1]。大腸桿菌血清型多，抗原復(fù)雜，變異大，菌株易產(chǎn)生廣泛的耐藥性和多重耐藥性，許多中藥被證實具有抗菌作用，而且具有成本低、毒副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性，藥物殘留量低等特點，在防治感染性疾病方面已初顯成效[2]。本試驗以21種中藥對分離得到的腸道大腸桿菌進行了體外抑菌試驗以及最低抑菌濃度測定，以期為中藥在防治豬大腸桿菌病方面應(yīng)用提供理論依據(jù)[3]。解決了西藥對養(yǎng)殖業(yè)引起的大腸桿菌治療不徹底，并且?guī)в兴幬餁埩簦箘游镆鸶篂a，讓動物產(chǎn)生耐藥性，中藥的治療效果更加徹底，不帶有任何的副作用，使養(yǎng)殖更好的得到發(fā)展[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料采集 無菌采集病豬的新鮮糞便適量，裝入滅菌試管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 中藥 黃連、黃柏、黃芩、大黃、茵陳、連翹、升麻、秦艽、陳皮、青蒿、梔子、白頭翁、焦山楂、山楂、蒲公英、枳殼、龍膽草、蒼術(shù)、柴胡、藿香、葛根21味中藥。

1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基 葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、MR試驗、VP試驗、吲哚試驗、普通瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基等。

1.1.4 試驗動物及儀器 健康體重20g左右小白鼠6只。

1.1.5 試驗儀器 托盤天平、電磁爐、高壓蒸汽滅菌鍋、冰箱、無菌操作臺、離心機、試管、平皿、燒杯、光學(xué)顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱等。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離、純化 將病料用生理鹽水稀釋，無菌棉簽蘸取涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h；挑取單個菌落接種于麥康凱瓊脂板上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h；挑取可疑紅色中等大小光滑菌落接種于伊紅-美藍瓊脂板上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h；再挑取一半紫黑色帶金屬光澤的可疑菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，符合大腸桿菌特征的菌株初步確定為大腸桿菌，另一半接種到普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24h，以備進行生化試驗。

1.2.2 分離菌的生化鑒定 對分離的細菌進行糖發(fā)酵試驗(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖)、MR試驗、VP試驗、吲哚試驗，24～48h后觀察結(jié)果。

1.2.3 豬大腸桿菌的致病性試驗 經(jīng)生化試驗篩選出來的大腸桿菌接種于普通肉湯培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24h，稀釋至菌濃度1.5×108CFU/ml備用。取健康小鼠6只，隨機分成試驗組和對照組，試驗組腹腔注射菌液0.2ml/只，對照組腹腔注射滅菌的生理鹽水0.2ml/只，72h后觀察小鼠的死亡情況。

1.2.4 藥液制備 21味單味中藥各取10g，加蒸餾水100ml室溫浸泡30min后煮沸，再換文火加熱至1001h℃，過濾，濾渣加水100ml文火加熱30min，過濾，2次濾液合并濃縮至1g/ml，離心取上清液，121℃滅菌15min，將藥液無菌分裝入青霉素小瓶內(nèi)并貼上藥物名稱標簽，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 藥敏紙片的制備 將已用打孔器打好的6mm小濾紙圓片高壓滅菌，于無菌操作臺上用無菌鑷子分別夾入20片小濾紙圓片至各青霉素小瓶內(nèi)，充分浸泡24h放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 藥敏試驗 用紙片擴散法進行藥敏試驗：用無菌棉簽蘸取菌液涂抹于瓊脂平板中，用無菌鑷子夾取藥敏紙片均勻貼在培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，測定抑菌圈直徑，取其平均值。

1.2.7 最低抑菌濃度的測定 篩選出對致菌株具有較好抑制效果的中藥，采用試管2倍稀釋法，測定各中藥最小抑菌濃度，同時設(shè)無藥菌液對照管和純中藥對照管，把各管內(nèi)容物37℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。若培養(yǎng)液透明則直接判定結(jié)果；若培養(yǎng)液色澤較深不易判定結(jié)果，則培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液適量接種固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果，以無菌生長的最低稀釋度為各藥MIC[8]。

2 結(jié)果

2.1 細菌染色、鏡檢結(jié)果

該菌為兩端鈍圓、無芽孢、無莢膜、呈短桿狀菌、單個散在或成對存在、兩端著色較深、革蘭氏染色陰性。

2.2 生化試驗結(jié)果

生化試驗結(jié)果表明：葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，蔗糖、VP試驗結(jié)果為陰性，吲哚試驗和MR試驗結(jié)果為陽性。

2.3 大腸桿菌致病性試驗結(jié)果

接種分離菌的小白鼠后，3只小白鼠均死亡，對死亡的小鼠立即解剖，經(jīng)剖檢無菌取其臟器劃線于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上進行接種菌回收試驗，染色、鏡檢，證明與原分離菌特征一致，對照組小白鼠無異常。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

表1表明：白頭翁、黃連、黃柏、大黃、連翹、梔子、山楂、焦山楂具有較高的敏感性，黃芩、蒲公英、蒼術(shù)、藿香具有中度敏感性。

表1 中藥抑菌圈直徑及其敏感性 (mm)

2.5 最低抑菌濃度結(jié)果

表2 抑菌效果好的中藥最低抑菌濃度 (g/ml)

表2表明：不同單味中藥1株致病菌的最低濃度存在差異，其中黃連、大黃、梔子的最低抑菌濃度為62.5g/ml。

3 討論

（1）本試驗中，為確保分離菌株準確性和可靠性，先后通過菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色鏡檢、選擇性鑒別培養(yǎng)、各種生化反應(yīng)以及動物致病性試驗等，保證了從發(fā)病仔豬的糞便中分離的3株細菌為致病性大腸桿菌。動物致病性試驗結(jié)果表明，本試驗分離的2株菌均能在24h內(nèi)致死試驗小白鼠，致死率達100%，提示分離的大腸桿菌致病性很強，這進一步為該病的診斷提供了可靠依據(jù)[5]。（2）中藥對大腸桿菌的抑制效果本試驗結(jié)果表明，單味中草藥對致病菌的體外抑制效果普遍較弱，但黃芩、黃連、黃柏、連翹、等藥物抑菌效果較明顯，其共同點在于都具有清熱解毒、瀉火燥濕的功用。陳皮、葛根、青蒿等幾乎無抑菌作用，可能與實際結(jié)果存在一定差異，這可能與提取方法有關(guān)，也可能與菌種來源、種類及中藥產(chǎn)地、批次等各方面的差異有關(guān)。同時，在單味藥物中，“三黃”也表現(xiàn)出良好的抗菌活性，表明在抗菌、消炎等方面中藥黃芩、黃連、黃柏都具有較高的開發(fā)價值。MIC值可作為獸醫(yī)臨床選用抗菌藥物的主要依據(jù)。測定單味中藥MIC值時可以使中藥使用時更合理、更簡單、更科學(xué)，在生產(chǎn)中的實際運用效果可做進一步研究，使其在治療豬腸道疾病方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

通過細菌分離培養(yǎng)、生化試驗、小白鼠的致病性試驗等證明該病有致病性大腸桿菌引起。通過藥敏試驗，確定那些中藥對致病性大腸桿菌有較高的抑制效果，再通過最低抑菌濃度測定，既可以使大腸桿菌病得到較好的治療并且可以節(jié)省資金，減少可能引起的一些副作用。

[1] 王天有, 劉保國, 趙恒章. 豬傳染病現(xiàn)代診斷與防治技術(shù)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社. 2005: 314-316.

[2] 王自然. 中藥組方對豬大腸桿菌病的抑菌及臨床治療試驗[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2006, 42(2): 33-34.

[3] 安麗英. 獸醫(yī)實驗診斷[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社. 1998: 424-430.

[4] 廖延熊. 獸醫(yī)微生物實驗診斷手冊[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社. 1995: 122-130.

[5] 羅慶華等. 10種中草藥的體外抑菌試驗[J]. 中國獸醫(yī)科技, 2002: 38-39.

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