任振波，侯毅銳,鄭 偉

(1.長春市解放軍第208醫(yī)院,吉林 長春130062;2.長春市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科)

抗hCD20單抗所致B細(xì)胞減少可以提高CD20特異cTCR+T細(xì)胞存活

任振波1，侯毅銳2*,鄭 偉1

(1.長春市解放軍第208醫(yī)院,吉林 長春130062;2.長春市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科)

B細(xì)胞淋巴瘤/白血病是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，化療及造血干細(xì)胞移植的治療方法存在許多問題。尤其是難治與復(fù)發(fā)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病往往治療的成功率很低。數(shù)年前開展的嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)過繼免疫治療B細(xì)胞淋巴瘤/白血病技術(shù)，成功例數(shù)不斷增加，但有很多方面仍有待完善。本研究意在觀察輸注CAR-T細(xì)胞前給予抗CD20抗體進(jìn)行預(yù)處理B淋巴細(xì)胞是否減少及對(duì)CAR-T細(xì)胞活性是否有影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞系

Thy1.2+野生型(WT)鼠、Thy1.1+和Thy1.2+Bbalb/c鼠及CL4細(xì)胞TCR轉(zhuǎn)基因鼠購自美國The Jackson Laboratory。hCD20特異cTCR+T細(xì)胞通過BD Bioscience FACS(fluorescence activitied cell sorter)獲得。

1.2 試劑和儀器

CD20-CAR-T細(xì)胞購自ATCC(American type culture collection)。流式細(xì)胞儀為BD Bioscience的FACS(熒光激活細(xì)胞分離儀)；抗mCD20和抗hCD20單抗、ELISA試劑盒均為美國eBioscience公司產(chǎn)品。

1.3 鼠骨髓和脾細(xì)胞的制備

用二氧化碳窒息鼠后摘取淋巴結(jié)和脾臟，用40 μm濾網(wǎng)過濾生成單細(xì)胞懸液；骨髓用RPMI1640沖洗鼠股骨骨髓腔取得。

1.4 體外T細(xì)胞分析

用流式細(xì)胞儀測(cè)定T細(xì)胞的數(shù)量。

1.5 生物發(fā)光成像

將熒光素鉀注射鼠腹膜內(nèi)，然后用X線攝像，用軟件分析發(fā)光資料，單位為光子/s/cm2/sr。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件應(yīng)用SPSS 16．0，用t檢驗(yàn)比較兩樣本均數(shù)，P<0．05為差異有顯著性。

1.7 實(shí)驗(yàn)方法

(1)將抗hCD20單抗200 μg通過鼠尾靜脈注射Thy1.1+和Thy1.2+Bbalb/c鼠及CL4細(xì)胞TCR轉(zhuǎn)基因鼠后獲得B細(xì)胞減少的白血病鼠，取鼠血、淋巴結(jié)、骨髓和脾細(xì)胞用低滲液體溶解后用流式細(xì)胞儀分析B細(xì)胞。用Thy1.2+野生型(WT)鼠做對(duì)照。

(2)4天后將2×107熒光素酶+MB20-18+Thy1.1+CD8+T細(xì)胞和熒光素酶+MB20-18：CD3ζΔ+T細(xì)胞注入B細(xì)胞減少的鼠中，將熒光素酶+MB20-18+T細(xì)胞注入未經(jīng)抗體處理的(B細(xì)胞未減少的)鼠中，檢測(cè)cTCR+T細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 用流式細(xì)胞儀分析抗hCD20單抗處理hCD20鼠血液、淋巴結(jié)、脾及骨髓B細(xì)胞。24 h后淋巴結(jié)及骨髓成熟B細(xì)胞減少90%，脾臟B細(xì)胞減少80%，血B細(xì)胞減少89%，7天后淋巴結(jié)、骨髓及脾臟成熟B細(xì)胞減少超過90%。

2.2 MB20-18+T細(xì)胞在B細(xì)胞減少的白血病鼠中生物發(fā)光信號(hào)明顯增加(2倍，P>0.05)，骨髓中的峰值為3天(8倍增加；P<0.01)，頸部淋巴結(jié)6倍增加(P<0.01)圖1。T細(xì)胞注射后5天MB20-18+Thy1.1+CD8+T細(xì)胞的活性在B細(xì)胞減少的鼠骨髓、淋巴結(jié)和脾臟中比B細(xì)胞未減少的鼠中增強(qiáng)。

圖1 注射T細(xì)胞后時(shí)間與生物發(fā)光信號(hào)的關(guān)系

3 討論

已證實(shí)在過繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)入之前淋巴細(xì)胞減少及造血干細(xì)胞移植可以提高抗原特異性T細(xì)胞群的存活和功能[1,2-4]。然而，會(huì)出現(xiàn)與全淋巴細(xì)胞減少及自體干細(xì)胞移植有關(guān)的明顯的毒性反應(yīng)[5-8]，單純B細(xì)胞減少很少產(chǎn)生毒副作用[9]，卻促進(jìn)了可能導(dǎo)致抗白血病反應(yīng)的特異性抗原的增殖。在有微小殘留病灶(MRD)的情況下，將B細(xì)胞腫瘤相關(guān)抗原特異T細(xì)胞注入B細(xì)胞減少的病人體內(nèi)可能足以清除抗CD20單抗抵抗的疾病而不需要全淋巴細(xì)胞減少。

以前有報(bào)道用抗hCD20單抗處理hCD20鼠證明其血液、淋巴結(jié)脾及骨髓B細(xì)胞減少[10-12]。

為了提高CAR-T細(xì)胞療效及減少其副作用，各研究中心進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，效果不一。我們?cè)O(shè)計(jì)了在輸注CAR-T細(xì)胞前給予抗CD20抗體進(jìn)行預(yù)處理以減少B淋巴細(xì)胞，結(jié)果MB20-18+T細(xì)胞在B細(xì)胞減少的鼠中生物發(fā)光信號(hào)明顯增加。

為確定單克隆抗體介導(dǎo)的B細(xì)胞減少對(duì)mCD20特異cTCR+T細(xì)胞存活及功能的作用，給用CD20單抗處理的WT或hCD20鼠注射2×107MB20-18+熒光素酶+T細(xì)胞，給WT鼠注射無關(guān)Leu16+T細(xì)胞作為對(duì)照。hCD20鼠血中hCD20+mCD20+B細(xì)胞的減少可以使MB20-18+細(xì)胞從肺中排出，此與用無關(guān)的Leu16+細(xì)胞所觀察到的相一致[14]。

MB20-18+T細(xì)胞在B細(xì)胞減少的鼠中生物發(fā)光信號(hào)增加，其擴(kuò)增依靠cTCR，因?yàn)镸B20-18：CD3ζΔ+T細(xì)胞在B細(xì)胞減少的鼠中未見擴(kuò)增。T細(xì)胞注射后5天Thy1.1+MB20-18+T細(xì)胞的活性在B細(xì)胞減少的鼠骨髓、淋巴結(jié)和脾臟中比B細(xì)胞未減少的鼠中增強(qiáng)。

MB20-18+T細(xì)胞與MB20-18：CD3ζΔ+T細(xì)胞相比在脾和B細(xì)胞減少的鼠中顯示CD62L表達(dá)減少，但并沒有消失，可能反映了在與少量留存的B細(xì)胞反應(yīng)當(dāng)中cTCR引發(fā)的有限性[13,14]。在B細(xì)胞不缺乏的鼠中，MB20-18+T細(xì)胞不能在淋巴結(jié)中聚集可能反映了在與多B細(xì)胞反應(yīng)時(shí)的多cTCR觸發(fā)事件，導(dǎo)致存活降低，CD62L表達(dá)減少，移動(dòng)改變。這些結(jié)果表明在過繼輸入之前的B細(xì)胞減少可以促進(jìn)CD20特異cTCR+T細(xì)胞存活并且提高這些細(xì)胞移動(dòng)進(jìn)入白血病和淋巴瘤聚集的淋巴結(jié)和骨髓。

為確定B細(xì)胞減少是否能增加MB20-18+T細(xì)胞的抗B細(xì)胞活性，在注射T細(xì)胞5天后計(jì)數(shù)鼠脾細(xì)胞中的殘存的B細(xì)胞。用抗hCD20單抗預(yù)處理的鼠，MB20-18+T細(xì)胞使85%的脾殘存B細(xì)胞減少(P<0.001),與未減少的鼠相比導(dǎo)致95.8%的脾B細(xì)胞減少(P<0.001)。既往曾報(bào)道邊緣區(qū)B細(xì)胞對(duì)抗hCD20抗體介導(dǎo)的B細(xì)胞減少相對(duì)抵抗[10,12]，濾泡區(qū)和邊緣區(qū)B細(xì)胞比例在未減少的鼠中從10.5降至抗體致減少鼠的2.5。對(duì)比之下，MB20-18+T細(xì)胞能有效減少抗體抵抗邊緣區(qū)殘存B細(xì)胞，與MB20-18：CD3ζΔ+T/抗hCD20抗體處理的鼠相比邊緣區(qū)B細(xì)胞減少200倍。這些結(jié)果表明由抗體介導(dǎo)正常B細(xì)胞的減少揭示了CD20特異T細(xì)胞的抗B細(xì)胞活性，CD20特異T細(xì)胞可以使抗體抵抗的細(xì)胞清除。

注入的T細(xì)胞能否在腫瘤患者體內(nèi)持續(xù)存在為腫瘤過繼免疫治療成敗的關(guān)鍵。臨床實(shí)驗(yàn)證明過繼輸入的cTCR+T細(xì)胞僅能在有大量能產(chǎn)生抗原的患者體內(nèi)短暫存在[15,16]。有臨床研究結(jié)果顯示表達(dá)CD20的正常B細(xì)胞能降低CD20特異cTCR+T細(xì)胞的壽命和功能，抗體介導(dǎo)的B細(xì)胞減少可能提高CD20特異T細(xì)胞治療效果[17]。

我們的研究表明，在實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)抗CD20單抗誘發(fā)的B細(xì)胞減少明顯提高了CAR-T細(xì)胞在白血病體內(nèi)的活性，可以預(yù)測(cè)其抗白血病效果亦會(huì)有所提高。下一步可以在人體內(nèi)進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)在進(jìn)行CAR-T細(xì)胞治療B細(xì)胞淋巴瘤/白血病時(shí)用此預(yù)處理方法對(duì)治療效果的影響。

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吉林省科技廳項(xiàng)目資助(20160101165JC)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1426-03

2016-12-29)