張小全，許志文，闞洪贏，張林，張鋆鋆，郭傳濱，楊立均，夏宗良

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院 鄭州 450002;

2 河南省煙草公司駐馬店市公司 駐馬店 463000;

3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450002

農(nóng)藝與調(diào)制

不同葉位和離體失水時間對烤煙葉片保水能力的影響

張小全1，許志文1，闞洪贏1，張林1，張鋆鋆1，郭傳濱2，楊立均2，夏宗良3

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院 鄭州 450002;

2 河南省煙草公司駐馬店市公司 駐馬店 463000;

3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450002

為闡明葉位和離體時間對烤煙葉片保水能力的影響。以2個田間抗旱性不同的烤煙品種豫煙6號和農(nóng)大202的離體葉片為材料，采用離體葉片自然失水法，研究了不同葉位和離體時間對葉片失水率、抗氧化酶活性、激素和抗逆脅迫響應(yīng)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明：5個不同葉位的失水率為離體0～24 h較高，24 h后失水速率逐漸變緩，葉位間差異不顯著，農(nóng)大202失水率顯著高于豫煙6號；離體葉片內(nèi)抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、可溶性蛋白含量、脫落酸（ABA）含量均在離體24 h時達(dá)到最高值，丙二醛（MDA）含量也在24 h后增速變緩；4個脅迫響應(yīng)基因（AREB、CDPK2、ERD10C、LEA5）相對表達(dá)量也在24 h達(dá)到最高，說明烤煙葉片離體24 h生理代謝反應(yīng)最強，2個品種在離體24 h各指標(biāo)差異最大。因此，烤煙葉片保水力與取樣葉位關(guān)系不大，離體葉片失水24 h為測定煙草保水力的合適時間。

烤煙；葉片保水力；抗氧化酶活性；脅迫響應(yīng)基因

煙草起源于降雨充沛的熱帶，整個生育期對水分的需求都很高。我國多數(shù)優(yōu)質(zhì)煙區(qū)位于丘陵山區(qū)，季節(jié)性干旱嚴(yán)重影響煙葉質(zhì)量的提高和產(chǎn)量的穩(wěn)定[1]。通過改善生產(chǎn)條件和應(yīng)用栽培技術(shù)來緩解雨養(yǎng)煙區(qū)的水分脅迫問題是有限的，因此選育優(yōu)質(zhì)抗旱品種對穩(wěn)定和發(fā)展旱地?zé)熑~生產(chǎn)有著重要意義。鑒定抗旱相關(guān)性狀及不同品種的抗旱機制，成為煙草抗旱育種的重要前提?？购敌澡b定指標(biāo)多種多樣，有干旱條件下的生物量[2]、細(xì)胞膜透性[3]、氣孔阻力[4]、抗氧化酶活性[5]、葉片保水力[6]等。葉片保水力是葉片在離體條件下具有保持原有水分的能力，其保水力的強弱與植物遺傳性、細(xì)胞特性和原生質(zhì)膠體性質(zhì)有關(guān)，離體葉片的保水力可以反應(yīng)植物原生質(zhì)的耐脫水能力和葉片角質(zhì)層的保水能力，在一定時間內(nèi)含水量越高，表明葉片保水力越強，抗旱性也越強。Clarke等[7-10]最先研究了不同發(fā)育時期的葉片、不同離體時間的小麥葉片的保水力差異，并將葉片保水力作為小麥的抗旱性鑒定指標(biāo)。葉片保水力具有測定方法簡單、時間短、工作量小等優(yōu)點，目前在小麥[11]、玉米[12]、油菜[13]、煙草[14]、紅樹[15]等抗旱性鑒定當(dāng)中有大量應(yīng)用。煙草葉片較大、水分含量較高，國內(nèi)外大量研究在測定葉片保水力時，選用的葉位、離體時間不同，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[8,14]。本試驗擬對不同葉位和離體時間對烤煙葉片保水能力的影響進(jìn)行研究，以期探明不同葉位和離體時間煙草葉片保水力的變化規(guī)律，為應(yīng)用葉片保水力作為煙草抗旱性鑒定和抗旱育種選擇指標(biāo)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

選用抗旱性能不同的豫煙6號和農(nóng)大202為試驗品種[6]。試驗于2016年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌校區(qū)進(jìn)行，選取2個品種整齊一致的煙苗于4月30日移栽至大田，株距55 cm，行距120 cm。每個品種種植4行，每行100株。供試土壤為輕壤土，土壤中堿解氮含量為48.8 mg.kg-1，速效磷含量為51.7 mg.kg-1，速效鉀含量為103.9 mg.kg-1，pH為7.7。田間管理措施按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉栽培技術(shù)規(guī)程進(jìn)行。

在移栽后60 d，旺長后期，現(xiàn)蕾前，選取2品種自下而上第1、4、7、10、13葉位的葉片各6片用于不同葉位對葉片保水力的影響研究；選取2個品種第10葉位的葉片各36片用于不同失水時間對葉片相關(guān)生理指標(biāo)的影響研究。選取得各葉位的葉片均為正常生長，朝向一致的葉片。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 葉片失水率和葉片保水力測定

采用離體葉片自然失水法測定，具體步驟如下：在早上8：00～9：00，在田間摘取葉片后，迅速裝入塑料封口袋，并密封袋口，置于冰盒內(nèi)迅速帶回實驗室。實驗室保持恒溫、避風(fēng)、無陽光直射，將葉樣從塑料袋內(nèi)取出，迅速擦干葉片上沾有的水分，用電子天平稱取葉樣鮮重（FW0），而后懸掛于室溫25±1°C，相對濕度40%的室內(nèi)，每隔12 h再次稱重，獲得每個樣品的FW12、FW24、FW36、FW48。24 h和48 h稱重后，每個處理選取3片葉105℃殺青30 min，95℃烘干至恒重，稱取干重獲得DW24和DW48。分別在0、12、24、36、48 h節(jié)點各選取6片葉，用于生理指標(biāo)、激素和基因表達(dá)分析，每項指標(biāo)3次生物學(xué)重復(fù)。葉片失水率和葉片保水力采用下面公式計算：

1.2.2 生理指標(biāo)測定

抗氧化酶活性測定參考Li Q的方法[16]，取0.5 g葉片于預(yù)冷的研缽中，加入1 mL磷酸緩沖液在冰浴下研磨成漿，加緩沖液使最終體積為5 mL。取2 mL于12000 r/min下離心10 min，上清液即為SOD、POD、CAT粗提液，比色并計算酶活。丙二醛(MDA)含量和相對電導(dǎo)率參照李合生等[17]方法測定?？扇苄缘鞍缀繙y定參照考馬斯亮藍(lán)（Bradford）法測定[18]。激素含量的測定采用酶聯(lián)免疫吸附分析法[19]。

1.2.3 脅迫響應(yīng)基因的相對表達(dá)量分析

樣品總RNA的提取按照美國Invitrogen公司TRIZOL試劑說明書操作，反轉(zhuǎn)錄取2 μgRNA為模版，參照立陶宛Fermentas公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit產(chǎn)品說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。PCR擴增采用BioRad iQ5實時定量PCR儀進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化，每項指標(biāo)3次生物學(xué)重復(fù)。目的基因的相對表達(dá)量在將CT值導(dǎo)入Excel2010后按照公式2-△△CT計算[20]，并繪制基因表達(dá)差異圖。內(nèi)參基因為煙草ACTIN2基因，表1為4個脅迫響應(yīng)基因的PCR擴增引物信息。

表1 熒光定量PCR分析用的引物Tab.1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用DPS 7.05[21]以及Excel 2010進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葉位葉片含水率和失水率比較

圖1 不同葉位葉片含水率比較Fig.1 Comparison of leaves water content in different leaf positions

在旺長后期對豫煙6號和農(nóng)大202的第1、4、7、10和13葉位離體葉片取樣測定葉片含水率與葉片失水率。圖1顯示2個品種不同葉位葉片含水率在85%～90%之間，不同葉位之間無差異，品種間差異不顯著。葉片失水曲線如圖2所示，2個品種5個不同葉位的失水率為0～24 h較高，24 h后失水速率逐漸變緩，葉位間差異不明顯，農(nóng)大202失水率顯著高于豫煙6號。

圖2 不同葉位葉片失水率比較Fig.2 Comparison of leaf water loss in different leaf positions

2.2 不同離體失水時間烤煙葉片生理變化

圖3 不同離體失水時間烤煙葉片生理變化Fig.3 Physiological changes of flue - cured tobacco leaves under different dehydration time

對豫煙6號和農(nóng)大202不同離體失水時間的第10葉位葉片分別進(jìn)行了SOD、POD、CAT活性，MDA含量以及可溶性蛋白含量測定。結(jié)果表明3種抗氧化酶活性均呈現(xiàn)出先升后降趨勢，且在24 h時達(dá)到最高值，整體上看豫煙6號抗氧化酶活性均高于農(nóng)大202（圖3A、B、C），說明豫煙6號能對細(xì)胞膜起到更好的保護(hù)作用。MDA作為膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量呈不斷增加趨勢，但24 h后增速減緩，這說明膜脂過氧化在加劇但葉片失水24 h后過氧化程度在變緩，12 h后農(nóng)大202的MDA含量超過了豫煙6號，說明隨失水時間農(nóng)大202膜系統(tǒng)受傷害程度大于豫煙6號（圖3D）?？扇苄缘鞍缀恳渤氏壬蠼第厔?，失水24 h其含量達(dá)到最高值（圖3E）。這些表明烤煙葉片失水24 h后其生理活性減弱，葉片生命力開始降低。

2.3 不同離體失水時間烤煙葉片激素含量變化

圖4 不同離體失水時間葉片激素含量變化Fig.4 Changes of hormone contents in tobacco leaves at different dehydration time

激素作為植物體內(nèi)重要的微量調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，對植物抵御非生物脅迫具有重要作用。對2個品種不同離體失水時間的第10葉位葉片內(nèi)的ABA、IAA、CTK和GA含量進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖4所示，ABA含量在葉片離體后迅速升高，在24 h達(dá)到最高值，而后開始下降（圖4A），并且農(nóng)大202體內(nèi)ABA含量顯著高于豫煙6號，這可能由于農(nóng)大202遭受水分脅迫時其依賴ABA信號途徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)較為敏感。IAA含量表現(xiàn)出逐漸降低趨勢，隨時間增加其降幅減緩，并且豫煙6號葉片內(nèi)IAA含量高于農(nóng)大202（圖4B）。CTK含量2個品種離體葉片均先下降后上升，但農(nóng)大202在離體12 h前后下降后開始升高，而豫煙6號在36 h前后下降后開始升高（圖4C），CTK有延緩植物衰老的效應(yīng)，2個品種離體葉片CTK變化的不同可能跟其葉片衰老進(jìn)程不同有關(guān)。GA有提高生長素水平，抑制側(cè)芽休眠，衰老，加速細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)α-淀粉酶的形成等作用，豫煙6號離體葉片GA從較高的水平先下降后上升，農(nóng)大202離體葉片GA則從較低的含量水平先上升后下降，表現(xiàn)出不同的特征，表明2個品種離體葉片在失水衰老的過程中生理過程有著很大的不同。

2.4 不同離體失水時間烤煙葉片脅迫響應(yīng)基因表達(dá)量變化

圖5 脅迫響應(yīng)基因相對表達(dá)量Fig.5 Stress response gene relative expression

對4個脅迫響應(yīng)基因（AREB、CDPK2、ERD10C、LEA5）的熒光定量PCR結(jié)果如圖5所示：隨葉片離體失水時間增加，4個基因的相對表達(dá)量均表現(xiàn)出先升后降的趨勢，并在24 h時達(dá)到最高值，表明葉片在24 h時應(yīng)脅反應(yīng)達(dá)到最強。在葉片離體失水12 h～24 h基因表達(dá)量迅速增加，說明葉片的應(yīng)脅反應(yīng)在此時間段較為劇烈，也反映了此時葉片已經(jīng)受到了巨大的影響，而24 h～48 h表達(dá)量迅速下降說明了葉片因過度失水生命力開始漸失，生理活性減弱。整體上看豫煙6號脅迫響應(yīng)基因的相對表達(dá)量顯著高于農(nóng)大202，說明豫煙6號受到水分脅迫后應(yīng)脅反應(yīng)強于農(nóng)大202，抗逆性相對較強。

2.5 不同葉位離體葉片保水力比較

圖6 不同葉位保水力比較Fig.6 The water retention capacity of excised leaves among different leaf positions

采用葉片離體失水24 h對農(nóng)大202和豫煙6號進(jìn)行了葉片保水力測定（圖6）。2個品種不同葉位間的離體葉片保水力均無顯著差異，說明離體葉片保水力與葉位無關(guān)。豫煙6號葉片保水力達(dá)到了85%以上，而農(nóng)大202的葉片保水力在65%左右，差異達(dá)極顯著水平。表明豫煙6號離體葉片有相對較強的保水能力。同一品種不同葉位葉片具有不同的葉齡，其含水率和離體失水速率差異不大（圖1和圖2），葉片保水力沒有顯著性差異，可能跟這些葉片均為移栽后60天同時取樣，處在旺長后期，測定的第1、4、7、10、13葉位葉片均已定長，與葉片水分散失相關(guān)的角質(zhì)層厚度、氣孔及細(xì)胞壁發(fā)育等已經(jīng)基本定型，以及取樣前一段時間這些葉片的生長環(huán)境相同有關(guān)，而品種間差異顯著則可能主要跟品種本身的遺傳性、細(xì)胞原生質(zhì)膠體性質(zhì)等有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

本研究表明同一品種烤煙的不同葉位葉片保水力及含水率無顯著差異，說明葉片保水力與葉位關(guān)系不大。在烤煙葉片失水24 h后，其抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量、ABA含量以及脅迫響應(yīng)基因相對表達(dá)量均達(dá)到最高值，而后開始下降。該結(jié)果說明離體葉片失水24 h后其生理活動由強變?nèi)?，葉片開始失去活力。這一現(xiàn)象可能跟植物生長發(fā)育的生物節(jié)律有關(guān)，離體條件下，烤煙葉片在自然環(huán)境中仍然要像正常生長條件下一樣努力維持晝夜生長節(jié)律。因此葉片失水24 h左右為煙草離體葉片保水力的合適研究時間。

植物通過保持吸水率與自身水分損失率間的平衡來防止其組織水分含量下降[22]，當(dāng)葉片離體以后吸水停止，只能通過保持水分來維持組織水分平衡。在此過程中細(xì)胞的代謝會因失水而改變，耐脫水的細(xì)胞必須做到能夠調(diào)節(jié)失水情況下的代謝和能修復(fù)失水代謝造成的損傷[22-25]。細(xì)胞開始脫水后，調(diào)節(jié)失水代謝的主要策略為關(guān)閉氣孔和調(diào)節(jié)滲透。因此水分脅迫后葉片內(nèi)ABA和可溶性蛋白含量往往會大幅上升，ABA可以誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，并且是植物抵御脅迫的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)。因此二者遇脅迫后含量上升幅度越大意味著葉片保水能力越強，抗逆能力越強。另外，葉片失水后IAA含量出現(xiàn)下降，推測是由于葉片為適應(yīng)水分虧缺，抑制自身生長以減少水分需求，這也是細(xì)胞調(diào)節(jié)失水代謝的手段之一。細(xì)胞失水造成的損傷主要在細(xì)胞膜系統(tǒng)上，表現(xiàn)為膜脂過氧化和膜透性增加，故失水后葉片MDA含量會呈增加態(tài)勢，與此同時抗氧化酶活性會明顯升高以清除膜脂過氧化產(chǎn)生的大量活性氧，因此保水能力較強的葉片失水后MDA含量增幅較小，抗氧化酶活性較高。綜上可知，保水能力強的葉片失水后表現(xiàn)為可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性相對較高，MDA含量增幅相對較低，這與本試驗結(jié)果相一致。

AREB轉(zhuǎn)錄因子基因是ABA信號途徑下游的關(guān)鍵調(diào)控因子，可啟動下游基因的表達(dá)，而AREB基因是植物應(yīng)對滲透脅迫關(guān)鍵基因之一[26]。CDPKs即鈣離子依賴蛋白激酶基因，是植物細(xì)胞應(yīng)對各種生物和非生物脅迫中承接Ca2+流變化的重要因素。研究表明CDPK2基因參與了植物對干旱的抵御反應(yīng)[27]。LEA蛋白能在水分虧缺時束縛水分子并穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，其過表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因煙草對滲透脅迫的抵抗力[28]。CBF類轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對低溫及水分脅迫中發(fā)揮著重要作用，ERD10C基因作為其下游基因，同樣對植物的抗逆反應(yīng)起著關(guān)鍵作用。而Liu等的研究也證實了煙草在受到水分脅迫時ERD10C會表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)[29]，本研究表明，失水后葉片的脅迫響應(yīng)基因相對表達(dá)量顯著增加，且2個品種基因表達(dá)量高低與保水力趨勢相一致，說明煙草的葉片保水力以及各生理指標(biāo)變化是受脅迫響應(yīng)基因調(diào)控的。當(dāng)細(xì)胞受到水分脅迫后首先會引發(fā)滲透勢的改變，繼而脅迫響應(yīng)基因編碼大量蛋白以應(yīng)對脅迫，主要包括起到抗性作用的蛋白（包括水通道蛋白、合成滲透保護(hù)物質(zhì)的關(guān)鍵酶、起保護(hù)作用的蛋白酶以及解毒酶類）和對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起關(guān)鍵作用的蛋白因子（主要包括與第二信使生成有關(guān)酶類以及表達(dá)調(diào)控逆酶基因的有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子）。通過這些脫水脅迫誘導(dǎo)基因產(chǎn)物實現(xiàn)了對失水情況下代謝的調(diào)節(jié)以及失水代謝造成損傷的修復(fù)。

植物的抗旱性通常是非常復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多種因素的影響，選擇不同的指標(biāo)研究得到的結(jié)論也不一樣。植物角質(zhì)層是植物在4億5000萬年前向陸地過渡過程中進(jìn)化的一項重要創(chuàng)新[30-31]。葉片是烤煙的主要蒸騰部位，水分經(jīng)葉表面的蒸騰作用有兩條途徑：一是通過角質(zhì)層蒸騰，另一種是通過氣孔蒸騰?？緹熡兹~因角質(zhì)層發(fā)育不完全，角質(zhì)層蒸騰幾乎占蒸騰量的40%～70%，而隨著葉片成年其角質(zhì)層蒸騰減少，僅占總蒸騰量的5%～10%[32]。趙陽等研究表明水分脅迫情況下抗旱能力強的農(nóng)大202的一級側(cè)根數(shù)目和二級側(cè)根密度顯著增加，說明農(nóng)大202的抗旱機制可能主要在根系而不在葉片，因此其保水力相對豫煙6號較弱[33]。這也從側(cè)面反映了植物對于耐旱有著不同的機制，即根系發(fā)達(dá)具有較強的吸水能力或者葉片細(xì)胞組織彈性較高，細(xì)胞壁以及角質(zhì)層較厚，具有較強的抗脫水能力。因此可對不同抗旱烤煙品種角質(zhì)層及根系再做進(jìn)一步深入研究。

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Effects of stalk positions and natural dehydration after priming on water retention capacity of fl ue-cured tobacco leaves

ZHANG Xiaoquan1, XU Zhiwen1, KAN Hongying1, ZHANG Lin1, ZHANG Yunyun1, GUO Chuanbin2, YANG Lijun2, XIA Zongliang3*
1 College of Tobacco Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China；
2 Henan Zhumadian Municipal Tobacco Company, Zhumadian 463000, Henan, China；
3 College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

In order to elucidate the effect of stalk positions and natural dehydration after priming on water retention capacity of fl ue-cured tobacco leaves, evaluation index of drought resistance of tobacco leaves was investigated.Effects of different stalk positions and natural dehydration after priming on leaf water loss rate, antioxidant enzyme activity, hormone and stress resistance gene expression were studied through natural dehydration method with two fl ue-cured tobacco varieties, Yuyan 6 and Nongda 202 of different drought resistance.Results showed that the water loss rate of leaves of 5 different stalk positions was higher during 0-24h, and gradually slowed down after 24h, and there was no signi fi cant difference among different stalk positions, but water loss rate of Nongda 202 was signi fi cantly higher than that of Yuyan 6.Antioxidant enzyme (SOD, POD, CAT) activity, soluble protein content, abscisic acid (ABA) content in excised leaves reached the highest value 24 hours in vitro, and Malondialdehyde (MDA) content also slowed down after 24 hours.The relative expression of four stress responsive genes (AREB, CDPK2, ERD10C, LEA5) reached the highest level after 24 hours.Physiological metabolism of excised fl ue-cured tobacco leaves was the strongest 24 hours in vitro, and the difference between the indexes of the two varieties was the greatest 24 hours in vitro.There was little relationship between water retention capacity and leaf position in excised fl ue-cured tobacco leaves, and leaf water loss 24 hours in vitro was the appropriate time to determine water retention capacity of excised tobacco leaves.

fl ue-cured tobacco；water retention capacity of leaves; antioxidant enzyme activity; stress responsive genes

張小全，許志文，闞洪贏，等.不同葉位和離體失水時間對烤煙葉片保水能力的影響[J].中國煙草學(xué)報，2017, 23（4）

河南省煙草公司駐馬店市公司項目和河南省煙草公司重點項目（HYKJ201401）

張小全(1980—)，博士，副教授，主要從事煙草品種改良和推廣研究，Email: zxq013415@163.com

夏宗良(1973—)，博士，教授，Email：xiazl08@163.com

2017-04-06；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-07-18

：ZHANG Xiaoquan, XU Zhiwen, KAN Hongying, et al.Effects of stalk positions and natural dehydration after priming on water retention capacity of fl ue-cured tobacco leaves [J].Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(4)

*Corresponding author.Email：xiazl08@163.com