張秀峰，金昊，林冰冰，李瓏，宋長明，李鉆芳，梁勝祥，毛敬潔，柳維林，陶靜，陳立典

·基礎(chǔ)研究·

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降與胼胝體脫髓鞘損傷的關(guān)系①

張秀峰1，金昊1，林冰冰1，李瓏1，宋長明1，李鉆芳2，梁勝祥3，毛敬潔2，柳維林1，陶靜1，陳立典4,5,6

目的 探討12月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降與胼胝體脫髓鞘損傷之間的關(guān)系。方法 12只12月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為AD組，12只同窩陰性小鼠為野生組。Morris水迷宮檢測兩組學(xué)習(xí)記憶能力；盧卡斯快藍染色觀察胼胝體神經(jīng)纖維形態(tài)；免疫組化檢測胼胝體髓鞘堿性蛋白(MBP)含量；硫黃素S染色觀察淀粉樣斑塊在胼胝體的沉積情況。結(jié)果 與野生組相比，AD組逃避潛伏期明顯延長(Z＞2.873,P＜0.01)，穿越平臺次數(shù)顯著減少(t=-7.339,P＜0.001)。AD組胼胝體神經(jīng)纖維髓鞘稀疏，排列紊亂，出現(xiàn)較多空洞；MBP含量較野生組顯著降低(t=-4.481,P＜0.001)；胼胝體區(qū)出現(xiàn)淀粉樣斑塊沉積。結(jié)論 12月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，可能與淀粉樣斑塊在胼胝體的沉積引起胼胝體神經(jīng)纖維脫髓鞘損傷有關(guān)。

阿爾茨海默?。粚W(xué)習(xí)記憶；胼胝體；脫髓鞘；小鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以逐漸加重的記憶丟失為主要臨床特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。根據(jù)The World Alzheimer Report 2015報告，全球大約有4680萬人罹患癡呆，并以每20年翻一倍的速度增長，預(yù)計到2050年，全球癡呆患者將達到1.3億人，其中約一半是AD患者。到目前為止，AD患者記憶丟失的確切機制并不十分清楚。

越來越多的研究表明，AD患者存在大腦白質(zhì)損傷[2-4]，白質(zhì)的變化與注意力[5]、執(zhí)行功能[6]、情景記憶功能[7]等有密切關(guān)系。胼胝體是腦內(nèi)最大的白質(zhì)纖維束，連接左右半球，負(fù)責(zé)半球間信息傳遞和整合[8]。在AD發(fā)病過程中，胼胝體受到損害[9-11]，包括脫髓鞘損傷[12-13]。

本研究觀察12月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和胼胝體髓鞘的變化，以期闡明學(xué)習(xí)記憶能力與白質(zhì)變化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

12月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠12只〔B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)〕為AD組，同窩陰性野生小鼠12只為野生組，均由南京大學(xué)模式動物研究所提供，福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心喂養(yǎng)，許可證號SYXK(閩)2014-001。

本實驗由福建中醫(yī)藥大學(xué)動物管理和使用委員會批準(zhǔn)進行，實驗過程均嚴(yán)格執(zhí)行國際動物保護及使用指南的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器

盧卡斯快藍(Luxol Fast Blue,LFB)、硫磺素S(thioflavine S,THS)：SIGMA公司。髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)一抗：ABCAM公司。免疫組化試劑盒：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。Morris水迷宮：上海欣軟信息科技有限公司。DM4000B LED研究級生物顯微鏡、DMI4000B LED熒光倒置顯微鏡：LEICA公司。Motic Med 6.0圖像分析系統(tǒng)：麥克奧迪公司。

1.3 Morris水迷宮測試

水迷宮為直徑120 cm、深50 cm、水深30 cm的圓柱形水池，水溫26℃左右，分為4個象限。平臺直徑6 cm、高28 cm，沒于水面下2 cm左右，平臺放置在第3象限。水池周圍設(shè)有4個形狀和顏色不同的參照物。前4 d行定位航行實驗，每天4次；第5天行空間探索實驗。

定位航行實驗時，小鼠分別由第1象限、第2象限、第3象限、第4象限入水點面向池壁放入水中。記錄90 s內(nèi)找到平臺的時間，記為逃避潛伏期。若小鼠在90 s內(nèi)未找到平臺，則該小鼠的逃避潛伏期記錄為90 s，實驗者將其引導(dǎo)至平臺上，停留10 s后，再繼續(xù)進行下一個象限實驗。

空間探索實驗時，撤去平臺，從第1象限將小鼠面向池壁放入水中，記錄90 s內(nèi)小鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)，連續(xù)測3次，取平均值。

1.4 動物取材

于水迷宮實驗結(jié)束后第2天，小鼠10%水合氯醛0.01 ml/g腹腔注射麻醉后開胸，暴露心臟，剪開右心耳，生理鹽水經(jīng)左心室持續(xù)灌入，直至流出的液體清亮。4%多聚甲醛灌注固定，快速取出腦組織，浸入4%多聚甲醛中繼續(xù)固定24～48 h。常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片機切取厚4 μm全腦冠狀切片。參照Paxinos＆Franklin圖譜，每只小鼠隨機選取Bregma前囟后1.5～2.5 mm切片2張備用。每組小鼠各選4只的腦組織切片分別進行LFB染色、MBP免疫組化和THS染色。

1.5 LFB染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，置預(yù)熱的LFB染液中，58℃染色16～24 h；冷卻至室溫，純水沖洗1 min，入70%乙醇數(shù)秒；純水沖洗1 min，入0.05%碳酸鋰分化液中數(shù)秒，至背景變淡，髓鞘藍色明顯，純水沖洗5 min。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。DM4000B LED研究級生物顯微鏡400倍觀察胼胝體區(qū)髓鞘的形態(tài)，并拍照。

1.6 免疫組化

切片常規(guī)脫蠟入水。微波法抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min，驢血清封閉液封閉10 min。加MBP一抗(1∶500)濕盒中4℃過夜。室溫復(fù)溫30 min，加生物素標(biāo)記的羊抗兔聚合物二抗孵育10 min，鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶孵育10 min。各步驟間切片用PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色。DM4000B LED研究級生物顯微鏡400倍觀察胼胝體，并拍照。每只小鼠2張切片，每張切片隨機選取6個視野，使用Motic Med 6.0軟件中免疫組化分析模塊進行積分光密度分析。

1.7 THS染色

切片常規(guī)脫蠟入水，PBS洗3次，每次5 min。1%THS[14]染色液染色15 min，PBS洗3次，每次5 min。抗熒光淬滅封片劑封片，風(fēng)干后，立即用DMI4000B LED熒光倒置顯微鏡200倍觀察胼胝體區(qū)淀粉樣斑塊沉積情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示。符合正態(tài)分布，采用獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

與野生組相比，AD組第1天、第2天、第3天、第4天逃避潛伏期明顯增加(P＜0.01)；空間探索實驗平均穿越平臺次數(shù)顯著減少(P＜0.001)。見表1、表2。

2.2 LFB染色

野生組小鼠胼胝體髓鞘致密，排列較整齊；AD組髓鞘稀疏，排列紊亂，有較多空洞出現(xiàn)，脫髓鞘現(xiàn)象明顯。見圖1。

2.3 免疫組化染色

AD組MBP平均光密度與野生組小鼠相比顯著降低(P＜0.001)；AD組髓鞘結(jié)構(gòu)排列紊亂疏松，有較多空洞。見表3、圖2。

2.4 THS染色

AD組胼胝體區(qū)出現(xiàn)淀粉樣斑塊沉積，野生組胼胝體區(qū)無淀粉樣斑塊。見圖3。

圖1 兩組胼胝體纖維(LFB染色,400×)

表1 兩組定位航行實驗逃避潛伏期比較(s)

表2 兩組空間探索實驗穿越平臺次數(shù)比較

表3 兩組MBP表達(平均光密度)

圖2 兩組胼胝體區(qū)MBP(免疫組化染色,400×)

圖3 兩組胼胝體區(qū)淀粉樣斑塊(THS染色,200×)

3 討論

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠過度表達與AD相關(guān)的兩種蛋白質(zhì)：淀粉樣前體蛋白和早老素1，加速AD的疾病進程[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，12月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(AD小鼠)學(xué)習(xí)記憶能力下降。與我們前期的研究結(jié)果一致[16-17]。

大腦白質(zhì)損害在AD發(fā)病機制中的作用受到越來越多的重視，AD患者認(rèn)知功能下降與大腦白質(zhì)完整性的破壞密切相關(guān)[5-7]。胼胝體是腦內(nèi)最大的白質(zhì)纖維束，連接左右側(cè)大腦半球，在AD發(fā)病過程中受到損害[4,18-19]。本研究顯示，AD小鼠神經(jīng)纖維排列紊亂疏松，有較多空泡形成，且MBP含量顯著降低。MBP是神經(jīng)髓鞘的重要組成成分之一，MBP表達下降會抑制髓鞘形成[20]，從而影響髓鞘正常的傳導(dǎo)功能。MBP含量顯著降低表明AD小鼠胼胝體區(qū)發(fā)生較嚴(yán)重的脫髓鞘損害。

對正常老年人和AD患者的彌散張量成像(diffusion tensor imaging,DTI)研究發(fā)現(xiàn)，與正常老年人相比，AD患者出現(xiàn)胼胝體各向異性分?jǐn)?shù)(fractional anisotropy,FA)下降[4,18]，胼胝體神經(jīng)纖維完整性破壞。對AD患者和正常老年人為期1年的隨訪發(fā)現(xiàn)，AD患者胼胝體區(qū)FA降低[19]。8月齡的tau蛋白突變AD小鼠胼胝體出現(xiàn)FA降低，透射電鏡觀察胼胝體區(qū)神經(jīng)纖維出現(xiàn)脫髓鞘損害，軸突排列紊亂、腫脹，軸突間距離增大[21]。這些臨床和動物研究提示，AD患者存在胼胝體神經(jīng)纖維完整性破壞，且這種破壞有可能由神經(jīng)纖維脫髓鞘引起。

本研究顯示，AD小鼠胼胝體區(qū)出現(xiàn)淀粉樣斑塊沉積，而野生組則無斑塊。有研究表明，β-淀粉樣蛋白42(amyloid β 42,Aβ42)能抑制少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖和分化，使MBP免疫染色細(xì)胞突起模糊，分支減少，從而影響神經(jīng)纖維髓鞘的形成，此過程可能是通過促進少突膠質(zhì)前體細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的[22]。Aβ42注射入大鼠胼胝體區(qū)，能引起炎癥反應(yīng)，使大鼠腦組織少突膠質(zhì)細(xì)胞損害，胼胝體白質(zhì)脫髓鞘[23]。大鼠雙側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ寡聚體，能夠引起大鼠胼胝體損害和學(xué)習(xí)記憶障礙[24]。同時AD患者大腦皮質(zhì)MBP含量與Aβ42和淀粉樣斑塊有關(guān)[25]。對輕度認(rèn)知障礙(mild cognitive impairment,MCI)和AD患者的臨床DTI研究發(fā)現(xiàn)，較高的FA值和腦脊液中較高的Aβ42相關(guān)[26]。這些研究均表明，Aβ對神經(jīng)纖維有毒性作用，能引起神經(jīng)纖維脫髓鞘損害。我們推測，可能是淀粉樣斑塊在胼胝體區(qū)的沉積引起胼胝體區(qū)神經(jīng)纖維脫髓鞘。

綜上所述，本研究表明，12月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降，可能與淀粉樣斑塊在胼胝體沉積，引起胼胝體神經(jīng)纖維脫髓鞘病變有關(guān)。具體機制仍需進一步的深入研究。

[1]Yin Y,Gao D,Wang Y,et al.Tau accumulation induces synaptic impairment and memory deficit by calcineurin-mediated inactivation of nuclear CaMKIV/CREB signaling[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2016,113(26):E3773-E3781.

[2]Cooley SA,Cabeen RP,Laidlaw DH,et al.Posterior brain white matter abnormalities in older adults with probable mild cognitive impairment[J].J Clin Exp Neuropsychol,2015,37(1):61-69.

[3]周智美,陳德基,王延平,等.阿爾茨海默病早期腦白質(zhì)改變的DTI研究[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報,2015,21(10):1337-1340.

[4]Ouyang X,Chen K,Yao L,et al.Independent component analysis-based identification of covariance patterns of microstructural white matter damage in Alzheimer's disease[J].PLoS One,2015,10(3):e0119714.

[5]Chang YL,Chen TF,Shih YC,et al.Regional cingulum disruption,not gray matter atrophy,detects cognitive changes in amnestic mild cognitive impairment subtypes[J].JAlzheimers Dis,2015,44(1):125-138.

[6]Nowrangi MA,Okonkwo O,Lyketsos C,et al.Atlas-based diffusion tensor imaging correlates of executive function[J].J Alzheimers Dis,2015,44(2):585-598.

[7]Sexton CE,Mackay CE,Lonie JA,et al.MRI correlates of episodic memory in Alzheimer's disease,mild cognitive impairment,and healthy aging[J].Psychiatry Res,2010,184(1):57-62.

[8]Elahi S,Bachman AH,Lee SH,et al.Corpus callosum atrophy rate in mild cognitive impairment and prodromal Alzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis,2015,45(3):921-931.

[9]Han LS,Bachman AH,Yu D,et al.Predicting progression from mild cognitive impairment to Alzheimer's disease using longitudinal callosal atrophy[J].Alzheimers Dement(Amst),2016,2:68-74.

[10]Wang XD,Ren M,Zhu MW,et al.Corpus callosum atrophy associated with the degree of cognitive decline in patients with Alzheimer's dementia or mild cognitive impairment:A meta-analysis of the region of interest structural imaging studies[J].J Psychiatr Res,2015,63:10-19.

[11]Di Paola M,Spalletta G,Caltagirone C.In vivo structural neuroanatomy of corpus callosum in Alzheimer's disease and mild cognitive impairment using different MRI techniques:a review[J].J Alzheimers Dis,2010,20(1):67-95.

[12]Kara F,H?fling C,Ro?ner S,et al.In vivo longitudinal monitoring of changes in the corpus callosum integrity during disease progression in a mouse model of Alzheimer's disease[J].Curr Alzheimer Res,2015,12(10):941-950.

[13]Di Paola M,Di Iulio F,Cherubini A,et al.When,where,and how the corpus callosum changes in MCI and AD:a multimodal MRI study[J].Neurology,2010,74(14):1136-1142.

[14]Li L,Wang XY,Gao FB,et al.Magnetic resonance T2relaxation time at 7 Tesla associated with amyloid β pathology and age in a double-transgenic mouse model of Alzheimer's disease[J].Neurosci Lett,2016,6(10):92-97.

[15]Shu X,Qin YY,Zhang S,et al.Voxel-based diffusion tensor imaging of an APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease[J].Mol Neurobiol,2013,48(1):78-83.

[16]張穎錚,卓沛元,林如輝,等.電針百會穴改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及對磁共振波譜的影響[J].康復(fù)學(xué)報,2016,26(5):42-46.

[17]卓沛元,柳維林,吳潔,等.電針百會穴對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠18F-FDG PET/CT成像及學(xué)習(xí)記憶的影響[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2016,31(10):1050-1054.

[18]孟明,董春波,宋清偉,等.彌散張量成像對阿爾茨海默病腦白質(zhì)改變的評價[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2016,42(3):134-140.

[19]Mayo CD,Mazerolle EL,Ritchie L,et al.Longitudinal changes in microstructural white matter metrics in Alzheimer's disease[J].Neuroimage Clin,2016,13:330-338.

[20]Nave KA.Myelination and support of axonal integrity by glia[J].Nature,2010,468(7321):244-252.

[21]Sahara N,Perez PD,Lin WL,et al.Age-related decline in white matter integrity in a mouse model of tauopathy:an in vivo diffusion tensor magnetic resonance imaging study[J].Neurobiol Aging,2014,35(6):1364-1374.

[22]張茂,詹曉黎,陳興書,等.Aβ1-42抑制少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖與分化的實驗研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2013,35(12):1183-1187.

[23]Jantaratnotai N,Ryu JK,Kim SU,et al.Amyloid beta peptide-induced corpus callosum damage and glial activation in vivo[J].Neuroreport,2003,14(11):1429-1433.

[24]Wong RS,Cechetto DF,Whitehead SN.Assessing the effects of acute amyloid β oligomer exposure in the rat[J].Int J Mol Sci,2016,17(9):1390.

[25]Zhan X,Jickling GC,Ander BP,et al.Myelin basic protein associates with AβPP,Aβ1-42,and amyloid plaques in cortex of Alzheimer's disease brain[J].JAlzheimers Dis,2015,44(4):1213-1229.

[26]Li X,Li TQ,Andreasen N,et al.The association between biomarkers in cerebrospinal fluid and structural changes in the brain in patients withAlzheimer's disease[J].J Intern Med,2014,275(4):418-427.

Learning and Memory Deficit and Demyelination of Corpus Callosum inAPP/PS1 Transgenic Mice

ZHANG Xiu-feng1,JIN Hao1,LIN Bing-bing1,LI Long1,SONG Chang-ming1,LI Zuan-fang2,LIANG Sheng-xiang3,MAO Jing-jie2,LIU Wei-lin1,TAO Jing1,CHEN Li-dian4,5,6
1.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;2.Academy of Integrative Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fujian 350122,China;3.School of Physics and Engineering,Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450001,China;4.Rehabilitation Research Center of Traditional Chinese Medicine,State Administration of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;5.Fujian Collaborative Innovation Center for Rehabilitation Technology,Fuzhou,Fujian 350122,China;6.Rehabilitation Medical Technology Joint National Local Engineering Research Center,Fuzhou,Fujian 350122,China

CHEN Li-dian.E-mail:cld@fjtcm.edu.cn

Objective To investigate the relationship between learning and memory deficit and demyelination of the corpus callosum in twelve-month old APP/PS1 transgenic mice.Methods Twelve twelve-month old APP/PS1 transgenic mice were as AD group,and age-matched wild type(WT)littermates were as WT group.Learning and memory ability was tested with Morris water maze,and the morphology of nerve fiber of corpus callosum was detected with Luxol Fast Blue staining.Immunohistochemistry was used to detect myelin basic protein(MBP)in the corpus callosum.Thioflavine S staining was used to detect amyloid plaque in the corpus callosum.Results Compared with WT group,the latency increased(Z＞2.873,P＜0.01)and the times crossing the location of the platform decreased(t=-7.339,P＜0.001)in AD group.The nerve fibers were sparse and disorganized,with a lot of vacuoles in the corpus callosum of AD group.The positive expression of MBP in the corpus callosum was significantly decreased(t=-4.481,P＜0.001)in AD group compared with WT group.There were amyloid plaques in the corpus callosum of AD group.Conclusion Twelve-month old APP/PS1 transgenic mice exhibit learning and memory deficit,which may be attributed to the deposition of the amyloid plaque mediated demyelinated injury of the corpus callosum.

Alzheimer's disease;learning and memory;corpus callosum;demyelination;mice

R749.1

A

1006-9771(2017)09-1027-05

2017-05-08

2017-06-22)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.09.008

[本文著錄格式] 張秀峰，金昊，林冰冰，等.APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降與胼胝體脫髓鞘損傷的關(guān)系[J].中國康復(fù)理論與實踐,2017,23(9):1027-1031.

CITED AS:Zhang XF,Jin H,Lin BB,et al.Learning and memory deficit and demyelination of corpus callosum in APP/PS1 transgen-ic mice[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(9):1027-1031.

1.福建省康復(fù)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心課題(No.X2016001-協(xié)同)；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新平臺專項(No.X2015024-平臺)。

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州市350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州市350122；3.鄭州大學(xué)物理工程學(xué)院，河南鄭州市450001；4.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復(fù)研究中心，福建福州市350122；5.福建省康復(fù)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建福州市350122；6.康復(fù)醫(yī)療技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建福州市350122。作者簡介：張秀峰(1986-)，女，漢族，江蘇泰州市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)與認(rèn)知科學(xué)研究。通訊作者：陳立典(1963-)，男，福建政和市人，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)及認(rèn)知科學(xué)。E-mail:cld@fjtcm.edu.cn。