李曉婷，陳忠軍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特010018）

抑制真菌乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

李曉婷，陳忠軍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特010018）

利用單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)一株具有抑真菌作用乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)定其抑菌譜。結(jié)果表明，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化乳桿菌ALAC-4的最佳培養(yǎng)組分為蔗糖20 g/L，牛肉膏12 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏6 g/L，硫酸鎂0.6 g/L，硫酸錳0.3 g/L，氯化鉀0.3 g/L，吐溫-80 1 mL/L，其他培養(yǎng)基成分添加量不變。在此條件下，抑菌圈直徑可達(dá)到23.05 mm，比優(yōu)化前提高了31%。乳桿菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)抑菌譜較廣，對(duì)大多數(shù)酵母菌和霉菌都有抑菌作用。

乳桿菌；抑菌活性物質(zhì)；培養(yǎng)基優(yōu)化；抑菌譜

0 引 言

真菌是發(fā)酵乳制品中常見(jiàn)的腐敗菌，可以造成乳品工業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。乳桿菌是乳制品中常見(jiàn)的微生物，它能夠產(chǎn)出有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、雙乙酰[3]，脂肪酸[4],苯乳酸[5]，細(xì)菌素[6]等物質(zhì)抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)。已有大量報(bào)道證明乳桿菌的代謝產(chǎn)物可以破壞食物中的腐敗微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高食品安全[7,8]。作為一種天然防腐劑，乳桿菌的代謝產(chǎn)物滿足消費(fèi)者對(duì)食品防腐劑安全性的需求。

乳桿菌生長(zhǎng)有嚴(yán)格的營(yíng)養(yǎng)需求,需要充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9]。最常見(jiàn)的乳桿菌培養(yǎng)基是MRS[10,11]。為了提高乳桿菌的產(chǎn)量以獲得更大的生物量及其所產(chǎn)有價(jià)值的代謝產(chǎn)物，很多報(bào)道都研究了不同碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)乳桿菌生長(zhǎng)的影響，以及對(duì)溫度、pH和培養(yǎng)時(shí)間[12-14]等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。合適的培養(yǎng)基是提高乳桿菌抑菌作用的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因子、正交實(shí)驗(yàn)對(duì)一株具有良好抑真菌作用的乳桿菌ALAC-4的培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化，并測(cè)定其抑菌譜，為乳桿菌應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳桿菌：Lactobacillus plantarum ALAC-4（分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品）。

指示菌：白假絲酵母（Candida albicans），克魯斯假絲酵母（Candida krusei），紅酵母（Rhodotorula sp.），釀酒酵母（Sacharomyces cerevisiae），黃曲霉（Aspergillus flavus），黑曲霉（Aspergillus niger），寄生曲霉（Aspergillus parasiti?cus），青霉（Penicillium sp.），地霉（Geotrichum sp.），婁地青霉（Penicillium roqueforti），毛霉（Mucor niemalis）。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取粉5 g/L，牛肉膏10g/L，無(wú)水乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，Tween-80 1 mL/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸錳54 mg/L，硫酸鎂200 mg/L，葡萄糖20 g/L（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，乳桿菌培養(yǎng)）；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（霉菌培養(yǎng)）；YEPD（酵母菌培養(yǎng)）；瓊脂培養(yǎng)基（抑菌活性檢測(cè)）。

1.2 儀器與設(shè)備

FLC－3型超凈工作臺(tái)，HVE－50型全自動(dòng)高壓滅菌鍋，HPS-250生化培養(yǎng)箱，12001型電子天平，PB-10pH計(jì)，KDC-140HR高速冷凍離心機(jī)，IKARV-10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3 方法

1.3.1 指示菌菌懸液的制備[15-16]

將斜面保藏的酵母菌用接種環(huán)挑入5 mL的YEPD液體培養(yǎng)基中，活化3代（30℃，24 h），取第三代用生理鹽水稀釋至102mL-1。用于抑菌譜的測(cè)定。

將霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面，28℃下培養(yǎng)7 d。加入5 mL生理鹽水，用渦旋儀充分震蕩，過(guò)濾菌絲，收集孢子懸液。用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)孢子濃度至106個(gè)/mL,備用。用于抑菌譜測(cè)定和培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 抑菌活性檢測(cè)[17]

將穿刺保藏的乳桿菌活化，取活化后的菌種按4%接種量接種到100 mLMRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液離心（3 500 r/min，10 min），取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至25倍。采用抑菌圈法將瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿中，凝固后放入牛津杯。在瓊脂上層加入含有指示菌懸液的培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后在牛津杯中加入200 μL的抑菌物質(zhì)濃縮液，28℃培養(yǎng)48 h，測(cè)量抑菌圈直徑（含牛津杯直徑7 mm）。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 碳源對(duì)代謝物抑菌性的影響

分別以葡萄糖、麥芽糖、D-果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖作為初始MRS培養(yǎng)基中的碳源，添加量20 g/L。其余條件不變，將菌株以4%的接種量接入，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌活性。確定最適碳源種類。

根據(jù)最適碳源的選擇結(jié)果,分別加入質(zhì)量濃度為10，15，20，25，30 g/L的碳源。將乳桿菌接入培養(yǎng)后，測(cè)定抑菌活性。確定適宜的碳源質(zhì)量濃度。

1.3.3.2 氮源對(duì)代謝物抑菌性的影響

分別用酵母膏、牛肉膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨、麥芽提取粉、蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏(2∶2∶1)、牛肉膏∶酵母膏(3∶2)、牛肉膏∶蛋白胨(3∶2)、蛋白胨∶酵母膏(3∶2)，作為初始MRS培養(yǎng)基中的氮源，添加量25 g/L。將菌株以4%的接種量接入，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌活性。確定最適氮源種類。

根據(jù)最適氮源的選擇結(jié)果,依次加入質(zhì)量濃度為5，15，25，35，45 g/L的氮源。將乳桿菌接入培養(yǎng)后，測(cè)定抑菌活性。確定適宜的氮源質(zhì)量濃度。

1.3.3.3 金屬離子對(duì)代謝物抑菌性的影響

分別在基礎(chǔ)MRS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為0.8 g/L的硫酸鎂∶氯化鈉(2∶1)，硫酸鎂∶硫酸錳(2∶1)，硫酸鎂∶氯化鉀(2∶1)，氯化鈉∶氯化鉀(2∶1)，氯化鈉∶硫酸錳(2∶1)，硫酸錳∶氯化鉀(2∶1)，硫酸錳∶硫酸鎂∶氯化鉀(1∶2∶1)，硫酸錳∶硫酸鎂∶氯化鈉(1∶2∶1)，硫酸鎂∶氯化鉀∶氯化鈉(2∶1∶1)，硫酸錳∶氯化鉀∶氯化鈉(1∶1∶1)，硫酸錳∶氯化鉀∶氯化鈉∶硫酸鎂(1∶1∶1∶2)。將菌株以4%的接種量接入，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌活性。確定最適金屬離子種類。

根據(jù)最適金屬離子的選擇結(jié)果,依次加入質(zhì)量濃度為0.4，0.6，0.8，1，1.2，1.5 g/L的金屬離子。將乳桿菌接入培養(yǎng)后，測(cè)定抑菌活性。確定適宜的添加量。

1.3.4.4 吐溫-80對(duì)代謝物抑菌性的影響

在培養(yǎng)基中分別0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL/L的吐溫-80，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌活性。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)確定最佳條件

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)主要影響因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析。采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表，確定乳酸菌乳酸菌產(chǎn)抑霉菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)基組分。并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，對(duì)正交所得最優(yōu)培養(yǎng)基組分進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 抑菌譜測(cè)定

在制備的濃縮液中加入飽和硫酸銨，4℃靜置24 h。冷凍離心后取沉淀（12 000 r/min,20 min），得蛋白質(zhì)沉淀粗提物。用磷酸鹽緩沖液溶解(pH=7.0,濃度0.1 mol/mL)，制成粗提液。以食品生產(chǎn)中易污染的真菌作為指示菌，測(cè)定抑菌活性，確定乳桿菌的抑菌譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同碳源對(duì)抑菌活性的影響

本研究考慮用不同糖作為碳源，添加量為20 g/L，考察其對(duì)乳桿菌所產(chǎn)代謝物抑菌活性的影響，結(jié)果如圖1所示。以蔗糖作為ALAC-4培養(yǎng)基中的碳源時(shí),所測(cè)的抑菌圈最大，乳桿菌代謝物的抑菌活性最高。因而選擇蔗糖為最佳碳源。圖1中，a為葡萄糖；b為麥芽糖；c為果糖；d為乳糖；e為蔗糖；f為甘露糖。不同字母之間存在差異顯著性（P＜0.05）。下同。

圖1 不同碳源對(duì)乳桿菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖，觀察對(duì)乳桿菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，隨著蔗糖濃度的增大，抑菌物質(zhì)對(duì)指示菌的抑制作用越明顯，當(dāng)ALAC-4培養(yǎng)基中蔗糖濃度在20 g/L時(shí)，對(duì)指示菌的抑菌圈直徑達(dá)到最大值20.32 mm。隨后兩株菌的抑菌性菌明顯下降。因此蔗糖的最佳質(zhì)量濃度為20 g/L。

圖2 蔗糖濃度對(duì)抑菌活性的影響

2.1.2 不同氮源對(duì)抑菌活性的影響

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以10種不同氮源作為培養(yǎng)基中的氮源，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)牛肉膏、蛋白胨、酵母膏以2∶2∶1的比例作為混合氮源添加時(shí)，乳桿菌代謝產(chǎn)物的抑菌性最高。而使用單一氮源的抑菌性均明顯較低。因而，以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏作為培養(yǎng)基的最佳氮源。圖3中，a為酵母膏；b為牛肉膏；c為大豆蛋白胨；d為胰蛋白胨；e為蛋白胨；f為麥芽提取粉；g為牛肉膏：酵母膏（2∶3）；h為蛋白胨：牛肉膏（3∶2）；i為蛋白胨：酵母提取粉（3∶2）;j為蛋白胨：牛肉膏：酵母膏（2∶2∶1）。

圖3 不同氮源對(duì)乳桿菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的氮源，抑菌結(jié)果如圖4。隨著牛肉膏、蛋白胨、酵母膏總濃度的增大，抑菌物質(zhì)對(duì)指示菌的抑制作用越明顯，當(dāng)三者總濃度在25 g/L時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值20.78 mm；隨著濃度的繼續(xù)增加，抑菌圈直徑基本無(wú)變化。故選擇氮源的最佳濃度為25 g/L。

圖4 氮源濃度對(duì)抑菌活性的影響

2.1.3 無(wú)機(jī)金屬離子對(duì)抑菌活性的影響

保持其他物質(zhì)及濃度不變的條件下，在培養(yǎng)基中添加各種無(wú)機(jī)金屬離子，結(jié)果顯示在添加K+，Mn2+，Mg2+三種金屬離子后，菌株ALAC-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌性最好（圖5）。所以選取K+，Mn2+，Mg2+作為乳桿菌ALAC-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)培養(yǎng)基中的金屬離子。圖5中，a鎂∶鈉；b鎂∶錳；c鎂∶鉀；d鈉∶鉀；e鈉∶錳；f錳∶鉀；g錳∶鎂∶鉀；h錳∶鎂∶鈉；i鎂∶鉀∶鈉；j錳∶鉀∶鈉；k錳∶鉀∶鈉∶鎂。

在乳桿菌培養(yǎng)基中添加不同濃度的金屬離子，總添加量在0.4～1.5 g/L范圍內(nèi)變化。結(jié)果如圖6所示，當(dāng)ALAC-4培養(yǎng)基中金屬離子添加量為1 g/L時(shí)，指示菌的抑菌圈直徑達(dá)到最大值19.78 mm。因此，ALAC-4培養(yǎng)基中金屬離子最佳添加量為1 g/L。

圖5 不同金屬離子對(duì)乳桿菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響

圖6 不同無(wú)機(jī)金屬離子濃度對(duì)抑菌活性的影響

2.1.4 吐溫-80添加量對(duì)抑菌活性的影響

在乳桿菌培養(yǎng)基中添加不同量的吐溫-80。當(dāng)培養(yǎng)基中吐溫-80濃度達(dá)到1.0 g/L時(shí)，指示菌的抑菌圈直徑達(dá)到最大值（圖7）。因此，ALAC-4培養(yǎng)基中金屬離子最佳添加量分別為1.0 g/L。

圖7 吐溫-80質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

采用正交實(shí)驗(yàn)L9（34）對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)屬離子、吐溫-80這4個(gè)因素進(jìn)行研究，確定ALAC-4菌株產(chǎn)抑霉菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)基組分。實(shí)驗(yàn)水平及因素如表1所示；正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析如表2所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平因素

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)結(jié)果

表3 抑菌譜

由表2可以看出，在菌株ALAC-4的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分中，對(duì)抑菌物質(zhì)產(chǎn)量大小的影響程度由強(qiáng)到弱依次為：氮源＞金屬離子＞碳源＞吐溫-80，最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為A2B3C3D2，即葡萄糖濃度20 g/L，牛肉膏12 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏6 g/L，硫酸鎂0.6 g/L，硫酸錳0.3 g/L，氯化鉀0.3 g/L，吐溫-80 1 mL/L。

經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此發(fā)酵條件下抑菌圈直徑為23.05 mm,與未經(jīng)優(yōu)化的抑菌圈直徑相比增大了10%。

2.3 抑菌譜

利用牛津杯法檢測(cè)株菌的抑菌譜，結(jié)果如表3所示。ALAC-4對(duì)白假絲酵母、紅酵母和毛霉的抑菌效果較好；對(duì)克魯斯假絲酵母、釀酒酵母和地霉均無(wú)抑菌性；對(duì)黃曲霉、黑曲霉、青霉有一定的抑制作用，但對(duì)寄生曲霉、婁地青霉的抑制作用不明顯。

3 結(jié)論

ALAC-4菌株產(chǎn)抑真菌活性物質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：蔗糖質(zhì)量濃度20 g/L，牛肉膏12 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏6 g/L，硫酸鎂0.6 g/L，硫酸錳 0.3 g/L，氯化鉀0.3 g/L，吐溫-80 1 mL/L。經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，抑菌圈直徑比未經(jīng)優(yōu)化的抑菌圈直徑提高了10%，為23.05 mm。其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有廣譜抑菌性，對(duì)酵母菌和霉菌均具有一定的抑制效果。

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Optimization on fermentation medium for anti-fungal Lactobacillus

LI Xiaoting,CHEN Zhongjun

(College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018，China)

The components of fermentation medium were optimized by orthogonal experiment to improve the production of anti-fungal substance of Lactobacillus ALAC-4.And inhibitory spectrum of antifungal substance also studied.The result showed that the optimized fermen?tation medium were sucrose 20 g/L,beef extract 12 g/L,peptone 12 g/L,yeast extract 6 g/L,magnesium sulfate 0.6 g/L,manganese sulfate 0.3 g/L,potassium chloride 0.3 g/L,tween-80 1 mL/L.And the other medium components were invariable.Under this condition,the inhib?itory zone diameter was 23.05 mm.It was improved 10%than that before optimization.Moreover,the inhibitory spectrum of antifungal compound produced by ALAC-4 was wide.

Lactobacillus；antifungal substance；optimization medium；inhibitory spectrum

Q93-33

A

1001-2230（2017）08-0022-04

2017-02-13

內(nèi)蒙古自然基金（2015MS0364）；國(guó)家自然基金（31260390）。

李曉婷（1991-），女，碩士研究生，從事食品微生物及發(fā)酵工程研究。

陳忠軍