孫 慧，李 瑾，肖 婷，徐 超，尹 昆，黃炳成，雷 戰(zhàn)，魏慶寬

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.004

弓形蟲微線蛋白16抗原表位區(qū)的預(yù)測及酵母表面展示

孫 慧1，李 瑾1，肖 婷1，徐 超1，尹 昆1，黃炳成1，雷 戰(zhàn)2，魏慶寬1

目的應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測弓形蟲微線蛋白16(TgMIC16)B/T細(xì)胞抗原表位并對抗原表位區(qū)進行釀酒酵母菌的表面展示。方法利用DNAStar和IEDB對TgMIC16進行B細(xì)胞抗原表位預(yù)測，利用SYFPEITHI和BIMAS預(yù)測其T細(xì)胞抗原表位。參照預(yù)測結(jié)果，采用pCTCON2/EBY100展示系統(tǒng)對抗原表位區(qū)進行酵母表面展示，利用間接免疫熒光(IFA)和流式細(xì)胞儀檢測表達情況。結(jié)果TgMIC16存在潛在的B/T細(xì)胞抗原表位且集中在aa343-625區(qū)域；該抗原表位區(qū)成功展示到酵母細(xì)胞表面，最佳誘導(dǎo)時間為24～36 h。結(jié)論為下一步酵母載體疫苗的研制及療效評價奠定基礎(chǔ)。

酵母細(xì)胞表面展示；抗原表位；微線蛋白-16

弓形蟲可以感染所有溫血動物，引起嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患弓形蟲病。人類誤食被弓形蟲卵囊污染的食物、水源或攝取含有弓形蟲包囊的未煮熟的肉制品都能引起弓形蟲的感染，因此，美國和法國已將弓形蟲列為繼沙門氏菌和李斯特菌后的第三大食源致死性病原[1-2]。懷孕婦女感染弓形蟲，可導(dǎo)致早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎或胎兒致畸(小腦畸形、小眼畸形等)、胎兒腦積水，嚴(yán)重影響新生兒人口素質(zhì)[3]。

弓形蟲入侵宿主細(xì)胞是多種蛋白協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，在其黏附入侵過程中，伴隨著細(xì)胞器(微線體、棒狀體和致密顆粒)蛋白的順序釋放[4]；微線蛋白(Microneme protein, MIC)是首先釋放的蛋白，在蟲體和宿主細(xì)胞間形成移動鏈接，抑制微線蛋白的表達會嚴(yán)重影響蟲體的附著和入侵。以TgMIC1、TgMIC3、TgMIC4和TgMIC6作為候選抗原的DNA疫苗、重組亞單位疫苗已有報道[5-8]，制備的各類型的疫苗能激發(fā)一定的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫，在抗弓形蟲感染試驗中，各種疫苗雖然僅能提供部分免疫保護、延遲攻蟲小鼠的死亡，但仍然為弓形蟲的免疫預(yù)防提供了新方向。TgMIC16是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種微線蛋白，以其作為候選抗原的基因工程疫苗未見報道。

篩選合適的疫苗遞送系統(tǒng)對基因工程疫苗的制備顯得尤為重要，酵母菌具有天然的抗菌、抗炎癥和中和毒素的功能，能夠刺激機體的天然免疫；酵母載體疫苗在抗菌、抗病毒的防治研究中具有良好的應(yīng)用前景[9]。目前，酵母載體疫苗在弓形蟲的免疫預(yù)防中未見報道。本研究基于酵母表面展示系統(tǒng)，篩選TgMIC16的B/T細(xì)胞抗原表位并對該功能區(qū)進行酵母表達，間接免疫熒光和流式細(xì)胞儀檢測表明該功能區(qū)蛋白成功表達，為下一步酵母載體疫苗的研制及療效評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體與菌株 酵母展示質(zhì)粒pCTCON2和釀酒酵母株EBY100[MATaGAL1-AGA1::URA3ura3-52trp1leu2Δ1his3Δ200pep4::HIS2prb1Δ1.6Rcan1GAL]由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)趙孝民教授饋贈；大腸桿菌(E.coli)感受態(tài)細(xì)胞TOP10由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶(NheI/BamHI)、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自北京全式金有限公司；FITC標(biāo)記羊抗兔IgG (H+L)購自北京博森生物科技有限公司；兔源TgMIC16多抗由本實驗室制備。

1.3 B/T細(xì)胞抗原表位預(yù)測 利用DNAStar和IEDB(http://tools.iedb.org/bcell/)預(yù)測TgMIC16的B細(xì)胞抗原表位，利用BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov)和SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)預(yù)測其T細(xì)胞抗原表位。

1.4 TgMIC16抗原表位區(qū)的PCR擴增 以前期構(gòu)建的pET28a-TgMIC16為模板[10]，P1: 5′-CCCGCTAGCCGTTTCTGTCCC-3′和P2: 5′-CCCGGATCCGCTTTCTTCGCA-3′為引物進行PCR擴增，目的片段為855bp，下劃線部分為NheI和BamHI酶切位點。

1.5 酵母表達載體pCTCON2-TgMIC16T的構(gòu)建 將純化的PCR產(chǎn)物和酵母表達載體pCTCON2分別進行NheI/BamHI雙酶切，于16 ℃連接1.5 h后轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性克隆命名為pCTCON2-TgMIC16T。

1.6 酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 利用醋酸鋰法進行酵母轉(zhuǎn)化，挑取EBY100單菌落于3 mL YPD液體培養(yǎng)基30 ℃過夜培養(yǎng)；按照1∶100的比例接種于10 mL新鮮YPD液體中，30 ℃培養(yǎng)至OD600約0.5左右，回收菌體；分別用2 mL滅菌水、1 mL 1.1×TE/LiAC洗菌體1遍，離心5 min；300μL 1.1×TE/LiAC重懸沉淀，分裝50 μL/管，即為酵母菌感受態(tài)；每管感受態(tài)分別加入5 μL pCTCON2-TgMIC16T和pCTCON2，輕輕混勻，30 ℃孵育30 min；每管加入1 mL 40% PEG3350，42 ℃水浴中，熱激15 min；離心棄上清；加入1 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃孵育2 h，涂布于SD/-Trp篩選平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。

1.7 酵母表面展示TgMIC16 挑取單菌落EBY100/pCTCON2-TgMIC16T和EBY100/pCTCON2于10 mL SDCAA培養(yǎng)基(0.67% YNB，0.5% Casein acids Hydrolysate，2%葡萄糖)中30 ℃培養(yǎng)至OD600約2左右，收集菌體轉(zhuǎn)移至50 mL SGCAA培養(yǎng)基(0.67% YNB， 0.5% Casein acids Hydrolysate，2%半乳糖)中，調(diào)整菌液濃度OD600約為0.8左右，于28 ℃誘導(dǎo)至72 h，分別于誘導(dǎo)后12 h、24 h、36 h、48 h吸取1.0 mL菌液，離心后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 間接免疫熒光(IFA)鑒定 預(yù)冷PBS洗滌菌體；2% BSA37 ℃封閉30 min；100μL 1∶800稀釋的兔源TgMIC16多抗，4 ℃孵育2 h；PBS洗滌后，100μL 1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(G+L)，避光孵育1 h；1 mL預(yù)冷PBS洗滌菌體2遍，熒光顯微鏡觀察。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測 將免疫熒光染色的EBY100/pCTCON2-TgMIC16T和EBY100/pCTCON2細(xì)胞，用300μL PBS重懸，300目篩網(wǎng)過濾后，進行流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1 B細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果 采用IEDB在線預(yù)測B細(xì)胞線性表位，我們將閾值上調(diào)至0.5，由圖1A可見，線性表位區(qū)集中在aa340～580之間，采用DNAStar對TgMIC16的親水區(qū)、蛋白表面可能性以及表面抗原指數(shù)進行預(yù)測，分值較高的區(qū)域集中在aa450～625(圖1B)。

A. Prediction of IEDB，B. Prediction of DNAStar圖1 IEDB 和 DNAStar預(yù)測B細(xì)胞表位結(jié)果Fig.1 Prediction of B cell epitope using IEDB and DNAStar

2.2 T細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果 采用在線軟件BIMAS和SYFPEITHI對TgMIC16進行T細(xì)胞表位預(yù)測，分別選取了兩者預(yù)測結(jié)果中分值較高的17個抗原表位(表1，2)，統(tǒng)計兩個軟件高分值的相同區(qū)域共計7個(aa13～21、aa61～69、aa315～323、aa413～421、aa415～423、aa467～475、aa485～493)，其中，有4個T細(xì)胞抗原表位(aa413～421、aa415～423、aa467～475、aa485～493)存在于B細(xì)胞抗原表位集中區(qū)域?；贐/T細(xì)胞抗原表位區(qū)預(yù)測結(jié)果和保持TSR功能區(qū)的完整性考慮，我們選取aa343～625進行下一步的蛋白表達。

2.3 TgMIC16T的PCR擴增及pCTCON2-TgMIC16T酶切鑒定結(jié)果 PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約1 000 bp的條帶，與預(yù)期的855 bp的理論值相符(圖2)。利用NheI/BamHI雙酶切鑒定pCTCON2-TgMIC16T，電泳結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pCTCON2-TgMIC16T構(gòu)建成功(圖2)。

1：PCR product of TgMIC16T 2：pCTCON2-TgMIC16T digested with NheⅠand BamHⅠ M：Trans 5K DNA marker圖2 TgMIC16T的PCR擴增及pCTCON2-TgMIC16T酶切結(jié)果Fig.2 Amplification of TgMIC16T and digestion identification of pCTCON2-TgMIC16T

表1 BIMAS 預(yù)測的T細(xì)胞表位
Tab.1 Prediction of T cell epitope using BIMAS

RankStartpositionSubsequenceresiduelistingScore(Estimateofhalftimeofdisassociationofamoleculecontainingthissubsequence)138KVYAPVFTC64.9482413VLWISGDVL60.5563155MQMGECQNV44.3564467NVLSPLQWI42.7275485TLTRSELDL21.3626472LQWISVTPC16.347748RQFLYEKYT15.3758211NSYLYFSWV15.182966LVALCVIFT14.02210206AQALDNSYL11.913115CLCTAMSSA11.4261262TLGGLVALC11.42613495MNPSAMCWV9.7641413ALSQRNCIL8.75915315DVCPNLWEV7.87416415WISGDVLSM7.22717476SVTPCASNV6.086

表2 SYFPEITHI 預(yù)測的T細(xì)胞表位
Tab. 2 Prediction of T cell epitope using SYFPEITHI

RankStartPositionSubsequenceresiduelistingScore161TTLGGLVAL27213ALSQRNCIL223413VLWISGDVL224315DVCPNLWEV215415WISGDVLSM216485TLTRSELDL20762TLGGLVALC19890SDLSPPATV199138IRFPNQASV1910243DVEDCLVDV1911467NVLSPLQWI1912566FVSCGTGCV191355YTRRRCTTL1814162NVYWGKKEL1815289GVKGRFREL1816397ILNPLHACP1817546SCASSEVSL18

2.4 IFA鑒定結(jié)果 從蛋白誘導(dǎo)表達開始每隔12 h取樣進行IFA鑒定。結(jié)果表明，EBY100/pCTCON2-TgMIC16T誘導(dǎo)12 h后有點狀綠色熒光散在出現(xiàn)，24～36 h整個酵母細(xì)胞表面呈亮綠色熒光(圖3)，此后，隨著表達時間的延長，熒光的強度逐漸減弱。

A-D: EBY100/pCTCON2-TgMIC16T under FITC filter from 12 h to 72 h after induced expressionE-H: EBY100/pCTCON2-TgMIC16T under normal white light from 12 h to72h after induced expression 圖3 EBY100/pCTCON2-TgMIC16T的IFA鑒定結(jié)果Fig.3 Indirect immunofluorescence detection of EBY100/pCTCON2-TgMIC16T

2.5 流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果 利用流式細(xì)胞儀進一步檢測EBY100/pCTCON2-TgMIC16T的表達。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)表達后24 h和36 h的展示效率高于12 h和48 h，與IFA鑒定結(jié)果一致。

3 討 論

抗原表位，又稱抗原決定基或抗原決定簇(antigenic determinant，AD)指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團[11]。抗原通過抗原表位與相應(yīng)的抗體或淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，從而引起免疫應(yīng)答。表位既然是蛋白抗原可產(chǎn)生免疫性的最小區(qū)域，因此在疫苗制備中為提高蛋白的免疫原性往往需要篩選候選抗原的抗原表位。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的不斷更新，計算機虛擬預(yù)測篩選抗原表位逐漸代替了傳統(tǒng)的表位篩選[12]。

細(xì)胞表面展示技術(shù)是指利用DNA重組技術(shù)將外源蛋白定位表達于細(xì)胞表面。多數(shù)的生物技術(shù)都經(jīng)歷了從原核生物到真核生物的發(fā)展應(yīng)用，該技術(shù)從噬菌體表面展示發(fā)展到細(xì)菌表面展示、再到現(xiàn)在的酵母菌表面展示，經(jīng)歷了一系列的技術(shù)變革[13]。酵母菌被公認(rèn)為是安全的且廣泛應(yīng)用于食品制造業(yè)和制藥業(yè)，抗體可以識別酵母表面表達的外源抗原表位并與之特異地結(jié)合[14]，能有效地誘導(dǎo)抗原特異性的免疫應(yīng)答；本研究將篩選的TgMIC16抗原表位區(qū)展示在酵母菌表面，IFA和流式細(xì)胞儀檢測表明，外源蛋白從誘導(dǎo)12 h后開始表達，誘導(dǎo)24 h和36 h的表達效率高于12 h和72 h。本研究為后續(xù)構(gòu)建抗原表位疫苗及免疫診斷奠定實驗基礎(chǔ)。

[1] Saouros S, Dou Z, Henry M, et al. Microneme protein 5 regulates the activity ofToxoplasmasubtilisin 1 by mimicking a subtilisin prodomain[J]. J Biol Chem, 2012, 287(43): 36029-36040. DOI: 10.1074/jbc.M112.389825

[2] Wang T, Tang ZH. Toxoplasmosis: tHe spread of tachyzoites, cysts and oocysts[J]. Chin J Zoonoses, 2012, 28(11): 1133-1136. (in Chinese)

汪濤，湯自豪. 弓形蟲?。核僦匙?、包囊和卵囊的傳播[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2012, (11):1133-1136.

[3] Torrey EF, Bartko JJ, Yolken RH.Toxoplasmagondiiand other risk factors for schizophrenia: an update[J]. Schizophr Bull, 2012, 38(3): 642-647. DOI: 10.1093/schbul/sbs043

[4] Hoff EF, Cook SH, Sherman GD, et al.Toxoplasmagondii: molecular cloning and characterization of a novel 18-kDa secretory antigen, TgMIC10[J]. Exp Parasitol, 2001, 97(2): 77-88. DOI:10.1006/expr.2000.4585

[5] Lourenco EV, Bernardes ES, Silva NM, et al. Immunization with MIC1 and MIC4 induces protective immunity againstToxoplasmagondii[J]. Microbes Infect, 2006, 8: 1244-1251. DOI:10.1016/j.micinf.2005.11.013

[6] Fang R, Nie H, Wang ZS, et al. Protective immune response in BALB/c mice induced by a suicidal DNA vaccine of the MIC3 gene ofToxoplasmagondii[J]. Vet Parasitol, 2009, 164: 134-140. DOI: 10.1016/j.vetpar.2009.06.012

[7] Peng GH, Yuan ZG, Zhou DH, et al.Toxoplasmagondiimicroneme protein 6 (MIC6) is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis in mice[J]. Vaccine, 2009, 27: 6570-6574. DOI: 10.1016/j.vaccine.2009.08.043

[8] Liu MM, Yuan ZG, Peng GH, et al.Toxoplasmagondiimicroneme protein 8 (MIC8) is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis[J]. Parasitol Res, 2010, 106: 1079-1084. DOI: 10.1007/s00436-010-1742-0

[9] Shin MK, Yoo HS. Animal vaccines based on orally presented yeast recombinants[J]. Vaccine, 2013, 31(40): 4287-4292. DOI: 10.1016/j.vaccine.2013.07.029

[10] Li J, Cui Y, Yin K, et al. Prokaryotic expression, purification and immunological characterization of micronemal protein 16 oftoxoplamagondii[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2016, 34(3): 198-202. (in Chinese)

李瑾，崔勇，尹昆，等. 剛地弓形蟲微線蛋白16基因片段原核表達、純化及免疫反應(yīng)性分析[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2016, 34(3):198-202.

[11] Li YJ, Wang J, Zhao H, et al. Bioinformatics prediction on eg95 antigen epitopes ofEchinococcusgranulosus[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(10): 892-896, 900. (in Chinese)

李玉嬌，王晶，趙慧，等. 細(xì)粒棘球絳蟲Eg95抗原表位的生物信息學(xué)預(yù)測[J]. 中國人獸共患病學(xué)報,2011,(10):892-896，900.

[12] He SW, Wei XX. Prediction of epitopes of the myophilin protein fromEchinococcusgranulosus[J]. J Pathog Biol, 2017, 12(1): 42-45，50. (in Chinese)

何順偉，魏曉星. 細(xì)粒棘球絳蟲myophilin的抗原表位預(yù)測[J]. 中國病原生物學(xué)雜志,2017,(01):42-45，50.

[13] Lee SY, Choi JH, Xu Z. Microbial cell-surface display[J]. Trends Biotechnol, 2003, 21(1): 45-52. DOI: 10.1016/S0167-7799(02)00006-9

[14] Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries[J]. Nat Biotechnol, 1997, 15: 553-557. DOI: 10.1038/nbt0697-553

PredictionandyeastsurfacedisplayofantigenicepitoperegionofTgMIC16ofToxoplasmagondii

SUN Hui1, LI Jin1, XIAO Ting1, XU Chao1, YIN Kun1, HUANG Bing-cheng1, LEI Zhan2,WEI Qing-kuan1

(1.ShandongAcademyofMedicalSciences,ShandongInstituteofParasiticDiseases,Jining272033,China；2.ShandongAcademyofMedicalSciences,ShandongLaboratoryAnimalCenter,Jinan250000,China)

The bioinformatics software was used to predict the B cell and T cell epitopes ofToxoplasmagondiimicroneme 16 (TgMIC16) followed by epitopes display on the yeast ofSaccharomycescerevisiae. B and T cell epitopes of TgMIC16 were predicted by DNAStar and IEDB, and software of SYFPEITHI and BIMAS, respectively. According to the predicted results, the antigenic epitope region was expressed with pCTCON2/EBY100 display system. The expression protein was detected by indirect immunofluorescence (IFA) and flow cytometry. Results showed that there were potential B/T cell epitopes in TgMIC16 and concentrated in the aa343-625 region. The epitope region was successfully displayed on the surface of yeast cells, and the optimal induction time was 24 hours. The study would lay the foundation for the development and efficacy evaluation of the yeast carrier vaccine in the further research.

yeast surface display; antigen epitope; microneme protein-16

Wei Qing-kuan, Email: wqkzlj@sina.com

國家自然科學(xué)基金(No. 81501770)；山東省自然科學(xué)基金(No. ZR2015YL051, No. ZR2015YL033, No ZR2016CP18)；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程

魏慶寬，Email: wqkzlj@sina.com

1.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東省寄生蟲病防治研究所，濟寧 272033； 2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東省實驗動物中心，濟南 250000

R382.5

：A

：1002-2694(2017)09-0774-05

2017-04-20編輯：劉岱偉

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81501770), the Shandong Natural Science Foundation (Nos. ZR2015YL051, ZR2015YL033 and ZR2016CP18), and the Innovation Project of Shandong Academy of Medical Sciences