曾林子，廖虹瑜，祁 騰，劉 誼，劉莉莉，羅隆澤

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.006

四川省嗜肺軍團(tuán)菌血清Ⅰ型(LP1)基因分型研究

曾林子1，廖虹瑜1，祁 騰1，劉 誼2，劉莉莉1，羅隆澤1

目的為了解四川省嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila,LP)基因特征，采用多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)和基因序列分型(SBT)兩種方法對(duì)四川省1989—2016年分離到的42株嗜肺軍團(tuán)菌血清I型(LP1)進(jìn)行基因分型研究。方法根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的軍團(tuán)菌8個(gè)VNTR位點(diǎn)和SBT 7個(gè)管家基因?qū)?2株嗜肺軍團(tuán)1型菌(LP1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。VNTR結(jié)果經(jīng)毛細(xì)管電泳分析后，得到MLVA分型。SBT結(jié)果測(cè)序后上傳至歐洲軍團(tuán)菌感染組(EWGLI)數(shù)據(jù)庫(kù)得到ST分型。結(jié)果42株嗜肺軍團(tuán)菌血清I型(LP1)分為8個(gè)MLVA型，優(yōu)勢(shì)型別為M08型(47.6%)和M07型(23.8%)。SBT分為 12個(gè)ST型，其中有2個(gè)ST型(ST2359,ST2360)為首次發(fā)現(xiàn)。ST1(52.3%)、ST630(14.2%)為優(yōu)勢(shì)型別。12個(gè)ST型分為3個(gè)克隆群(Clonal Complex,CCs)和2個(gè)singleton。結(jié)論MLVA方法和SBT方法均能用于LP1型分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及分子遺傳學(xué)特征的研究。四川省LP1型具備較高的遺傳多樣性和地區(qū)特異性，有感染人的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)公共衛(wèi)生環(huán)境中軍團(tuán)菌的監(jiān)測(cè)工作。

四川?。皇确诬妶F(tuán)菌血清Ⅰ型；基因分型

軍團(tuán)菌是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于各種水環(huán)境中，尤其是空調(diào)冷卻塔、供水系統(tǒng)和溫泉水等人工水環(huán)境中。它能通過(guò)呼吸道傳播，引起以肺部感染為主要癥狀的軍團(tuán)菌病。軍團(tuán)菌目前大約有 50 個(gè)種, 72 個(gè)血清型，90%以上的軍團(tuán)菌病都是由嗜肺軍團(tuán)菌引起的,其中嗜肺軍團(tuán)菌血清Ⅰ型菌株(Lp1) 為主要的致病血清型[1]。為了解四川省嗜肺軍團(tuán)菌血清Ⅰ型菌株的分子特征，豐富嗜肺軍團(tuán)菌基因庫(kù)數(shù)據(jù)，本研究采用多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)方法和多位點(diǎn)測(cè)序方法(SBT)對(duì)四川省1989—2016年分離到的嗜肺軍團(tuán)菌血清I型(LP1)進(jìn)行了基因分型研究。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源 42株LP1來(lái)源于1989-2016年期間四川省6個(gè)城市的監(jiān)測(cè)樣本，其中29株分離自酒店集中空調(diào)冷卻塔水，2株分離自酒店淋浴熱水，4株來(lái)源于成都市內(nèi)噴泉水，6株來(lái)源于雅安市、康定縣的溫泉水，1株來(lái)源于四川省第1例軍團(tuán)菌病人。

1.2 菌株培養(yǎng)與鑒定 菌株復(fù)蘇后接種于炭粉酵母浸出物培養(yǎng)基(BCYE)(北京路橋生物試劑有限公司)，置于37 ℃,5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48～60h后，采用文獻(xiàn)[2]的軍團(tuán)菌屬特異性16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)確定為嗜肺軍團(tuán)菌的菌株用血清凝集方法進(jìn)行血清學(xué)分型鑒定(天津生物芯片)。

1.3 軍團(tuán)菌DNA制備 挑取分離純化后的軍團(tuán)菌于1 mL生理鹽水中制備成菌懸液，DNA提取按照試劑盒(QIAam pDNA MiniKit)說(shuō)明進(jìn)行操作，提取的DNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MLVA 參考文獻(xiàn)[3-4]引物，選取其中8個(gè)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(Variable Number Tanden Repeat,VNTR)位點(diǎn)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，引物用熒光標(biāo)記。擴(kuò)增產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳儀讀取片段長(zhǎng)度，確定串聯(lián)重復(fù)序列重復(fù)數(shù)。將8對(duì)引物分為3個(gè)VNTR組進(jìn)行擴(kuò)增(VNTR1、VNTR2、 VNTR3)，PCR反應(yīng)體系均為25 μL，其中2×PCR Mixture(擎科生物限公司) 12.5 μL,上下游引物(10 mmol/L)各1 μL，去離子水5.5 μL(VNTR1、VNTR2)或者7.5 μL(VNTR3)，軍團(tuán)菌DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性 30 s,60 ℃退火30 s,延伸72 ℃ 45 s,共35個(gè)循環(huán)，72 ℃終末延伸10 min。

1.5 SBT 參考文獻(xiàn)[5-6]引物，對(duì)7個(gè)基因位點(diǎn)flaA、pilE、asd、mip、momps、proA和neuA(neuA*)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、測(cè)序。將得到的序列信息與歐洲軍團(tuán)菌感染工作組(EWGLI)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì),獲得相應(yīng)的ST 型。PCR反應(yīng)體系均為25 μL，其中1×PCR Mixture(擎科生物有限公司) 22 μL,上下游引物(10 mmol/L)各1 μL，軍團(tuán)菌DNA模板1μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性 30 s,55 ℃退火30 s,延伸72 ℃ 45 s,共35個(gè)循環(huán)，72 ℃終末延伸10 min。

1.6 聚類分析 采用BioNumerics Version 7.6軟件對(duì)MLVA和SBT分型結(jié)果進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 16S rRNA及血清學(xué)鑒定 42株實(shí)驗(yàn)菌株軍團(tuán)菌屬16S rRNA 檢測(cè)均為陽(yáng)性，擴(kuò)增條帶為650 bp。血清凝集實(shí)驗(yàn)顯示均為嗜肺軍團(tuán)菌血清Ⅰ型。

2.2 MLVA聚類分析 42株LP1的8個(gè)MLVA位點(diǎn)均能擴(kuò)增出產(chǎn)物，通過(guò)BioNumerics Version 7.6聚類分析分為8個(gè)MLVA型，聚類分析見(jiàn)圖1，其中M08型菌株最多(n=20),占總數(shù)量的47.6%，其次為M07型(n=10),比例為23.8%，M01型和M04型也包含2種以上的菌株，比例分別為14.2%(n=6)和4.7%(n=2)。M02型、M03型、M05型、M06型僅有1株菌。MLVA型跟菌株來(lái)源有相關(guān)性，20株M08型菌株，除1株來(lái)源于噴泉水以外其余19株均分離自空調(diào)冷卻水。10株M07型菌株，除1株來(lái)源于噴泉水以外其余9株均分離自溫泉水。

2.3 SBT聚類分析 42株LP1的7個(gè)管家基因擴(kuò)增均為陽(yáng)性，分為12個(gè)ST型，其中2個(gè)ST型(ST2359,ST2360)為新ST型，剩余10個(gè)ST型(ST1,ST36,ST578,ST579,ST630,ST971,ST1011,ST1279,ST1562,ST1777)在歐洲軍團(tuán)菌感染工作組(EWGLI)數(shù)據(jù)庫(kù)中有報(bào)道。ST1,ST36,ST630,ST2359型包含2株以上的菌株，以ST1型最常見(jiàn)，比例分別為52.3%(n=22)、4.7%(n=2)、14.2%(n=6)、9.5%(n=4)，其余8個(gè)型均只有1株菌。聚類分析見(jiàn)圖2。

為了解各ST型間的相互關(guān)系，同樣通過(guò)BioNumerics Version 7.6軟件，繪制了四川省LP1的克隆群分布圖，見(jiàn)圖3。12個(gè)ST型分為3個(gè)克隆群(Clonal Complex,CCs)和2個(gè)singleton。其中CC1群為四川省優(yōu)勢(shì)克隆群，包括30株菌，涵蓋了ST1, ST630, ST1011, ST1777 四個(gè)型別，CC3群有7株菌，包含了ST2359, ST2360, ST971、ST1562四個(gè)型，CC2群有3株菌，包含兩個(gè)ST型，ST36和ST579。3個(gè)克隆群菌株來(lái)源不同，CC1的菌株主要來(lái)源于人造水環(huán)境，包括空調(diào)冷卻水、酒店淋浴熱水及城市噴泉水，CC3的菌株主要來(lái)源于天然水環(huán)境——溫泉水，CC2菌株來(lái)源于病人和人造水環(huán)境。

圖2 42株LP1的 SBT型聚類分析Fig.2 Clustering results of data obtained by SBT analysis of 42 LP1 isolates

圖3 42株LP1的克隆群分析結(jié)果Fig. 3 Minimum spanning tree analysis of 42 LP1

3 討 論

目前，用于嗜肺軍團(tuán)菌研究的分子分型方法很多，常見(jiàn)的有基因序列分型(Sequence based typing，SBT) 、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性分析(Multiple Loci VNTR Analysis,MLVA) 、脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE) 、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分型(Amplified Fragment LengthPolymorphism，AFLP) 等[7-9]。本研究選用MLVA和SBT方法對(duì)四川省LP1型菌株進(jìn)行分子分型，這兩種方法都具有重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)字化、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果可與中國(guó)其他地區(qū)及其他國(guó)家作比較。

軍團(tuán)菌VNTR分型方法可選擇不同的位點(diǎn)，C.Pourcel[3,10-11]報(bào)道了選用9個(gè)組合位點(diǎn)(Lpms1、Lpms4、Lpms4b、Lpms5、Lpms11、Lpms13、Lpms17、Lpms19、Lpms25)和8個(gè)組合(Lpms1_b、Lpms3 、Lpms13、Lpms17、Lpms19_b、Lpms33、Lpms34、Lpms35)位點(diǎn)對(duì)軍團(tuán)菌進(jìn)行VNTR分型研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8-MLVA方法更適用于嗜肺軍團(tuán)菌血清1型的分子分型，本研究最終選擇8-MLVA方法對(duì)四川省分離的嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行分子分型。

C. Pourcel建立了嗜肺軍團(tuán)菌的MLVA基因庫(kù)(http://mlva.upsud.fr/ml vav4/genotyping),截止到2016年9月，基因庫(kù)里一共收錄了1 140株嗜肺軍團(tuán)菌的MLVA數(shù)據(jù)，其中包括338株LP1。本研究發(fā)現(xiàn)，四川省優(yōu)勢(shì)MLVA型為M07和M08，分別占總數(shù)量的23.8% (10/42)和47.6% (20/42),它們均屬于VACC1，全部分離自人工水環(huán)境(空調(diào)冷卻水、酒店淋浴熱水以及噴泉水)。這兩種MLVA型同樣廣泛存在于世界其他國(guó)家，英國(guó)、法國(guó)、瑞士、德國(guó)、以色列、希臘、瑞典，西班牙均有報(bào)道[7]。除了分離自環(huán)境外，還有臨床病人株，表明四川省分離到的M07、M08菌株有感染人的風(fēng)險(xiǎn)。M04屬于VACC2，包括兩株菌，分別來(lái)源于1989年四川省第1例軍團(tuán)菌病病人和2011年成都市區(qū)噴泉水，蘇格蘭、法國(guó)、英國(guó)、瑞士、德國(guó)等地也有過(guò)此型別的報(bào)道[5]，報(bào)道的大部分M04菌株都來(lái)源于臨床病人，因此，M04型別的菌株容易引起人的感染。來(lái)源于噴泉水的菌株分離自成都市鬧市區(qū)的噴泉中，長(zhǎng)年有大量游客和本地人到此處觀光游覽，有關(guān)衛(wèi)生部門應(yīng)該加強(qiáng)此地人工噴泉的監(jiān)測(cè)，做好消毒工作，阻斷傳染源。M06型屬于VACC6，于2007年分離自成都酒店空調(diào)冷卻水中，美國(guó)和瑞士有相關(guān)型別報(bào)道，其中瑞士的菌株來(lái)源于臨床病人。M01、M02、M03、M05屬于四川省特有的MLVA型，未見(jiàn)到有文獻(xiàn)報(bào)道，這些菌株均來(lái)源于環(huán)境樣本，包括空調(diào)冷卻水和溫泉水，其中M01型菌株除1株來(lái)源于空調(diào)水，其余都來(lái)源于溫泉水，溫泉水溫度在39～42 ℃。此型別的菌株是否具有致病力，還需要進(jìn)一步的研究。

基因序列分型(SBT)是歐洲軍團(tuán)菌工作組推薦的一種軍團(tuán)菌分子分型的方法，選用以下7個(gè)管家基因flaA、pilE、asd、mip、momps、proA和neuA(neuA*)用于PCR擴(kuò)增，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，某一些菌株的neuA基因無(wú)法擴(kuò)增，故用neuA*代替[12]，本研究中有1株菌選用了neuA*，這株菌來(lái)源于成都的空調(diào)冷卻水，ST型別為ST1777。本研究第一次應(yīng)用SBT方法建立了四川省LP1型菌株的數(shù)據(jù)庫(kù)，42株LP1菌分成12個(gè)ST型別,顯示四川省LP1的具有較高的遺傳多樣性。

據(jù)歐洲軍團(tuán)菌工作組報(bào)道，目前數(shù)據(jù)庫(kù)里收錄了11 563株軍團(tuán)菌，有7 675株軍團(tuán)菌分離自臨床病人，3 792株菌株來(lái)源于環(huán)境樣本，未知來(lái)源的菌株有96株(截止到2017年4月5日)。數(shù)據(jù)庫(kù)里一共有2 355種ST型，優(yōu)勢(shì)型別是ST1型，四川省的優(yōu)勢(shì)型同樣也是ST1，占總數(shù)量的53.3%(22/42),所有的ST1型菌株均來(lái)源于人工水環(huán)境，包括空調(diào)冷卻水(77.3%)、噴泉水(13.6%)和酒店淋浴熱水(9.1%)，這與秦天[13]的調(diào)查報(bào)道一致。E.van Heijnsbergena[14]曾做過(guò)荷蘭土壤中軍團(tuán)菌的研究，結(jié)果未從土壤中分離到ST1型的軍團(tuán)菌。ST1型菌株廣泛存在于世界各地，除了來(lái)自于環(huán)境樣本，還有分離自臨床病人，目前四川省尚沒(méi)有從臨床病人身上分離到。

ST630是四川省僅次于ST1型的(14.2%)型別，均來(lái)源于空調(diào)冷卻水，分布于四川省境內(nèi)的四個(gè)城市：成都市、樂(lè)山市、內(nèi)江市、雅安市。此型在中國(guó)廣州市和北京市也見(jiàn)到報(bào)道，同樣也分離自環(huán)境樣本，國(guó)外報(bào)道較少，法國(guó)有1例病人報(bào)道。其他的型別如ST579、ST1011、ST578在歐洲、亞洲、北美洲都曾經(jīng)從環(huán)境樣本和病人身上分離到，而ST971、ST1562、ST1777存在于廣東省和四川省環(huán)境樣本中。ST2359、ST2360是四川省發(fā)現(xiàn)的新型，分離自雅安市境內(nèi)某溫泉。溫泉水里的軍團(tuán)菌污染是引起人類感染軍團(tuán)菌病的主要來(lái)源之一，ST36包括兩株菌，用8-MLVA方法將它們聚為M04型，兩種方法都成功地把這兩株菌聚為一類，表明它們之間有著高度的一致性。

本研究通過(guò)用8-MLVA和SBT的方法，對(duì)四川省1989-2016年分離到的LP1分別進(jìn)行基因分型，結(jié)果表明這兩種方法均能用于嗜肺軍團(tuán)菌分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及分子遺傳學(xué)特征的研究，展示了四川省LP1優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)菌群的分布特征，也表明了四川省的軍團(tuán)菌有感染人的風(fēng)險(xiǎn)。在今后的監(jiān)測(cè)工作中，可把兩種方法結(jié)合起來(lái)，可以更加準(zhǔn)確地迅速找到軍團(tuán)菌病的傳染源及暴發(fā)流行的趨勢(shì)。

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GenetypingofLegionellapneumophilaserogroup1inSichuanProvince,China

ZENG Lin-zi1, LIAO Hong-yu1, QI Teng1, LIU Yi2, LIU Li-li1, LUO Long-ze1

(1.SichuanCenterforDiseaseControlandPrevention,Chengdu610041,China;2.ShenzhenHongcaiTestingTechnologyCO.,LTD,Shenzhen518172,China)

The aim of the research is to investigate the genetic characteristics ofLegionellapneumophilaserogroup1 (LP1) in Sichuan Province. The sequence-based typing (SBT) and multiple-locus VNTR analysis (MLVA) were used to describe the genetic polymorphism of 42 strains which were isolated from 1989-2016 in Sichuan Province, China. According to the reference, PCR was used to detect the 8-VNTR loci and 7 housekeeping genes respectively. The VNTR results were determined by using capillary electrophoresis, and the SBT results were sequenced and compared with the database of EWGLI. Results showed that totally 42 stains were divided into 8 MLVA types with the advantage types were M08(47.6%) and M07(23.8%). Twelve ST types were obtained with 3 main clonal complex and 2 singleton, including 2 novel ST types, among those, ST1 was the predominant type, accounting for 52.3%,following by ST630(14.2%). In conclusion, our results demonstrated MLVA and SBT were both applied to the research for molecular epidemiological investigation of LP1 and showed the high genetic polymorphism and the regional specificity. The results also suggest that the isolates are a potential threat to the public, effective control and prevention strategies are urgently needed.

Sichuan Province;Legionellapneumophilaserogroup1; gene typing

Luo Long-ze, Email: luoscdc@126.com

羅隆澤：Email:luoscdc@126.com

1.四川省疾病預(yù)防控制中心，成都 610041； 2.深圳市虹彩檢測(cè)技術(shù)有限公司，深圳 518172

R378

：A

：1002-2694(2017)09-0784-05

2017-04-06編輯：梁小潔

四川省醫(yī)學(xué)會(huì)青年創(chuàng)新課題(No.Q15081)

Supported by the Youth Innovation Project of Sichuan Medical Association (No.Q15081)