陳錫龍，孫真崢，王慶紅

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽550003)

高效液相色譜法同時測定獸用復(fù)方氨基比林注射液中二組分含量的研究

陳錫龍，孫真崢，王慶紅

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽550003)

建立了獸用復(fù)方氨基比林注射液二組分含量測定的高效液相色譜法。以C18柱為固定相，0.05 mol/L的磷酸二氫鉀(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值到8.2)︰乙腈=75︰25為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長240 nm。采用外標(biāo)法定量計算含量。巴比妥的線性范圍為5.6～280 μg/mL，回歸方程為y=21.856x+42.143(n=5)，相關(guān)系數(shù)R2=1.0000；氨基比林的線性范圍為14.3～715.0 μg/mL，回歸方程為y=22.267x-13.009 (n=5)，相關(guān)系數(shù)R2=1.0000。巴比妥80%、100%、120%三個添加水平的回收率在97.86%～101.06%之間，相應(yīng)的氨基比林的回收率在99.48%～100.84%之間。方法專屬性強，靈敏度佳，準(zhǔn)確度高，能夠有效控制獸用復(fù)方氨基比林注射液的質(zhì)量。

復(fù)方氨基比林注射液；含量測定；高效液相色譜法

Abstract: A method was developed to determine two components of veterinary Compound Aminophenazone Injection by HPLC, with C18 column as stationary phase, a solution of 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate (pH adjusted to 8.2 by triethylamine)-acetonitrile=75︰25 as mobile phase，flow rate of 1.0 mL/min, column temperature of 30 degree Celsius, and wavelength of 240 nm. It was quantified by external standard method and the linear range of barbital was between 5.6 and 280.0 μg/mL, and the regression equation wasy=21.856x+42.143,R2=1.0000; the linear range of aminophenazone was between 14.3 and 715.0 μg/mL, and the regression equation wasy=22.267x-13.009,R2=1.0000. Results showed that recoveries of 80%, 100%, 120% adding level of barbital were between 97.86% and 101.06%, and relative recoveries of amino￣phenazone were between 99.48% and 100.84%. The method was precise, specific and accurate, and could be used for the content determination of veterinary Compound Aminophenazone Injection.

Keywords: compound aminophenazone injection; content determination; HPLC

獸用復(fù)方氨基比林注射液為臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，主要用于馬、牛、羊、豬等動物的解熱和抗風(fēng)濕，也可用于馬和騾的疝痛。復(fù)方氨基比林注射液收載于2015版《中華人民共和國獸藥典》[1]，其兩個組分的含量測定均采用滴定法。該方法操作繁瑣，專屬性不強[2]。有文獻[2-4]報道了人用藥品中復(fù)方氨基比林注射液或復(fù)方氨林巴比妥注射液中三組分的HPLC測定法，但關(guān)于獸藥的測定法未見報道。文獻[5-6]只報道了獸藥安痛定注射液中氨基比林和安替比林含量的HPLC法，但不包括巴比妥。本試驗采用普通C18柱作為固定相，通過高效液相色譜法同時測定了復(fù)方氨基比林注射液中兩個組分的含量，并進行了方法學(xué)驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥 Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀(配紫外檢測器)；BP211D型電子分析天平(德國塞多利斯公司)；巴比妥對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：171202-201206，含量：99.6%)；氨基比林對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100503-201302，含量：99.9%)；試驗樣品復(fù)方氨基比林注射液四批，規(guī)格均為10 mL:氨基比林0.715 g+巴比妥0.285 g，編號分別為：A、B、C、D (標(biāo)稱生產(chǎn)企業(yè)名稱及批號分別為：上海申亞動物保健品有限公司，150531；山西易多利動物藥業(yè)有限公司，150801；上海申亞動物保健品有限公司，160319；遵義縣獸藥廠，160401)；甲醇為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值到8.2)︰乙腈=75︰25；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為240 nm[2-3]；進樣體積為10 μL。在此色譜條件下，復(fù)方氨基比林混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 復(fù)方氨基比林混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)及供試品溶液(b)色譜圖Fig 1 Chromatograms of standards (a) and sample (b) of compound aminophenazone

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 分別精密稱取巴比妥對照品28.0 mg和氨基比林對照品71.5 mg，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，混勻，即得巴比妥濃度為280.0 μg/mL，氨基比林濃度為715.0 μg/mL的氨基比林混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密量取復(fù)方氨基比林注射液1.00 mL，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，混勻，制成巴比妥濃度為285.0 μg/mL，氨基比林濃度為715.0 μg/mL的復(fù)方氨基比林溶液作為供試品溶液。

2 結(jié) 果

2.1 線性范圍 精密量取巴比妥濃度為280.0 μg/mL、氨基比林濃度為715.0 μg/mL的氨基比林混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，分別置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，得含巴比妥濃度分別為5.6、28.0、56.0、140.0、280.0 μg/mL和氨基比林濃度分別為14.3、71.5、143.0、357.5、715.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。巴比妥及氨基比林標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)分別見表1和表2。

表1 巴比妥溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Tab 1 Data of barbital standard curve

表2 氨基比林溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Tab 2 Data of aminophenazone standard curve

2.2 儀器精密度試驗 精密量取巴比妥濃度為280.0 μg/mL和氨基比林濃度為715.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，上機測定。重復(fù)測定6次，巴比妥和氨基比林測量結(jié)果峰面積的RSD值分別為0.04%和0.08%，說明方法具有良好的精密度。

2.3 重復(fù)性試驗 取批號為160401的D樣品，精密量取適量，分別按標(biāo)示量用流動相稀釋制成1 mL含巴比妥285.0 μg和氨基比林715.0 μg的供試品溶液，作6個平行，按上述方法中的色譜條件測定，每個平行進樣2針，結(jié)果巴比妥和氨基比林的平均含量分別為標(biāo)示含量的96.0%和95.1%，RSD值分別為0.05%和0.06%。

2.4 回收率試驗 精密稱取巴比妥和氨基比林標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，按處方分別制成含巴比妥和氨基比林分別為80%(L)、100%(M)、120%(H)的三種不同濃度的添加樣品各3份，然后分別量取100 μL添加樣品置10 mL量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度。精密吸取10 μL上機測定，計算各添加樣品的回收率，結(jié)果見表3和表4。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗 取復(fù)方氨基比林注射液，精密量取適量，用流動相稀釋制成1 mL含巴比妥285.0 μg和氨基比林715.0 μg的供試品溶液，分別于0、12、24 h，測定峰面積，結(jié)果表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 巴比妥回收率試驗結(jié)果Tab 3 Recovery results of barbital in different adding level

表4 氨基比林回收率試驗結(jié)果Tab 4 Recovery results of aminophenazone in different adding level

2.6 樣品含量的測定 取A、B、C、D四公司生產(chǎn)的復(fù)方氨基比林注射液樣品，精密量取1.00 mL置100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為供試品溶液，精密吸取10 μL上機測定。另取1 mL含巴比妥280.0 μg和氨基比林715.0 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為對照品溶液，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計算含量，巴比妥結(jié)果分別為96.6%、95.0%、94.9%和95.9%；氨基比林結(jié)果分別為101.9%、99.8%、96.1%和95.1%。而傳統(tǒng)的滴定法對應(yīng)的巴比妥測量結(jié)果分別為102.6%、103.2%、99.1%和95.7%；氨基比林結(jié)果分別為99.4%、103.2%、100.0%和98.2%。

3 討論與小結(jié)

3.1 流動相pH值的選擇 使用0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液和乙腈作為流動相時，巴比妥和氨基比林的色譜峰重合在一起無法分離。當(dāng)用三乙胺調(diào)節(jié)pH值到8.0以上時，即可把巴比妥和氨基比林的色譜峰分離開。pH越高，得到的峰形越好，不過，普通的C18柱對pH值的耐受有限，一般應(yīng)低于8.0，最高不能超過8.5。為避免操作不當(dāng)損壞柱子，故選擇用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為8.2的0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液和乙腈作為流動相。

3.2 流動相比例的選擇 使用0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值到8.2)︰乙腈=73︰27、75︰25及 80︰20的比例運行樣品，其中，73︰27的流動相在運行低濃度樣品時，巴比妥的色譜峰會受到試劑峰或雜質(zhì)峰的干擾； 80︰20的流動相運行樣品時，氨基比林的色譜峰拖尾較嚴(yán)重，峰形較差；而 75︰25的流動相峰形良好，保留時間適當(dāng)，故選擇使用0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值到8.2)︰乙腈=75︰25 作為流動相。

3.3 色譜柱的選擇 分別采用粒徑5 μm，4.6 mm×250 mm Waters公司的Symmetry C18，Agilent公司的ZORBAX SB-C18、5TC-C18(2)，Shimadzu 公司的VP-ODS C18以及粒徑3.5 μm，4.6 mm×100 mm的Agilent公司的Eclipse plus C18色譜柱進行試驗。結(jié)果表明，普通的C18柱在弱堿性條件下均可分離復(fù)方氨基比林注射液中的兩個組分。同時，由于流動相的pH值較高，為避免堿性物質(zhì)對色譜柱造成損害，宜使用專用的色譜柱。

3.4 滴定法與液相法對檢測結(jié)果的影響及原因 復(fù)方氨基比林注射液的含量采用傳統(tǒng)的滴定方法進行測定時，所得到的巴比妥的結(jié)果略有偏高，這與檢測員判斷滴定是否到達終點有比較密切的關(guān)系。當(dāng)?shù)味ㄒ呀?jīng)到達終點時，滴定經(jīng)驗不夠豐富的檢測員一般不敢斷定為終點，而是要等到混濁比較明顯時才會終止滴定，而此時終點已過，故滴定結(jié)果一般均會略有偏高。同時，樣品中的某些雜質(zhì)如氯離子等可能也會影響對終點的判定。采用高效液相色譜法進行測量，結(jié)果更為準(zhǔn)確，因為減少了人為因素帶來的終點誤差。

3.5 試驗方法與文獻報道方法的差異 曾有文獻報道了人用藥品復(fù)方氨基比林注射液或復(fù)方氨林巴比妥注射液三組份含量測定的高效液相色譜法。但李世彩等[3]所采用的磷酸緩沖液為磷酸二氫鉀及磷酸氫二鉀混合配制而成，未使用三乙胺調(diào)節(jié)pH值；而楊錫祥等報道的方法[2]中未給出磷酸鹽緩沖液的配制方法，但使用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至8.0，使用的色譜柱長度分別為150 mm和200 mm。許潤娟等[4]使用的流動相為乙腈-0.0025 mol/L庚烷磺酸鈉-三乙胺(35︰65︰0.05，用50%醋酸調(diào)節(jié)pH到8.0)，色譜柱長度為250 mm，流速為0.6 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫為30 ℃。試驗中使用的是常用的250 mm長的色譜柱，并大膽地把pH值提高到8.2，得到的色譜峰峰形也極為理想。其次，流動相比例與文獻報道的也略有差異。雖然240 nm的檢測波長并非氨基比林及巴比妥的最佳檢測波長，但在該波長下巴比妥的色譜峰峰形尖銳，峰寬較窄，不易受到試劑峰的干擾，故也選擇240 nm作為檢測波長。

3.6 小結(jié) 采用C18柱作為固定相，0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值到8.2)∶乙腈=75∶25作為流動相，使用高效液相色譜法測定獸用復(fù)方氨基比林注射液的含量，方法專屬性強，靈敏度佳，準(zhǔn)確度高，能夠有效控制獸用復(fù)方氨基比林注射液的質(zhì)量。

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(編輯：李文平)

SimultaneousDeterminationofTwoComponentsinVeterinaryCompoundAminophenazoneInjectionbyHPLC

CHEN Xi-long, SUN Zhen-zheng, WANG Qing-hong

(GuizhouProvincialSupervisoryInstituteofVeterinaryDrugandFeeds,Guiyang550003,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.10

2017-03-02

A

1002-1280 (2017) 09-0056-06

S859.79

陳錫龍, 高級獸醫(yī)師，從事獸藥質(zhì)量檢驗檢測及相關(guān)研究工作。E-mail: cxlofyjs@163.com