徐 晗, 趙彩云, 劉勇波, 陳鵬程, 李俊生*

(1. 中國環(huán)境科學(xué)研究院, 北京 100012; 2. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176；3. 紹興出入境檢驗檢疫局, 紹興 312000)

ITS序列及其SNP位點在外來入侵雜草長芒莧、西部莧和糙果莧物種鑒定中的應(yīng)用

徐 晗1,2*, 趙彩云1, 劉勇波1, 陳鵬程3, 李俊生1*

(1. 中國環(huán)境科學(xué)研究院, 北京 100012; 2. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176；3. 紹興出入境檢驗檢疫局, 紹興 312000)

對于以種子形態(tài)為物種主要識別依據(jù)的口岸部門,外來入侵雜草長芒莧、西部莧和糙果莧一直是鑒定的難點。本文對34種莧屬植物的ITS序列和26S rDNA進行分析,通過SNP變異位點及特異性引物,借助PCR-RFLP方法,對長芒莧、西部莧與糙果莧進行快速、準(zhǔn)確的分類鑒定。ITS序列分析表明,長芒莧種內(nèi)變異小,種間變異顯著,可與其他莧屬植物明顯區(qū)分。西部莧與糙果莧之間ITS序列差異小,需依據(jù)SNP位點來區(qū)別。

ITS序列; 異株莧亞屬; 長芒莧; 西部莧; 糙果莧; 26S rDNA; SNP; PCR-RFLP

外來入侵植物長芒莧AmaranthuspalmeriWatson、西部莧A.rudisSauer和糙果莧A.tuberculatus(Moq.) Sauer隸屬莧科Amaranthaceae莧屬Amaranthus異株莧亞屬Acnida,原產(chǎn)北美,是美國大豆、玉米田的超級雜草[1-2]。近幾年隨中美兩國貿(mào)易增加,經(jīng)糧谷等貨物傳入我國風(fēng)險加大,已在我國口岸多次被截獲[3]。長芒莧、西部莧和糙果莧雌雄異株,與中國莧屬雌雄同株種類相比,容易區(qū)分。其中,長芒莧雌株具有圓錐形穗狀長花序和芒尖狀硬直苞片等明顯特征,容易識別。但西部莧和糙果莧形態(tài)相近,種間常發(fā)生雜交,一直是分類上的難題。Sauer[4-5]根據(jù)雌花花被片數(shù)目及等位酶分析將西部莧和糙果莧分開。Robertson[6]和Pratt[7]認為西部莧和糙果莧地理分布重疊,不能分為嚴格意義上的兩個種。Costea和Tardif[8]建議將二者并為一個種,將西部莧作為糙果莧的變種A.tuberculatus(Moq.) Sauer var.rudis(Sauer) Costea & Tardif。筆者對西部莧和糙果莧長期觀察研究發(fā)現(xiàn),形態(tài)學(xué)上,西部莧與糙果莧雌株可通過胞果以及葉片的特征來區(qū)分,但雄株卻難以分清。此外,莧屬種子小,僅1 mm左右,形態(tài)學(xué)分辨技術(shù)難以掌握,容易誤判[9]。因此,借助新的方法來澄清兩個物種的分類問題十分必要。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(internal transcribed spacer)位于rRNA編碼基因18S、5.8S和26S之間。通常作條形碼使用的ITS序列指ITS1、5.8S和ITS2。這些rDNA高度保守地分布在染色體的不同位置,在每個單倍染色體基因組中的拷貝數(shù)超過200個。根據(jù)保守序列中的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點設(shè)計引物進行特異性擴增比較,可用于物種鑒定。多拷貝序列26S rDNA是編碼核糖體亞基的基因,序列長度在600 bp左右。Gutell等研究表明這段區(qū)域具有較高的變異率,可以用于親緣關(guān)系較近的物種間的分類研究[10]。將ITS序列與26S rDNA相結(jié)合,可發(fā)現(xiàn)更有價值的分子標(biāo)記,進而用于種下單元鑒定。

單核苷酸多態(tài)性是指由于單個核苷酸的變異所形成的遺傳標(biāo)記,其數(shù)量多、多態(tài)性豐富、適于快速、自動化分析。SNP的檢測方法有多種,但是由于技術(shù)難度高、成本費用高,其應(yīng)用受到了阻礙。PCR-RFLP分子標(biāo)記技術(shù)又稱酶切擴增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS)標(biāo)記技術(shù),是一類以PCR為基礎(chǔ)的共顯性的分子標(biāo)記。自1993年Konieczny和Ausubel在擬南芥上發(fā)展CAPS標(biāo)記以來[11],因其具有共顯性、位點特異性、操作簡單、成本低、所需DNA樣品量少和對DNA的純度要求不高等優(yōu)點成為現(xiàn)代生物學(xué)研究的一個非常重要的分子標(biāo)記技術(shù)。在種質(zhì)鑒定、輔助育種、基因鑒定和圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域得到相當(dāng)廣泛的應(yīng)用[12-13]。

宋葆華等[14-15]曾采用RAPD方法和ITS序列對中國莧屬植物系統(tǒng)進化關(guān)系進行研究,證明除凹頭莧亞屬Albersia以及莧亞屬Amaranthus的綠穗莧A.hybridus復(fù)合群分類效果不理想之外, 運用ITS序列進行莧屬植物的分類效果較好。本文在擴充物種和樣本數(shù)量的基礎(chǔ)上,采用ITS序列及其SNP位點對長芒莧、西部莧和糙果莧三種外來入侵植物進行分類研究。本研究在莧屬植物種子分類鑒定以及西部莧和糙果莧的分類問題上具有十分重要的意義和應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為2005年至今本實驗室收集的莧屬16種(表1)21個居群的51份樣品,以及2種作為外類群的青葙Celosiaargentea和空心蓮子草Alternantheraphiloxeroides的植株和種子標(biāo)本。標(biāo)本采自國內(nèi)或來自口岸截獲的糧谷下腳料中。所有材料均通過專家復(fù)核鑒定。

表1植物材料及來源

Table1Plantmaterialsandlocation

中文名Chinesename學(xué)名Scientificname標(biāo)本來源Location標(biāo)本采集信息(號)Collectioninformation白莧Amaranthusalbus中國內(nèi)蒙古H．Xu(2012)北美莧A．blitoides中國內(nèi)蒙古H．Xu(2012)凹頭莧A．blitum中國北京H．Xu(2012)繁穗莧A．cruentus英國UKSEED脹果莧A．deflexus西班牙巴塞羅那H．Xu(2012)綠穗莧A．hybridus中國北京H．Xu(1113)長芒莧A．palmeri中國北京H．Xuetal．(2012)美國西雅圖1?8?14928阿根廷1?8?14514中國福建H．Xuetal．(2010)反枝莧A．retroflexus中國內(nèi)蒙古H．Xu(2012)刺莧A．spinosus中國福建H．Xuetal．(2010)菱葉莧A．standleyanus中國北京Z．Y．Li(11350)薄葉莧A．tenuifolius中國山東Y．T．Hou(2008)皺葉莧A．crispus中國河北H．Xuetal．(2010)莧A．tricolor中國北京H．Xu(2012)糙果莧A．tuberculatus中國福建H．Xuetal．(2010)

續(xù)表1Table1(Continued)

中文名Chinesename學(xué)名Scientificname標(biāo)本來源Location標(biāo)本采集信息(號)Collectioninformation西部莧A．rudis中國福建H．Xuetal．(2010)中國江蘇H．Xuetal．(2011)中國廣東H．R．Wu(2012)中國北京Z．X．Li(2012)皺果莧A．viridis中國北京H．Xu(2008)青葙Celosiaargentea中國北京H．Xu(2011)空心蓮子草Alternantheraphiloxeroides中國重慶Z．Y．Li(2010)

1.2 DNA提取

稱取經(jīng)硅膠干燥的植物葉片或種子100 mg置于事先加入4 mm鋼珠的2 mL EP管中,迅速放入液氮中冷凍,將EP管置于Geno/Grinder 2000 (SPEX SamplePrep)高通量研磨機上,1 000 r/min研磨1.5 min。用Tiangen植物基因組DNA提取試劑盒提取葉片總DNA。

1.3 基因擴增及測序

ITS序列通用引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTA-TTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系:25 mmol/L MgCl22 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,10×PCR緩沖液2.5 μL,2.5 μmol/L引物各1.0 μL,聚合酶1 U,總DNA 1 μL(約30 ng),滅菌水補足25 μL。擴增程序:94℃變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸90 s(進行30個循環(huán));72℃延伸10 min。

ITS616序列通用引物為347f(5′-CCCGTGA-ACCATCGAGTT-3′)和807r (5′-AACATCAGA-CCTCTTCGCAGG-3)(專利申請?zhí)?2016111851567)。PCR反應(yīng)體系25 μL:30 ng/μL模板DNA 1 μL,10 μmol/L引物各1 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL,5 U/μLTaqDNA聚合酶0.3 μL,10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL,25 mmol/L MgCl22 μL,余量為水。PCR擴增程序為:94℃ 5 min;94℃ 30 s,51℃ 60 s,72℃ 35 s,35個循環(huán);72℃ 10 min。3%瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序,擴增引物同時作為測序引物進行雙向測序。

1.4 序列分析及系統(tǒng)樹構(gòu)建

序列編輯和拼接應(yīng)用Lasergenev 7.1軟件中的SeqMan完成,用Clustal X進行序列比對。以青葙和空心蓮子草為外類群,使用MEGA 6.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析?？瘴槐惶幚頌槿笔?以鄰接法(neighbour-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)分支樹。NJ樹序列間分化程度使用Kimura雙參數(shù)遺傳距離(Kimura 2-parameter distance,K2-P)度量,每一分支的自展支持率為1 000次重復(fù)取樣的計算結(jié)果。

用于糙果莧和西部莧SNP位點分析的序列除來自本試驗樣本外,還含有GenBank中莧屬植物ITS序列,共計34種177條。對序列進行比對分析后,根據(jù)糙果莧全基因組序列的contig00002片段(GenBank編號:ACQK00000000.1ACQK01000002.1),在SNP位點下游擴展尋找合適區(qū)間,通過Primer Premier 5軟件設(shè)計特異引物,擴增易于檢測該位點的序列。并將擴增的目的片段命名為ITS616(專利申請?zhí)?2016111851567)。

1.5 PCR-RFLP酶切反應(yīng)

PCR-RFLP酶切反應(yīng)體系為20 μL:1 μg/μL模板DNA 10 μL,10×buffer 2.0 μL,StyⅠ(Eco130 Ⅰ)酶1 μL,余量為水。PCR-RFLP酶切反應(yīng)條件為:37℃水浴1 h。3%瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

以NJ法構(gòu)建的ITS序列系統(tǒng)樹將莧屬植物分為5個進化支(圖1)。其中,長芒莧與同亞屬的西部莧和糙果莧分開,與刺莧聚在一起組成clade 3。且長芒莧種內(nèi)變異小,種間變異顯著,可與其他莧明顯區(qū)分。西部莧和糙果莧以97%的自展支持率聚為clade 1,兩者雖然可以與其他莧區(qū)分,但西部莧和糙果莧之間差異小,同源性高,需借助特異性位點進一步界定。

2.2 西部莧和糙果莧的區(qū)分

在對34種莧屬植物的177條ITS基因序列進行比較后,發(fā)現(xiàn)糙果莧與西部莧以及其他莧在616位點存在穩(wěn)定的變異,糙果莧在該位點為雜合位點A(A>G),西部莧及其他莧在該位點為純合位點G(圖2)。該SNP位點與相鄰堿基組成“CCAAGG”,為StyⅠ內(nèi)切酶識別位點。酶切后,糙果莧呈現(xiàn)3條帶,依次為461、273、188 bp,其他無變異位點物種僅有461 bp一個條帶(圖3)。根據(jù)該特異性位點,可將西部莧和糙果莧相區(qū)分。

圖1 根據(jù)NJ法構(gòu)建的莧屬植物ITS序列系統(tǒng)進化樹圖Fig.1 Phylogenetic tree of Amaranthus constructed by NJ method

3 討論

ITS序列已廣泛應(yīng)用于解決科內(nèi)不同等級的系統(tǒng)發(fā)育和分類問題[16],并被Kress等人選作植物條形碼候選序列[17]。宋葆華等已對中國莧屬16個類群ITS序列進行系統(tǒng)進化關(guān)系分析,表明ITS序列在莧屬屬內(nèi)具有良好的分類價值[15]。但之前研究的種類不全,存在大量異名問題。本研究發(fā)現(xiàn),莧屬大部分植物,包括長芒莧,可以通過ITS序列相區(qū)分。但西部莧和糙果莧ITS序列的種間差異卻很小,需借助SNP位點進一步辨識。SNP標(biāo)記于1994年被首次提出,在擬南芥、水稻、馬鈴薯等植物的研究中已得到了很好的應(yīng)用[18-20]。隨著DNA條形碼技術(shù)從基因跨越到基因組時代,SNP在物種鑒定、系統(tǒng)進化等領(lǐng)域發(fā)揮了越來越多的作用[21]。這種基因上的單核苷酸多態(tài)性可輔助形態(tài)特征,對糙果莧和西部莧進行最終判定。

圖2 糙果莧ITS序列SNP位點(僅列出部分序列)Fig.2 The SNP of ITS sequences of Amaranthus tuberculatus

圖3 莧屬植物ITS 616序列酶切電泳圖Fig.3 The electropherogram of enzyme-digested products of ITS 616 sequence

通過ITS序列,將長芒莧與西部莧和糙果莧復(fù)合群與莧屬其他物種區(qū)分后,再根據(jù)SNP位點對西部莧和糙果莧進行輔助判定。形態(tài)上,西部莧雌株胞果周裂、1～2花被片、雌花花序間生有小葉、葉片黃綠或綠色并長橢圓形,與糙果莧雌株胞果不裂、無花被片、雌花花序細長無小葉、葉片深綠色并狹長橢圓形的特征相區(qū)別,但雄株間的形態(tài)卻十分接近。二者在ITS序列上有穩(wěn)定的SNP位點,且為雜合位點,而且變異位點較少。因此,綜合形態(tài)特征和ITS序列分析,建議采用Costea和Tardif[8]的分類觀點,即將西部莧作為糙果莧的變種A.tuberculatus(Moq.) Sauer var.rudis(Sauer) Costea & Tardif來處理。

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(責(zé)任編輯： 楊明麗)

TaxonomiccircumscriptionofAmaranthuspalmeri,A.rudisandA.tuberculatus(Amaranthaceae)basedonITSsequencesandSNPanalysis

Xu Han1,2, Zhao Caiyun1, Liu Yongbo1, Chen Pengcheng3, Li Junsheng1

(1.ChineseAcademyofEnvironmentalSciences,Beijing100012,China;2.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100176,China;3.ShaoxingEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Zhejiang312000,China)

Alien invasive weedsAmaranthuspalmeri,A.rudisandA.tuberculatusare difficult to distinguish from each other, and taxonomical identification only depends on seed morphologies. In this study,A.palmeri,A.rudisandA.tuberculatuscould be identified quickly and precisely through PCR-RFLP method, based on ITS and 26S rDNA analyses, and specific primers designed by SNP. The results show that there is no intraspecific variation withinA.palmeripopulations, but interspecific variation is significant.A.palmerican be differentiated from other congeneric species by ITS.However, differences of ITS sequences betweenA.rudisandA.tuberculatusare small, they should be defined further by SNP analysis.

ITS; subgen.Acnida;Amaranthuspalmeri;Amaranthusrudis;Amaranthustuberculatus; 26S rDNA; SNP; PCR-RFLP

實驗方法與技術(shù)ExperimentalMethod&Technology

S 451; S41-30

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.021

2016-12-13

： 2017-01-30

國家重點研發(fā)計劃(2016YFC1201105);中國檢驗檢疫科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費項目(2014JK010, 2017JK038)

致謝： 向為本研究提供試驗材料和熱心幫助的舟山出入境檢驗檢疫局李筱筱老師、泉州出入境檢驗檢疫局曾思海老師、廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心吳海榮老師致以衷心的感謝！

* 通信作者 E-mail: lijsh@craes.org.cn;xuhanin@gmail.com