楊星星, 崔迎雪, 武凌宇, 王亞囡, 劉遠平, 李鈺金, 魏玉西

?

一種新型功能性海帶豆醬的制備工藝研究

楊星星1, 崔迎雪1, 武凌宇1, 王亞囡1, 劉遠平2, 李鈺金2, 魏玉西1

(1. 青島大學生命科學學院, 山東青島 266071; 2. 榮成泰祥食品股份有限公司, 山東榮成264309)

為了探究一種新型納豆菌發(fā)酵食品的最佳工藝, 利用納豆菌發(fā)酵大豆和海帶, 以發(fā)酵物中游離氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活性為評價指標, 通過單因素試驗和正交試驗確定最佳發(fā)酵條件。結果表明, 發(fā)酵溫度42℃、發(fā)酵時間54 h、接種量1%、料水比(/)1︰4、配料比(大豆︰海帶) 2︰1時發(fā)酵產物中游離氨基酸態(tài)氮含量最高(0.041%); 發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時間48 h、接種量3%、料水比(/) 1︰2, 配料比(大豆︰海帶) 3︰1時發(fā)酵產物中納豆激酶活性最高(可達1426.53IU/g)。

海帶; 大豆; 納豆菌; 發(fā)酵; 游離氨基酸態(tài)氮; 納豆激酶活性

納豆作為一種最早起源于中國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品, 系由納豆菌發(fā)酵大豆制得, 在日本已有2000年的食用歷史[1-2]。納豆菌()屬細菌科、芽孢桿菌屬, 具有耐酸、耐堿、耐100℃高溫及耐擠壓的特性, 在胃部酸性環(huán)境中仍能保持其穩(wěn)定性[3]。由于納豆菌能分解蛋白質、碳水化合物、脂肪等大分子物質, 使納豆菌發(fā)酵產品中富含氨基酸、寡聚糖等多種易被人體吸收利用的營養(yǎng)成分[4]。同時, 納豆制品中還含豐富的納豆激酶, 具有溶血栓、降血壓、抗腫瘤、抗氧化性等作用[5-6]。因此, 納豆制品是一類很好的功能性食品。

海帶(Aresch)又名昆布, 屬于褐藻門(Phaeophyta)海帶目(Laminarales)海帶科(Laminariaceae)海帶屬(), 因其富含褐藻多糖、褐藻多酚以及碘等人體需宜營養(yǎng)成分, 具有抗癌、防癌、降三高、補鈣、提高免疫力、皮膚祛皺增白等功效, 還是低脂肪、低熱量的保健食品[7]。但是, 由于海帶中的褐藻糖膠、褐藻淀粉及海藻酸鹽等多糖不易被腸道消化, 大大限制了海帶的利用領域。

如果將納豆與海帶搭配作為納豆菌發(fā)酵原料, 一方面, 海帶為納豆菌的生長提供了充分的碳源, 另一方面, 納豆菌的發(fā)酵過程可以將海帶中褐藻膠進行降解, 可進一步提高海帶的利用率。所獲得的發(fā)酵產物, 不僅保留傳統(tǒng)納豆制品與海帶原有的營養(yǎng)價值及藥用價值, 而且有利于人體對海帶的吸收[8], 兩者之間作用互補, 堪稱黃金搭檔。中國是農業(yè)大國, 海帶與大豆資源豐富且價格低廉, 二者搭配制成的功能性食品適合中國的大眾消費。目前, 國內外尚未見納豆菌發(fā)酵海帶和黃豆制備功能性食品的報道。

本文以大豆和海帶為納豆菌發(fā)酵的原料, 探究使發(fā)酵產品中游離氨基酸態(tài)氮和納豆激酶含量最高的功能性海帶豆醬的生產工藝。研究結果可為大豆和海帶的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆市售優(yōu)質大豆, 新鮮飽滿顆粒完整; 海帶市售新鮮海帶; 納豆芽孢桿菌()菌粉, 購于北京川秀貿易國際有限公司。

1.2 儀器與設備

HC-2518高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司; HH4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司; 721G可見分光光度計 上海精密儀器有限公司; 88-1型定時恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器公司; Sartorius PB-10 pH計賽多利斯科學儀器(北京)有限公司; 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海-恒科學儀器有限公司; 電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.3 工藝流程

1.4 方法

1.4.1 原料處理

大豆, 選取顆粒飽滿完整的大豆浸泡12 h后用攪碎機打碎; 海帶, 選取新鮮的海帶洗凈后放入烘干箱中烘干、粉碎, 過60目篩, 海帶粉備用。

1.4.2 游離氨基酸態(tài)氮(free ammonia nitrogen, FAN)含量的測定

參照文獻[9]進行, 游離氨基酸態(tài)氮含量計算如下:

其中,: 氫氧化鈉標準溶液的濃度(mol/L);: 被測樣品的質量(g);1: 滴定消耗的NaOH標準溶液消耗的體積(mL);2: 空白試驗消耗的NaOH標準溶液消耗的體積(mL);: 稀釋倍數。

1.4.3 納豆激酶(natto kinase, NK)活性的測定

采用Folin-酚法[10-14]進行, 酶活力計算公式如下:

其中,樣: 樣品液的光吸收值OD680nm;對: 對照液的光吸收值OD680nm;: 標準曲線上光吸收為1時的酪氨酸的質量(mg): 酶促反應體系的總體積(mL);: 酶促反應的時間(min);: 粗酶液的稀釋倍數。

1.4.4 單因素試驗

發(fā)酵后置于冰箱后熟24 h, 分別用Folin-酚法、甲醛滴定法測定發(fā)酵物中納豆激酶活性及游離氨基酸態(tài)氮含量, 以此評價發(fā)酵效果并確定單因素試驗水平。各因素試驗及后續(xù)正交試驗均做三組平行試驗, 結果取其平均值。

1.4.4.1 接種量的選擇

取5 g大豆(打碎后的顆粒狀, 下同)、2.5 g海帶粉(干粉末, 下同), 22.5 mL水, 121℃滅菌20 min, 分別接入質量分數為1%、2%、3%、4%、5%的納豆菌粉, 放入42℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。

1.4.4.2 料水比(大豆、海帶總質量與水的質量的比例)的選擇

取5 g大豆、2.5 g海帶粉, 分別加水15 mL(1︰2)、22.5 mL(1︰3)、30 mL(1︰4)、37.5 mL(1︰5), 121℃滅菌20 min, 接入質量分數為2%的納豆菌粉, 放入42℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。

1.4.4.3 發(fā)酵時間的選擇

取5 g大豆、2.5 g海帶粉, 22.5 mL水, 121℃滅菌20 min, 接入質量分數為2%的納豆菌粉, 放入42℃的恒溫培養(yǎng)箱中分別發(fā)酵24、36、42、48、54、60 h。

1.4.4.4 配料比(大豆和海帶質量的比例)的選擇

取編號分別為1、2、3、4、5的5個錐形瓶, 1號瓶中加入5 g大豆、10 g海帶粉(1︰2); 2號瓶中加入5 g大豆、15 g海帶粉(1︰3); 3號瓶中加入5 g大豆、2.5 g海帶粉(2︰1); 4號瓶中加入5 g大豆、1.67 g海帶粉(3︰1); 5號瓶中加入5 g大豆、5g海帶粉(1︰1)。以料水比1︰3, 分別加水45、60、22.5、20.1、30 mL, 121℃滅菌20 min, 接入質量分數為2%的納豆菌粉, 放入42℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。

1.4.4.5 發(fā)酵溫度的選擇

取5 g大豆、2.5 g海帶粉, 22.5 mL水, 121℃滅菌20 min, 接入質量分數為2%的納豆菌粉, 分別放入38、40、42、44、46℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。

1.4.5 正交試驗方案設計

根據上述單因素試驗結果, 按照L18(37)方案設計正交試驗。

1.5 數據處理

本試驗數據采用SPSS 19.0軟件分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 接種量的選擇

接種量是影響發(fā)酵的主要因素之一。一般來說, 采用大的接種量會縮短發(fā)酵時間, 同時也會減少雜菌的污染。但是, 由于納豆菌是需氧菌, 接種量過大不但會造成菌種浪費、生產成本增加, 也會引起溶氧不足影響菌體生長和產物的合成。而且, 菌種繁殖過快, 也會造成菌體生長的營養(yǎng)物質不足, 產生的游離氨基酸可能被菌體重新利用, 從而導致游離氨基酸態(tài)氮含量降低[15-16]。本試驗研究了不同接種量對發(fā)酵大豆和海帶的影響, 分別取樣測定了納豆激酶活力和游離氨基酸態(tài)氮含量, 納豆激酶活力和游離氨基酸態(tài)氮含量隨接種量不同而變化的趨勢見圖1。

從圖1中可知, 48 h發(fā)酵時間內, 游離氨基酸態(tài)氮含量在接種量為2%時達到峰值(0.025%), 當接種量超過2%時, 游離氨基酸態(tài)氮含量逐漸降低; 納豆激酶活力和游離氨基酸態(tài)氮的變化趨勢基本一致, 在接種量為2%時達到峰值(332.12 IU)。

2.1.2 料水比的選擇

料水比也是影響發(fā)酵的主要因素之一。本試驗研究了不同的料水比對發(fā)酵大豆和海帶的影響。各樣品中游離氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活力變化趨勢如圖2所示。

從圖2可以看出, 當料水比為1︰3時游離氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活力達到峰值, 分別為0.038%和404.27IU; 此后, 游離氨基酸態(tài)氮含量與納豆激酶活力逐漸降低。

2.1.3 發(fā)酵時間的選擇

發(fā)酵時間是控制發(fā)酵效果的又一主要因素。一般來說, 發(fā)酵時間過長, 可能導致菌體死亡、自溶, 對發(fā)酵產物可能產生不良影響; 發(fā)酵時間過短, 則可能導致發(fā)酵不完全, 產品品質低下, 增加產品生產成本[17]。本試驗研究了不同發(fā)酵時間對發(fā)酵產物的影響, 分別取樣測定了游離氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活力, 其變化趨勢如圖3所示。

在60 h發(fā)酵時間內, 游離氨基酸態(tài)氮含量先呈上升趨勢并在48 h達到峰值(0.036%), 之后隨發(fā)酵時間延長其含量逐漸降低。同時, 納豆激酶活力也在48 h時達到峰值(為404.27IU)。

2.1.4 配料比的選擇

與大豆相比, 海帶中蛋白質含量較低, 但含有大量活性海藻多糖等活性成分, 可為納豆菌生長提供碳源。碳源按照利用快慢又分為迅速利用的碳源和緩慢利用的碳源。前者能夠較快速地參與代謝, 提供菌體生長所需要的能量, 因此有利于菌體生長, 但是碳源代謝產生的某些分解產物有可能對某些發(fā)酵產物的合成產生阻遏作用; 緩慢利用的碳源, 被菌體緩慢利用, 有利于延長代謝產物的合成。因此, 一方面大豆與海帶搭配給納豆菌提供了新型碳源, 另一方面二者的配比對發(fā)酵效果可能會有影響。本試驗研究了不同配料比對游離氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活力的影響, 游離氨基酸態(tài)氮和納豆激酶活力的變化趨勢如圖4所示。

由圖4可見, 當大豆與海帶的比例為3︰1時, 游離氨基酸態(tài)氮含量達到峰值(0.032%), 納豆激酶活力也達到峰值(745.24IU)。

2.1.5 發(fā)酵溫度的選擇

納豆菌雖然對環(huán)境適應性較強, 但不同的溫度對納豆菌的生長繁殖都有不同的影響[18]。本試驗研究了不同的溫度對游離氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活力的影響, 各樣品中游離氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活力的變化趨勢如圖5。

由圖5可見, 隨溫度升高, 游離氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活力均呈上升趨勢, 在42℃時兩者同時達到峰值, 游離氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活力的峰值分別為0.032%和758.30IU。42℃之后隨溫度升高, 發(fā)酵物中游離氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活力均逐漸下降。推測這是因為高溫使得納豆菌發(fā)酵過程中酶部分失活, 影響發(fā)酵效果。

2.2 正交試驗結果

在上述單因素篩選基礎上, 確定的因素與水平排列表見表1。

2.2.1 以納豆激酶活力為評價指標

正交試驗方案與結果見表2。根據極差結果R分析可知,>>>>, 即發(fā)酵溫度對發(fā)酵產物中納豆激酶活力的影響最大, 其次依次為發(fā)酵時間、接種量、料水比、配料比, 根據均值結果1、2、3, 分析可知, 最優(yōu)組合為32113, 因此納豆菌發(fā)酵大豆和海帶產高活力納豆激酶的最適宜條件為: 發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時間48 h、接種量3%、料水比1︰2, 大豆與海帶配料比3︰1。按此最佳工藝制備的功能性海帶豆醬中, 納豆激酶活力為1426.53IU/g。

表1 因素與水平排列表

表2 以納豆激酶活力為評價指標的正交試驗方案及結果

續(xù)表

2.2.2 以游離氨基酸態(tài)氮含量為評價指標

正交試驗方案與結果見表3, 根據極差R分析可知,>>>=, 發(fā)酵溫度對游離氨基酸態(tài)氮含量的影響最大, 其余影響因子的影響順序依次為接種量、配料比、發(fā)酵時間和料水比; 根據均值結果1、2、3分析可知, 最優(yōu)方案為13132, 因此納豆菌發(fā)酵大豆和海帶產生游離氨基酸態(tài)氮含量的最優(yōu)方案為: 發(fā)酵溫度44℃、發(fā)酵時間54 h、接種量1%、料水比1︰4、配料比2︰1。按此最佳工藝制備的功能性海帶豆醬中, 游離氨基酸態(tài)氮的含量0.041%。

因此, 最高納豆激酶酶活的發(fā)酵條件與最高游離氨基酸態(tài)氮的發(fā)酵條件并不完全一致, 實際生產時可根據對產品鮮度或納豆激酶活性的需要靈活選用發(fā)酵條件。如優(yōu)先考慮功能, 則選前者; 如優(yōu)先考慮風味, 則選后者。

表3 以游離氨基酸態(tài)氮含量為評價指標的正交試驗方案及結果

3 結論

納豆作為一種傳統(tǒng)的功能性食品, 深受消費者喜愛。本文在其原有營養(yǎng)價值和保健功效的基礎上, 嘗試在大豆中加入營養(yǎng)和醫(yī)用價值豐富的海帶共同作為發(fā)酵原料, 制作一種新型的功能性海帶豆醬。正交試驗結果顯示: 以納豆激酶為評價指標的最優(yōu)發(fā)酵條件為: 發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時間48 h、接種量3%、料水比1︰2, 大豆與海帶配料比3︰1, 按此最佳工藝制備的功能性海帶豆醬中, 納豆激酶活力為1426.53IU/g; 以游離氨基酸態(tài)氮含量為評價指標的最優(yōu)發(fā)酵條件為: 發(fā)酵溫度44℃、發(fā)酵時間54 h、接種量1%、料水比1︰4、配料比2︰1, 按此最佳工藝制備的功能性海帶豆醬中, 游離氨基酸態(tài)氮的含量0.041%。

本文確定了納豆菌發(fā)酵大豆和海帶的最佳工藝條件, 產品既保留了納豆食品原有的功效, 又增加了海帶的營養(yǎng)和活性成分。

[1] Sumi H. Antibacterial activity of— growth inhibition againstO-157 [J].Bioindustry, 1997, 14: 47-50.

[2] Sumi H. Accumulation of vitamin K (menaquione·7) in plasma after indigestion of natto and natto bacilli ()[J]. Food Science and Technology Research, 1999, 5(1): 48-50.

[3] Garrity G M.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology[M]. 2nd ed.Vol 1. New York: John Wiley & Sons, Inc., 2002.

[4] Esaki H, Onozaki H, Osawa T. Antioxidative activity of fermented soybean products [M]. Washington D C: American Chemical Society, 1994: 353-360.

[5] 王麗娜.納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 中國調味品, 2014, 39(9): 28-30. Wang Lina. Optimization of liquid fermentation conditions of[J].China Condiment, 2014, 39(9): 28-30.

[6] Murooka Y, Yamshita M. Traditional healthful fermented products of Japan[J]. J Ind Microbiol, 2008, 35(8): 791-798.

[7] 姚海芹, 王飛久, 劉福利, 等. 食用海帶品系營養(yǎng)成分分析與評價[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 95-98.Yao Haiqin, Wang Feijiu, Liu Fuli, et al. Chemical analysis and nutritional assessment of new varieties of[J]. Food Science, 2016, 37(12): 95-98.

[8] 仇哲, 孫躍春, 吳海歌. 酶解海帶產物的營養(yǎng)成分分析[J]. 黑龍江八一農墾大學學報, 2016, 02: 60-63, 69.Qiu Zhe, Sun Yuechun, Wu Haige.Nutritional components analysis of degradedby sodium alginate lyase[J]. Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University, 2016, 02: 60-63, 69.

[9] 王永華, 張水華. 食品分析[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2002: 139-140. Wang Yonghua, Zhang Shuihua. Food Analysis[M]. Beijing: China Light Industry Press, 2002: 139-140.

[10] 張岸平, 李會榮, 呂偉, 等. 納豆激酶液體發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 河北師范大學學報(自然科學版), 2011, 35(6): 615-620. Zhang Anping, Li Huirong, Lv Wei, et al. Nattokinaes liquid fermentation condition optimizes[J]. Journal of Hebei Normal University (Natural Science Edition), 2011, 35(6): 615-620.

[11] 胡靜, 納豆激酶的活性測定[J], 海峽藥學, 2013, 25(5): 47-48.Hu Jing, Detection of nattokinase activity [J].Strait Pharmaceutical Journal, 2013, 25(5): 47-48.

[12] Fujita M, Nomura K, Hong K, et al. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan [J]. Biochem Biophy Res Cbmmun, 1993, 197(3): 1340-1347.

[13] 陳曉飛, 周伏忠, 陳國參, 等. 納豆激酶酶學性質研究[J]. 河南科學, 2010, 28(1): 41-43. Chen Xiaofei, Zhou Fuzhong, Chen Guocan, et al. Characterization of nattokinase[J]. Henan Science, 2010, 28(1): 41-43.

[14] 趙正濤, 李全陽, 趙紅玲, 等. 酪蛋白在不同pH值下特性的研究[J]. 乳業(yè)科學與技術, 2009, 01: 26-29. Zhao Zhengtao, Li Quanyang, Zhao Hongling, et al. Research on the characteristic of caseins at different pH[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2009, 01: 26-29.

[15] 王文秀, 于佳, 李釤, 等. 不同條件對納豆菌發(fā)酵蛤蜊產物中游離氨基酸態(tài)氮含量及納豆激酶活性的影響[J]. 食品科學, 2015, 36(9): 113-116. Wang Wenxiu, Yu Jia, Li Shan, et al. Effects of different conditions on free amino nitrogen content and nattokinase activity in-fermented clam[J]. Food Science, 2015, 36(9): 113-116.

[16] Kubo Y, Inaka T, Hachiya T, et al. Development of a rifampicin-resistantstrain for natto fermentation showing enhanced exoenzyme production[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2013, 115(6): 654-657.

[17] 王剛. 納豆激酶的固體發(fā)酵、分離純化及應用研究[D]. 長春: 吉林農業(yè)大學, 2005. Wang gang. The solid ferment seperation and application of nattokinase[D]. Changchun: Jilin Agriculture University, 2005.

[18] 黃婷, 劉良忠, 曹宇翔, 等. 納豆固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].中國釀造, 2016, 35(1): 141-144.Huang Ting, Liu Liangzhong, Cao Yuxiang, et al. Optimization of solid-state fermentation technology of natto[J]. China Brewing, 2016, 35(1): 141-144.

Study on the optimal fermentation technology for a new type of bean sauce with kelp using

YANG Xing-xing1, CUI Ying-xue1, WU Ling-yu1, WANG Ya-nan1, LIU Yuan-ping2, LI Yu-jin2, WEI Yu-xi1

(1. College of Life Sciences, Qingdao University, Qingdao 266071, China; 2. Rongcheng Taixiang Food Co. Ltd., Rongcheng 264309, China)

This study investigated the optimal fermentation technology for a new type of food using. [Method] After fermentation of kelp and soybean by, the concentration of freeamino nitrogen and nattokinase activity were determined, and then the optimum conditions were confirmed by single factor analysis and orthogonal test. [Result] The maximum concentration of free amino nitrogen reached 0.041% when the fermentation was performed at 44℃ for 54 h with an inoculation amount of 1%, a solid-to-water ratio of 1︰4 (/), and a mixing ratio of 2︰1. Meanwhile, the maximum activity of nattokinase reached 1426.53 IU/g after 48 h of fermentation at 40℃ with an inoculation amount of 3%, a solid-to-water ratio of 1︰2 (/), and a mixing ratio of 3︰1.

kelp; soybean sauce;; fermentation; freeamino nitrogen; nattokinase activity

(本文編輯: 康亦兼)

Jan. 10, 2017

[This study was financially supported by Shandong province key R & D projects (Key technologies)(No.2016ZDJS06A01)]

TS254

A

1000-3096(2017)06-0048-07

10.11759/hykx20170110001

2017-01-10;

2017-03-19

山東省重點研發(fā)計劃(重大關鍵技術)(2016ZDJS06A01)

楊星星(1994-), 男, 甘肅慶陽人, 本科生, 研究方向: 食品科學與工程專業(yè), 電話: 18363997324, E-mail: 1490494577@qq.com; 魏玉西(1964-), 通信作者, 教授, 博士, 研究方向: 海洋生物資源高值化利用, 電話: 0532-85953227, E-mail: yuxiw729@163.com; 李鈺金(1966-), 通信作者, 研究員, 研究方向: 水產食品加工, E-mail: r.lyj@163.com