肖艷平，付久園，王哲，葛永梅，裴美麗

(1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2獻縣人民醫(yī)院；3寬城縣醫(yī)院)

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對人滋養(yǎng)層細胞增殖和侵襲的影響及其機制

肖艷平1，付久園1，王哲2，葛永梅1，裴美麗3

(1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2獻縣人民醫(yī)院；3寬城縣醫(yī)院)

目的探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對人滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo增殖和侵襲的影響，并探討其可能的作用機制。方法將HTR-8/Svneo細胞分成A、B、C組，A組加入1 mL/L DMSO，B組加入5×10-8g/mL的BDNF，C組加入0.1 μmol/L的BDNF絡氨酸激酶受體TrkB特異性抑制劑K252a，24 h后轉(zhuǎn)板繼續(xù)培養(yǎng)。采用CCK8法觀察3組細胞繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48及72 h時的細胞增殖能力(以O(shè)D450表示)，采用Transwell實驗觀察3組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h時的侵襲能力(以穿膜細胞數(shù)表示)，采用Western blotting法檢測3組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h時磷酸化TrkB(p-TrkB)和PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)。結(jié)果繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h時B組細胞OD450均高于A組(P均<0.05)，C組細胞OD450均低于A組(P均<0.05)。A、B、C組穿膜細胞數(shù)分別為(42±4)、(87±6)、(29±3)個。B組細胞穿膜細胞數(shù)多于A組(P<0.05)，C組細胞穿膜細胞數(shù)少于A組(P均<0.05)。與A組相比，B組細胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR蛋白表達量均升高(P均<0.05)，C細胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR表達量均降低(P均<0.05)。結(jié)論BDNF可以增強人滋養(yǎng)層細胞HTR-8/Svneo增殖和侵襲能力，其機制可能與其活化PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；人滋養(yǎng)層細胞；細胞增殖；細胞侵襲

妊娠期間胎盤的成功形成和維持依靠對滋養(yǎng)層細胞增殖和侵襲能力的嚴格調(diào)控[1]。滋養(yǎng)層細胞能夠?qū)⑻汉湍阁w組織分隔開并充當兩者物質(zhì)交換的通道，為胎盤提供物理支撐的同時可保護胎兒免受母體免疫排斥反應的傷害[2，3]。胎盤滋養(yǎng)層細胞的功能異常會引起多種妊娠疾病的發(fā)生，嚴重威脅母嬰的健康。研究表明，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)與其受體酪氨酸激酶受體B(TrkB)在神經(jīng)系統(tǒng)等多個領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[4，5]，但目前有關(guān)其對滋養(yǎng)層細胞增殖和侵襲能力影響的研究少見。本研究以人源妊娠滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo為研究對象，探討B(tài)DNF對HTR-8/SVneo細胞增殖和侵襲的影響，并探討相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)液購自HYCLONE公司，血清購自Gibco公司，胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素、二甲基亞砜(DMSO)、0.25%胰酶消化液、CCK-8試劑、RIPA裂解液購自北京索萊寶公司，BDNF購自ProSpec公司，TrkB的特異性抑制劑K252a購自MCE公司，兔抗人磷酸化TrkB(p-TrkB)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)一抗及HRP標記的二抗均購自Proteintech公司，Matrigel膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Millipore公司。細胞培養(yǎng)耗材購自美國Eppendorf公司。HTR-8/SVneo細胞為本科室保存。

1.2 細胞分組及BDNF應用 HTR-8/SVneo細胞使用RPMI-1640培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)(血清濃度為10%，青霉素100 U/mL，鏈霉素0.1 g/L)，待細胞進入對數(shù)生長期時，制備單細胞懸液，種植到6孔板，將細胞分成A、B、C組，A組加入1 mL/L DMSO，B組加入5×10-8g/mL的BDNF，C組加入0.1 μmol/L的BDNF絡氨酸激酶受體TrkB特異性抑制劑K252a，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。

1.3 三組細胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。3組細胞處理24 h后，制備細胞懸液并計數(shù)，取100 μL細胞懸液，以每孔1 000個細胞的標準種到96孔板中進行常規(guī)培養(yǎng)，分別在第0、24、48、72 h檢測一次細胞活力。每次檢測前每孔加10 μL CCK8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，使用酶標儀用450 nm激發(fā)光檢測光密度值(OD450)，實驗重復3次。

1.4 三組細胞侵襲能力觀察 采用Transwell法。將Matrigel膠100 μL加至24孔板的Transwell上室，37 ℃放置4 h。吸掉小室中的液體，上下室分別加入100、600 μL無血清培養(yǎng)液，37 ℃放置30 min后吸去培養(yǎng)基。將處理24 h后的3組細胞制備細胞懸液各100 μL加至上室，使細胞數(shù)為1×104個，下室加入600 μL的含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液。進行常規(guī)培養(yǎng)24 h后，擦掉上室中的細胞和基質(zhì)膠，清洗上下室，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，切下基底膜觀察，拍照，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.5 三組細胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR檢測 采用Western blotting法。收集3組細胞，加RIPA裂解液(加蛋白酶抑制劑)裂解提取蛋白，BCA法測定濃度后，95 ℃加熱5 min。垂直電泳槽內(nèi)每孔內(nèi)加入約20 μg蛋白，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，兔抗人p-TrkB、p-Akt和p-mTOR一抗4 ℃孵育過夜，HRP標記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后加ECL顯色。以β-tubulin為內(nèi)參照。采用Image J v1.48中文版軟件分析圖像，以目的蛋白條帶灰度/β-tubulin條帶灰度比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 三組細胞OD450比較 繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h三組細胞OD450見表1。繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h時B組細胞OD450均高于A組(P均<0.05)，C組細胞OD450均低于A組(P均<0.05)。

表1 不同時點三組細胞OD450值比較

注：與A組比較，aP<0.05。

2.2 三組穿膜細胞數(shù)比較 A、B、C組穿膜細胞數(shù)分別為(42±4)、(87±6)、(29±3)個。B組細胞穿膜細胞數(shù)多于A組(P<0.05)，C組細胞穿膜細胞數(shù)少于A組(P均<0.05)。

2.3 三組細胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR比較 三組細胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR表達量見表2。與A組相比，B組細胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR蛋白表達量均升高(P均<0.05)，C細胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR表達量均降低(P均<0.05)。

表2 組細胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR比較

注：與A組比較，aP<0.05。

3 討論

BDNF是一種腦源性生長因子，主要由神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞分泌，在腦組織中廣泛分布，在維持早期胚胎神經(jīng)元的生長、分化和脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)分發(fā)育中發(fā)揮重要作用。TrkB是BDNF的特異性受體，由一條單跨膜肽鏈組成。當TrkB與BDNF結(jié)合后，TrkB自身發(fā)生磷酸化，活化的TrkB能夠繼續(xù)向下傳導信號，激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸脂酶C-γ(PLC-γ)信號通路，進而影響細胞的各項功能[6，7]。目前，BDNF/TrkB信號通路的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)[8]。近年來在其他組織的細胞中也廣泛發(fā)現(xiàn)了BDNF的表達，BDNF/TrkB信號通路也越來越多地被引入到其他領(lǐng)域的研究[9-10]，但目前尚少見BDNF對滋養(yǎng)層細胞影響的研究。

穩(wěn)定的HTR-8/SVneo細胞系模型的建立可為妊娠早期滋養(yǎng)層細胞分化的細胞生物學研究提供一個可靠有效的模型。HTR-8/SVneo細胞的生理功能與早孕絨毛層細胞基本一致，故被廣泛應用。本研究以HTR-8/SVneo細胞系為實驗對象，結(jié)果顯示，與A組相比，外源性BDNF對滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo細胞的增殖和侵襲能力有顯著的促進作用，而用特異性TrkB抑制劑K252a切斷BDNF/TrkB信號通路后，HTR-8/SVneo細胞的增殖和侵襲能力皆被抑制，提示BDNF/TrkB信號通路參與影響了滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo的增殖和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，BDNF處理后細胞TrkB的磷酸化水平增加，而抑制劑K252a處理后，TrkB的磷酸化水平受到抑制，表明人為的刺激可以成功控制BDNF/TrkB信號通路的活化。PI3K/Akt/mTOR信號通路是影響細胞增殖、侵襲和凋亡等生理活動的關(guān)鍵信號通路之一。本研究通過進一步對PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達進行了檢測，結(jié)果表明經(jīng)BDNF處理上調(diào)p-TrkB的水平后，p-Akt和p-mTOR的表達水平也相應上調(diào)。故推測在滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo中，BDNF可能是通過影響PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化來實現(xiàn)對滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo功能的影響。

綜上所述，外源添加BDNF可通過影響PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化增加滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo的增殖和侵襲能力，這將有助于后續(xù)對滋養(yǎng)層細胞相關(guān)疾病發(fā)病機制的研究。

[1] Redman CW，Sargent IL. Latest advances in understanding preeclampsia[J]. Science，2005，308(5728)：1592-1594.

[2] Albekairi NA，Alenazy S，Ali S，et al. Transport of digoxin-loaded polymeric nanoparticles across BeWo cells, an in vitro model of human placental trophoblast[J]. Ther Deliv，2015，6(12)：1325-1334.

[3] Anupa G，Bhat MA，Srivastava AK，et al. Cationic antimicrobial peptide, magainin down-regulates secretion of pro-inflammatory cytokines by early placental cytotrophoblasts[J]. Reprod Biol Endocrinol，2015，13(1)：121.

[4] Pandya CD，Kutiyanawalla A，Pillai A. BDNF-TrkB signaling and neuroprotection in schizophrenia[J]. Asian J Psychiatr，2013，6(1)：22.

[5] Feng N，Huke S，Zhu G，et al. Constitutive BDNF/TrkB signaling is required for normal cardiac contraction and relaxation[J]. Proc Nati Acad Sci USA，2015，112(6)：1880.

[6] Luo L，Liu X L，Li J，et al. Macranthol promotes hippocampal neuronal proliferation in mice via BDNF-TrkB-PI3K/Akt signaling pathway[J]. Eur J Pharmacol，2015，76(2)：357-363.

[7] Min SK，Lee WS，Jeong J，et al. Induction of metastatic potential by TrkB via activation of IL6/JAK2/STAT3 and PI3K/AKT signaling in breast cancer[J]. Oncotarget，2015，6(37)：40158-40171.

[8] Liu WX，Wang J，Xie ZM，et al. Regulation of glutamate transporter 1 via BDNF-TrkB signaling plays a role in the anti-apoptotic and antidepressant effects of ketamine in chronic unpredictable stress model of depression[J]. Psychopharmacology，2016，233(3)：405-415.

[9] Colle R，Deflesselle E，Martin S，et al. BDNF/TRKB/P75NTR polymorphisms and their consequences on antidepressant efficacy in depressed patients[J]. Pharmacogenomics，2015，16(9)：997-1013.

[10] Thomaz A，Jaeger M，Buendia M，et al. BDNF/TrkB signaling as a potential novel target in pediatric brain tumors: anticancer activity of selective TrkB inhibition in medulloblastoma cells [J]. J Mol Neurosci，2016，59(3)：326-333.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.010

R329.25；R714.12

A

1002-266X(2017)35-0033-03

2017-03-22)