勾俊潔，賀斌，徐祥波，武斌，石翠格，張樹成，王介東＊

（1．北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2．國家人口計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081）

妊娠過程中，胎盤絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞在囊胚著床后便開始分化遷移，向子宮蛻膜層和肌層血管侵襲，啟動螺旋動脈的重塑過程，這一過程是建立母胎循環(huán)的關(guān)鍵。絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞具有的侵襲功能是保證子宮螺旋動脈重塑和妊娠順利完成的重要基礎(chǔ)。如果絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移及侵襲功能出現(xiàn)異常，侵入到母體組織不夠深或不完全，即胎盤著床過淺，會造成血管重塑不足而致胎盤血液灌注出現(xiàn)障礙，容易引起先兆子癇、流產(chǎn)、胎兒生長受限等妊娠性疾病［1－3］。深入了解絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的調(diào)節(jié)機(jī)制將有助于闡明這些妊娠相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制。

兔、嚙齒類和靈長類動物的胎盤同屬于血絨毛型胎盤。除了靈長類動物和人，兔和大鼠均具有子宮螺旋動脈?；蚪M學(xué)數(shù)據(jù)顯示，兔在生殖方面比嚙齒類更近似于人類［4］，而且腎素－血管緊張素系統(tǒng)和血液動力變化系統(tǒng)的基因關(guān)系圖顯示，兔是研究母體血壓及胎盤灌注合適的模型動物［5－6］。細(xì)胞角蛋白（CK）在上皮樣細(xì)胞中表達(dá)，滋養(yǎng)層細(xì)胞是獨(dú)特的上皮細(xì)胞［7］。Blaschitz等［8］在人類妊娠早期胎盤中的試驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞角蛋白7（CK7）能夠特異性標(biāo)記滋養(yǎng)層細(xì)胞及其亞群。Maldonado-Estrada等［9］用CK7作為第一選擇標(biāo)記，用以監(jiān)測純化的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的純度，將CK7視為是滋養(yǎng)層分離的廣泛使用的標(biāo)記。本文中我們利用CK7免疫組化方法探討兔妊娠早中期滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤子宮的深度及侵潤方式，以期為胚胎著床及子宮螺旋動脈重塑的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

1．實(shí)驗(yàn)動物：6～7月齡新西蘭兔（購自北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司），體重3．5～3．9kg。環(huán)境溫度20～22℃，相對濕度70%～85%，每日光照12h，單籠單只飼養(yǎng)，自由攝食進(jìn)水。

2．主要試劑：小鼠抗人細(xì)胞角蛋白7（CK7）抗體、PV6002二抗試劑盒、AP-Red kit試劑盒、辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3．實(shí)驗(yàn)儀器：Leica LMD6000激光顯微捕獲儀（德國）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．取材：發(fā)情期雌兔于晚上8：00～10：00進(jìn)行交配，觀察陰道涂片確定交配成功與否，交配成功的次日上午記為妊娠第0．5天。交配前一天開始每天進(jìn)行耳緣靜脈取血，每次約1．0ml，室溫靜置40min，3 000rpm離心5min，取血清－20℃冷凍保存。妊娠雌兔分別于第6．0、7．5、9、10．5、12、13、14、15和19天處死取材，且處死前耳緣靜脈取血，血清－20℃保存。每組各妊娠時間點(diǎn)取至少5個胎盤于4%多聚甲醛固定。

2．免疫組織化學(xué)染色：胎盤組織常規(guī)石蠟包埋制片，切片脫蠟、水化，經(jīng)EDTA緩沖液（pH 8．0）煮沸20min進(jìn)行抗原修復(fù)，3%雙氧水室溫下10min，加羊血清室溫孵育20min，小鼠抗人CK7（1∶200）4℃過夜（小鼠IgG抗體為陰性對照），辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗37℃孵育30min，DAB顯色8min，蘇木精復(fù)染1min，脫水透明，中性樹膠封片。

3．過碘酸雪夫（PAS）染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，高碘酸溶液染色10min，充分蒸餾水洗，擦干多余水分，雪夫試劑浸染10min，流水沖洗，Harris明礬蘇木素復(fù)染2min，95%酒精、無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

4．堿性磷酸酶染色：胎盤冰凍組織，下冰凍切片，冷丙酮固定5min，蒸餾水沖洗數(shù)秒，按AP-Red kit試劑盒說明書顯色20min，蒸餾水洗，Harris明礬蘇木素復(fù)染5s，蒸餾水洗，水溶性封片劑封片。

5．血清雌和孕激素水平測定：使用放射免疫法測定采集血清中的激素含量（試劑盒由南京迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司提供）。

結(jié) 果

一、妊娠早、中期血清雌二醇和孕酮變化

雌二醇水平在妊娠第6天后開始升高，第12天達(dá)高峰，此后下降，第15天時接近初始水平（圖1A）。孕酮水平第3天開始呈升高趨勢，第6天開始顯著增高，第12天達(dá)到最高水平，此后一直維持這個水平（圖1B）。

二、子宮內(nèi)膜血管管周蛻膜化變化

妊娠第9天，子宮內(nèi)膜血管管周出現(xiàn)蛻膜化細(xì)胞，胞質(zhì)比較致密（圖2A），富含堿磷酶（圖2E）和糖蛋白（圖2G）；第10．5天，蛻膜化細(xì)胞由管周擴(kuò)充到整個間質(zhì)，蛻膜細(xì)胞發(fā)生空泡化（圖2B）；從第12天開始，蛻膜化細(xì)胞高度空泡化（圖2C），間質(zhì)被擠壓成狹長的條索狀（圖2C、F、H）；第15天，蛻膜細(xì)胞仍然保持高度空泡化（圖2D），空泡化的蛻膜細(xì)胞不再富含堿磷酶（圖2F）和糖蛋白（圖2H）。

圖1 雌兔妊娠早、中期血清雌二醇與孕酮水平

三、妊娠早中期滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵潤

CK7免疫組化方法檢測顯示，在兔妊娠第6天，CK7陽性定位于擴(kuò)張的子宮腔上皮細(xì)胞（圖3A）；在第7．5天，在胚胎著床處，定位于滋養(yǎng)層粘結(jié)點(diǎn)（圖3B箭頭示）；到第9天時滋養(yǎng)層粘附完成，被滋養(yǎng)層粘附的內(nèi)膜部位失去上皮樣結(jié)構(gòu)，陽性信號減弱，在滋養(yǎng)層粘附部位偶見CK7陽性的滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖3C箭頭示）；在第10．5天，胎盤小葉出現(xiàn)（圖3D箭頭示），CK7陽性的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞已經(jīng)開始侵潤到子宮內(nèi)膜基質(zhì)（圖3D）；在第12天，迷路區(qū)結(jié)構(gòu)較明顯，CK7陽性的滋養(yǎng)層細(xì)胞在迷路下子宮基質(zhì)中劇增，且在此區(qū)域動脈竇形成（圖3E）；在第13天和14天，胎盤下的動脈竇進(jìn)一步擴(kuò)張，在動脈竇周圍的間質(zhì)及管周蛻膜細(xì)胞CK7陽性的滋養(yǎng)層細(xì)胞增多（圖3F、3G）：在絨毛柱的末梢細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞形成內(nèi)含三四個或更多個核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖3G2），而迷路區(qū)大部分為空泡化的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖3G2、3G3）。此外，在非著床位點(diǎn)，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞融合成數(shù)個核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，但是此處的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞與迷路區(qū)的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞明顯不同，其核的數(shù)量較多達(dá)數(shù)個至數(shù)十個，而且均未見空泡樣改變（圖3G1）。在第15天，胎盤形成，且胎盤連接區(qū)全部被CK7陽性的滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤，動脈竇管腔又進(jìn)一步擴(kuò)張（圖3H）；在第19天，CK7陽性的滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲至子宮肌層和肌層動脈管壁，而連接區(qū)基質(zhì)細(xì)胞基本全部發(fā)生退行性改變，形成少細(xì)胞的松散區(qū)域，動脈竇里的CK7陽性滋養(yǎng)層細(xì)胞基本消失，且管腔較第15天擴(kuò)大更加明顯（圖3I）。

圖2 妊娠早、中期血管管周蛻膜化變化（HE、PAS、堿性磷酸酶染色）

在妊娠第12天到第15天的胎盤組織中，子宮蛻膜區(qū)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤部位均同時存在以下三種情況：（1）管內(nèi)充滿滋養(yǎng)層細(xì)胞而管壁和管周沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖3E1）；（2）正在向管周細(xì)胞滲透的滋養(yǎng)層細(xì)胞（圖3E2）；（3）血管之間的間質(zhì)充滿滋養(yǎng)層細(xì)胞，管周沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞滲透（圖3E3）。

圖3 妊娠早、中期胎盤CK7免疫組織化學(xué)染色

討 論

子宮螺旋動脈重塑及滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤與先兆子癇、植入性胎盤、胎兒生長受限等疾病相關(guān)，研究滋養(yǎng)層細(xì)胞侵潤的分子機(jī)制在基礎(chǔ)研究和臨床指導(dǎo)上都具有重大意義。

在人的妊娠過程中，細(xì)胞滋養(yǎng)層祖細(xì)胞有兩種分化途徑：一是部分細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞融合形成多核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，使絨毛能夠漂浮在母體血液中，同時構(gòu)成與母體血之間的屏障，調(diào)節(jié)氧氣、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的運(yùn)輸；二是部分細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞分化成絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞，絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞向母體蛻膜組織侵潤，對子宮螺旋動脈重塑起重要作用［10－11］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，在兔的妊娠過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞主要為含三四個核或更多核的空泡化合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，絨毛中只含單核的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，在絨毛柱末端往往為多個核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞。同時，空泡化的滋養(yǎng)層細(xì)胞呈CK7強(qiáng)陽性染色，而非空泡化的滋養(yǎng)層細(xì)胞CK7則陽性信號很弱。因此我們推測兔妊娠中合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞形成的一種方式為：絨毛中細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞逐漸融合成多核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，并從絨毛柱末端脫落下來，之后逐漸發(fā)生空泡化，侵襲能力加強(qiáng)，向蛻膜區(qū)及肌層血管侵襲。另外，在非著床點(diǎn)我們還看到單核的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞融合成巨大的含數(shù)個核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，在這些細(xì)胞侵潤的部位見到不完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，推測這些細(xì)胞對非著床位點(diǎn)連接區(qū)的建立具有重要作用，其機(jī)制仍有待于探討。

在人類子宮螺旋動脈重塑機(jī)制中，關(guān)于滋養(yǎng)層細(xì)胞是通過管周間質(zhì)細(xì)胞侵潤方式進(jìn)入血管，還是從血管遠(yuǎn)端進(jìn)入逆行向上侵潤整個子宮動脈，這一直存在爭議［12］。在本研究中初步觀察在兔中滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵潤方式，在同一胎盤組織中總能同時觀察到以下3種情況：（1）管內(nèi)充滿滋養(yǎng)層細(xì)胞而管壁和管周沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞；（2）正在向管周細(xì)胞滲透的滋養(yǎng)層細(xì)胞；（3）血管之間的間質(zhì)充滿滋養(yǎng)層細(xì)胞，管周沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞滲透。同時發(fā)現(xiàn)在妊娠第19天肌層處存在大量滋養(yǎng)層細(xì)胞，而肌層與連接區(qū)之間的蛻膜組織中沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞。因此，這些結(jié)果提示兔滋養(yǎng)層細(xì)胞可能以間質(zhì)滲入、蛻膜細(xì)胞滲入、血管內(nèi)逆行向上多種方式并行向肌層方向進(jìn)行侵潤。

另外我們發(fā)現(xiàn)，在兔的妊娠子宮中，在蛻膜化的初始階段堿性磷酸酶活性較高，蛻膜細(xì)胞逐漸空泡化后，不再顯示堿性磷酸酶活性，所以在兔中堿性磷酸酶的強(qiáng)陽性是管周蛻膜化開始的一個指示，這與Zook等［13］通過皮埋雌孕激素誘導(dǎo)蛻膜化的結(jié)果相一致，具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

Albrecht等［14］在猩猩體內(nèi)的研究表明，雌二醇能夠明顯地抑制絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力和血管重塑過程。而對于孕酮，大量研究結(jié)果表明其對絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力起著負(fù)調(diào)節(jié)性作用［15－16］。但也有人得到與此 相反的 結(jié)果［17］。本研究中通過測定兔妊娠早中期的雌孕激素水平，結(jié)果也提示滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲功能可能受到孕酮、雌二醇等激素的調(diào)節(jié)。此外，兔妊娠階段雌和孕激素水平變化特點(diǎn)還提示，孕酮的高水平是維持蛻膜化的關(guān)鍵，雌激素對蛻膜化起誘導(dǎo)作用。Elton等［18］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果印證了這一點(diǎn)。他們通過皮下注射雙醋炔諾酮加美雌醇誘導(dǎo)兔子宮蛻膜化，結(jié)果顯示，只給雙醋炔諾醇組，子宮蛻膜率隨著雙醋炔諾醇濃度的增加而升高，但最高只能達(dá)到74%，而給予適宜劑量美雌醇時蛻膜率升高到100%。

滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤程度受到自身、蛻膜組織及母體雌孕激素誘導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。對這些調(diào)節(jié)機(jī)制的探索有利于先兆子癇、胎兒生長受限、植入性胎盤等妊娠相關(guān)性疾病的認(rèn)識，通過其發(fā)病機(jī)制的深入研究進(jìn)而從源頭上找到治療這些疾病的新靶點(diǎn)。

［1］ Roberts JM，Cooper DW．Pathogenesis and genetics of Preeclampsia［J］．Lancet，2001，357：53-56．

［2］ Reus AD，El-Harbachi H，Rousian M，et al．Early firsttrimester trophoblast volume in pregnancies that result in live birth or miscarriage［J］．Ultrasound Obstet Gynecol，2013，42：577-584．

［3］ Nadeem L，Munir S，F(xiàn)u G，et al．Nodal signals through activin receptor-like kinase7to inhibit trophoblast migration and invasion：implication in the pathogenesis of preeclampsia［J］．Am J Pathol，2011，178：1177-1189．

［4］ Graur D，Duret L，Gouy M．Phylogenetic position of the order Lagomorpha（rabbits，hares and allies）［J］．Nature，1996，379：333-335．

［5］ McArdle AM，Denton KM，Maduwegedera D，et al．Ontogeny of placental structural development and expression of the renin-angiotensin system and 11beta-HSD2genes in the rabbit［J］．Placenta，2009，30：590-598．

［6］ McArdle AM，Roberts CT，Maduwegedera D，et al．Chronic maternal hypertension characterized by renal dysfunction is associated with reduced placental blood flow during late gestation in rabbits［J］．Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2010，298：R1043-R1049．

［7］ Gauster M，Blaschitz A，Siwetz M，et al．Keratins in the human trophoblast［J］．Histol Histopathol，2013，28：817-825．

［8］ Blaschitz A，Weiss U，Dohr G，et al．Antibody reaction patterns in first trimester placenta implications for trophoblast isolation and purity screening［J］．Placenta，2000，21：733-741．

［9］ Maldonado-Estrada J，Menu E，Roques P，et al．Evaluation of Cytokeratin 7as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry［J］．J ImmunolMethods，2004，286：21-34．

［10］ Aplin JD．Implantation，trophoblast differentiation and haemochorial placentation：mechanistic evidence in vivo and in vitro［J］．J Cell Sci，1991，99：681-692．

［11］ Pijnenborg R．Trophoblast invasion［J］．Reprod Med Rev，1994，3：53-73．

［12］ Dixon HG，Robertson WB．A study of the vessels of the placental bed in normotensive and hypertensive woman［J］．J Obstet Gynaecol Br Emp，1958，65：803-809．

［13］ Zook BC，J?nne OA，Abraham AA，et al．The development and regression of deciduosarcomas andother lesions caused by estrogens and progestins in rabbits［J］．Toxicol Pathol，2001，29：411-416．

［14］ Albrecht ED，Bonagura TW，Burleigh DW，et al．Supression of extravillous trophoblast invasion of uterine spiral arteries by estrogen during early baboon pregnancy［J］．Placenta，2006，27：483-490．

［15］ Goldman S，Shalev E．Difference in progesterone-receptor isoforms ratio between early and late first-trimester human trophoblast is associated with differential cell invasion and matrix metalloproteinase2expression［J］．Biol Reprod，2006，74：13-22．

［16］ Goldman S，Shalev E． A proposed mechanism for progesterone regulation of trophoblast MMP2transcription independent of classical progesterone response elements on its promoter［J］．J Exp Clin Assist Reprod，2006，3：4．

［17］ Liu J，Matsuo H，Laoag-Fernandez JB，et al．The effects of progesterone on the apoptosis in the human trophoblastderived HTR-8／SV neo cells［J］．Mol Hum Reprod，2007，13：869-874．

［18］ Elton RL，Klimstra PD，Colton FB．Induction of deciduoma in rabbits without uterine trauma by treatment with ethynodiol diacetate：a synthetic progestogen［J］．Proc Soc Exp Biol Med，1966，121：1194-1196．