郭永，趙愛(ài)華，蘇晨，3，丁寧，張瑤楠，劉慶＊，王乾興

（1．國(guó)家人口計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所內(nèi)分泌室，北京 100081；2．解放軍第309醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100091；3．遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，遵義 563000）

米非司酮作為一種在臨床上廣泛使用的口服避孕藥，其分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。究其原因，在于作為米非司酮作用靶組織之一的人子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人子宮內(nèi)膜主要由腺／腔上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)等成分構(gòu)成。在人子宮內(nèi)膜中，包括子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生理功能、細(xì)胞間的相互作用、各種細(xì)胞對(duì)性激素的應(yīng)答等正常生理過(guò)程，及子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程均在其中發(fā)揮作用。細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床實(shí)踐和生物工程等生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，也包括在生殖領(lǐng)域的運(yùn)用。建立子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)體系是對(duì)相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行深入分析的較理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。但目前未有較好的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細(xì)胞系，因此，本研究擬通過(guò)組織分離原代培養(yǎng)的方法獲得人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細(xì)胞，從而建立一種簡(jiǎn)單、高效的子宮內(nèi)膜細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，同時(shí)分離培養(yǎng)高純度的基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞，旨在為研究子宮內(nèi)膜相關(guān)生理機(jī)制提供可靠的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)。在此基礎(chǔ)上，我們將米非司酮直接作用于分離得到的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，以研究米非司酮對(duì)月經(jīng)周期中重要細(xì)胞——人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1．人子宮內(nèi)膜標(biāo)本：5例，增殖期內(nèi)膜組織。取自年齡40～47歲的良性婦科疾病患者，患者月經(jīng)周期規(guī)律，無(wú)外科、內(nèi)分泌、免疫及代謝性疾病，手術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未接受激素類藥物治療，術(shù)后均經(jīng)病理確診。

2．主 要 試 劑：米 非 司 酮 （Sigma，美 國(guó)）；DMEM／F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）；PBS緩沖液、0．25%胰蛋白酶（GIBCO，美國(guó)）；活性炭處理胎牛血清（Wisent，加拿大）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（Amerosco，美國(guó)）；小鼠抗人波形蛋白抗體（R＆D，美國(guó)）；小鼠抗人角蛋白抗體（Dako，美國(guó)）；DNaseⅠ（Takara，日本）；異硫氰酸熒光素（FITC）-小鼠二抗（北京中杉金橋）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．人子宮內(nèi)膜細(xì)胞原代分離培養(yǎng)：參照Ryan等［1］的方法加以改良，具體操作步驟如下：在無(wú)菌的環(huán)境下，將取得的人子宮內(nèi)膜標(biāo)本立即放入含青／鏈霉素的冰冷Hank’s液，洗滌3次；組織置于冰上，用眼科剪將組織剪成小于1mm×1mm×1mm大小組織塊，移入三角瓶中；加入適量的0．2%膠原酶消化液，37 ℃孵育1．5h，在孵育1h時(shí)，加入15U／ml DNaseⅠ繼續(xù)消化30min；消化過(guò)程中每隔20min，用渦旋器混勻一次；將消化后的細(xì)胞懸液通過(guò)50目篩網(wǎng)，濾去未消化的組織；再通過(guò)200目和400目篩網(wǎng)，濾液中以基質(zhì)細(xì)胞為主，400目篩網(wǎng)上以腺細(xì)胞團(tuán)為主。

基質(zhì)細(xì)胞：濾液收集后，900r／min離心5min收獲細(xì)胞，臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)，接種密度為2．5×105個(gè)／ml。

上皮細(xì)胞：用Hank’s液反洗400目篩網(wǎng)，1 100 r／min離心2min，收集細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)；900r／min離心5min后，棄上清，加入2ml 0．05%胰酶和15U／ml DNaseⅠ，吹打10min，使細(xì)胞團(tuán)分散成單細(xì)胞；獲得細(xì)胞臺(tái)盼蘭染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×105／ml密度接種。

基質(zhì)細(xì)胞接種后1．5h，將懸浮的細(xì)胞及上皮細(xì)胞團(tuán)吸出，重新加入培養(yǎng)液，此時(shí)基質(zhì)細(xì)胞已帖壁；上皮細(xì)胞接種后2h，將懸浮的細(xì)胞及上皮細(xì)胞團(tuán)吸出，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶中?；|(zhì)和上皮細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM／F12＋10%FBS（活性炭處理）。

2．人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細(xì)胞波形蛋白和角蛋白的鑒定

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法，分別檢測(cè)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細(xì)胞的波形蛋白和角蛋白表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞比率，鑒定分離培養(yǎng)的基質(zhì)和上皮細(xì)胞的純度。實(shí)驗(yàn)步驟如下：0．25%胰酶消化，收獲細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)不少于1×106個(gè)細(xì)胞；2%多聚甲醛固定15min；PBS洗滌2次，5min／次，1 100r／min離心收獲細(xì)胞；加入1%Triton X-100，室溫處理20min，PBS洗滌2次，3min／次；加入一抗工作液（小鼠抗人波形蛋白或小鼠抗人角蛋白抗體），37℃孵育1h；PBS洗滌3次，5min／次，加入熒光標(biāo)記二抗工作液（FITC-小鼠二抗，1︰50），室溫避光反應(yīng)45min；PBS洗滌3次，5min／次，用0．5ml PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行流式檢測(cè)。以PBS代替一抗做為陰性對(duì)照。

3．MTT法檢測(cè)細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代分離培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，用0．25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，分別以DMEM／F12培養(yǎng)基（含10%活性炭處理FBS）調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為4×104個(gè)／ml，接種于96孔板，每孔100μl，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，加入米非司酮試劑，使其終濃度分別 為 0．01、0．1、0．5、1、2．5、10、25、50 和 100 μmol／L，并設(shè)立空白組（不接種細(xì)胞）、對(duì)照組（接種細(xì)胞，但不加米非司酮）。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別將培養(yǎng)板放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d和3d，各孔均加入 20μl MTT 溶液 （5mg／ml，即 0．5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 490nm處測(cè)量各孔的吸光值（OD值）。取6個(gè)孔的OD值均數(shù)，按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率（IR）＝（對(duì)照組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值）／對(duì)照組OD值×100%。以平均抑制率為Y軸，米非司酮濃度為X軸分別繪制米非司酮濃度對(duì)兩種細(xì)胞抑制率的散點(diǎn)圖。通過(guò)直線回歸計(jì)算米非司酮對(duì)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的IC50。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行分析，流式檢測(cè)結(jié)果以（±s）表示，IR值采用直線回歸分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

分離所得基質(zhì)細(xì)胞主要為單個(gè)細(xì)胞，在1h左右迅速貼壁，剛貼壁基質(zhì)細(xì)胞多呈三角形，以2．5×105／ml密度接種細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，4～5d即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)板，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或紡錘形（圖1A），相互平行排列成束?；|(zhì)細(xì)胞至少可穩(wěn)定傳4代。

分離所得上皮細(xì)胞呈團(tuán)狀聚集生長(zhǎng)，貼壁較慢，2～3h開始貼壁。剛貼壁的上皮細(xì)胞呈蝌蚪形，2d后，細(xì)胞出現(xiàn)漩渦狀排列，團(tuán)簇生長(zhǎng)，最后生長(zhǎng)成片。以5×105個(gè)／ml密度接種細(xì)胞，6～7d可長(zhǎng)滿培養(yǎng)板（圖1B），生長(zhǎng)速度較基質(zhì)細(xì)胞慢。上皮細(xì)胞傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差。

二、細(xì)胞鑒定及純度檢測(cè)結(jié)果

利用抗基質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的波形蛋白抗體和抗上皮細(xì)胞特異表達(dá)的角蛋白抗體，鑒定分離培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)波形蛋白和角蛋白陽(yáng)性細(xì)胞比率，計(jì)算分離培養(yǎng)的細(xì)胞純度。以不加一抗的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，通過(guò)參數(shù)設(shè)定，選定流式分析的細(xì)胞范圍（圖2）。熒光信號(hào)分析結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞波形蛋白陽(yáng)性率達(dá)97%，上皮細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性率達(dá)90%（表1）。說(shuō)明通過(guò)該原代細(xì)胞分離方法可獲得高純度人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞。

圖1 原代分離培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)和上皮細(xì)胞形態(tài)觀察（200×）

三、米非司酮對(duì)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞IC50檢測(cè)結(jié)果

米非司酮作用于原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞2d后，隨著米非司酮濃度增加，基質(zhì)細(xì)胞IR值逐漸增高，其中，米非司酮濃度為50μmol／L和100μmol／L的實(shí)驗(yàn)組的IR值高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；米非司酮作用3d后，對(duì)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞抑制作用更明顯，米非司酮濃度為25、50和100μmol／L各組的IR值均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。對(duì)米非司酮處理2d和3d原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞抑制率進(jìn)行直線回歸分析，米非司酮處理2d對(duì)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的IC50為52．85μmol／L，米非司酮處理3d對(duì)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的IC50為86．46μmol／L（圖3）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)波形蛋白和角蛋白表達(dá)的熒光峰型圖

表1 分離培養(yǎng)細(xì)胞的波形蛋白和角蛋白陽(yáng)性率（%）

圖3 不同濃度米非司酮對(duì)原代人子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率比較

討 論

目前，人子宮內(nèi)膜分離方法多采用二次過(guò)濾法，即先將消化好的混懸液過(guò)200目濾網(wǎng)，以除去粘液和未消化組織，再過(guò)400目濾網(wǎng)，400目濾網(wǎng)上面為未消化的腺上皮細(xì)胞團(tuán)，反沖濾網(wǎng)獲得腺體細(xì)胞團(tuán)，而濾液中富含基質(zhì)細(xì)胞。這種方法不但無(wú)法獲得高純度的基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞，并且腺上皮細(xì)胞團(tuán)直接接種不易貼壁，存活率低，造成樣本的浪費(fèi)。本部分實(shí)驗(yàn)采用“二次酶消化－二次過(guò)濾－差時(shí)貼壁”的方法分離得到了高純度、高產(chǎn)量的基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞。具體過(guò)程是在上述方法研究基礎(chǔ)上，將得到的上皮細(xì)胞團(tuán)再用0．05%胰酶二次消化，可得到單個(gè)上皮細(xì)胞，單細(xì)胞極易貼壁，存活率高。另外，由于基質(zhì)和上皮細(xì)胞貼壁時(shí)間存在差異，基質(zhì)細(xì)胞在接種2h內(nèi)即可完全貼壁，而上皮則是在2h后開始貼壁，因此，利用兩種細(xì)胞貼壁時(shí)間不同的特性，在細(xì)胞接種后1．5～2h進(jìn)行細(xì)胞換液，可有效提高基質(zhì)和上皮細(xì)胞純度。

一直以來(lái)，研究者都將波形蛋白和角蛋白作為鑒別基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的標(biāo)識(shí)物分子。Mathews等［2］發(fā)現(xiàn)波形蛋白同時(shí)表達(dá)于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，分離獲得的上皮細(xì)胞中波形蛋白呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為（71．3±18．6）%。因此，本研究也證實(shí)波形蛋白不僅表達(dá)于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)還表達(dá)于上皮細(xì)胞，。因而，波形蛋白不能作為唯一鑒別基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的依據(jù)。目前的研究中，細(xì)胞鑒別實(shí)驗(yàn)多采用波形蛋白和角蛋白免疫組織化學(xué)染色，該方法步驟繁瑣，可鑒別細(xì)胞數(shù)量有限，并且通過(guò)人工計(jì)數(shù)等方式計(jì)算陽(yáng)性率，操作繁瑣，誤差大。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)，同時(shí)檢測(cè)波形蛋白和角蛋白表達(dá)情況。該方法測(cè)定的細(xì)胞數(shù)量大，細(xì)胞數(shù)量大于1×106個(gè)，同一群細(xì)胞同時(shí)檢測(cè)波形蛋白和角蛋白表達(dá)，熒光信號(hào)敏感，計(jì)數(shù)精確。流式結(jié)果顯示，本研究分離得到的基質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)97%，上皮細(xì)胞純度達(dá)90%，并且收獲細(xì)胞數(shù)量多，標(biāo)本利用率高。

米非司酮是1981年由法國(guó)的Roussel-Uclaf公司開發(fā)的一種人工合成的炔諾酮衍生物。經(jīng)過(guò)30多年的摸索實(shí)踐，米非司酮廣泛地運(yùn)用于臨床，例如終止早孕、緊急避孕、藥物流產(chǎn)和治療抑郁癥、腦膜瘤、阿爾茲海默綜合征、庫(kù)欣綜合征等領(lǐng)域［3－5］。在米非司酮避孕機(jī)制研究中，目前文獻(xiàn)報(bào)道呈現(xiàn)的結(jié)果大多為內(nèi)膜組織切片的形態(tài)觀察和免疫組織化學(xué)檢測(cè)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素較多，不利于分子機(jī)制探索，因此，亟待良好的子宮內(nèi)膜細(xì)胞模型的建立，以為避孕分子機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

之前關(guān)于米非司酮在子宮內(nèi)膜中作用的研究提出，米非司酮抑制子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)和分泌期改變，而更多是停留在現(xiàn)象的觀察［6－7］，近期更多地側(cè)重在分子水平上解釋有關(guān)米非司酮作用下游相關(guān)的信號(hào)通路以及miRNA調(diào)控作用［8－11］。在本研究中，在獲得高純度的人子宮內(nèi)膜基礎(chǔ)上，采用米非司酮處理原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，觀察在體外米非司酮對(duì)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示米非司酮作用于原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞2d和3d后，抑制原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，其抑制率均隨著米非司酮濃度的增加而升高，存在明顯的量效關(guān)系。我們?cè)谇捌谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)米非司酮發(fā)揮作用與其使用劑量和時(shí)間密切相關(guān)［12］。抑制率直線回歸分析結(jié)果表明，米非司酮處理2d和3d后，原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的IC50分別為 52．85μmol／L 和86．46μmol／L。

綜上所述，我們采用二次酶消化－二次過(guò)濾－差時(shí)貼壁的方法獲得了純度分別達(dá)97%和90%的高純度、高產(chǎn)量的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞，為后續(xù)細(xì)胞水平的研究提供了技術(shù)上的支持和保障。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)米非司酮避孕分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明米非司酮能夠抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖，也為深入研究子宮內(nèi)膜細(xì)胞在避孕藥物發(fā)揮作用的過(guò)程中扮演著的細(xì)胞角色和相關(guān)分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

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