劉驊漫，劉學(xué)，賈新華，張心月，張偉

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250014；2山東省胸科醫(yī)院；3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

海藻多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5氧化損傷的影響及其機(jī)制

劉驊漫1,3，劉學(xué)1,2，賈新華3，張心月1，張偉3

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250014；2山東省胸科醫(yī)院；3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的探討海藻多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5氧化損傷的影響及機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5隨機(jī)分為空白組、H2O2組、海藻多糖組、海藻多糖+H2O2組、H2O2+海藻多糖組?？瞻捉M正常培養(yǎng)，H2O2組給予H2O2處理，海藻多糖組給予海藻多糖處理，海藻多糖+H2O2組先給予海藻多糖干預(yù)1 h、再給予H2O2處理，H2O2+海藻多糖組先給予H2O2干預(yù)1 h、再給予海藻多糖處理。各組H2O2濃度均為600 μmol/L，海藻多糖濃度均為0.312 5 mg/mL。各組均于干預(yù)0、24、48、72 h時(shí)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率；處理24 h時(shí)檢測(cè)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)表達(dá)，采用免疫熒光法檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)蛋白表達(dá)，采用RT-PCR法檢測(cè)Nrf2、Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(Keap1)、NADP(H)醌氧化還原酶1(NQO1)、血紅素氧合酶1(HO-1)、CGLC mRNA表達(dá)。結(jié)果培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，H2O2組、海藻多糖+H2O2組、H2O2+海藻多糖組細(xì)胞增殖抑制率均高于空白組及海藻多糖組，海藻多糖+H2O2組、H2O2+海藻多糖組均低于H2O2組，組間比較P均<0.05。與空白組及海藻多糖組比較，H2O2組、海藻多糖+H2O2組、H2O2+海藻多糖組MDA、ROS表達(dá)增加，SOD表達(dá)降低；與H2O2組比較，海藻多糖+H2O2組、H2O2+海藻多糖組MDA、ROS表達(dá)降低，SOD表達(dá)增加，組間比較P均<0.05。與空白組及海藻多糖組比較，H2O2組、海藻多糖+H2O2組、H2O2+海藻多糖組Nrf2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，海藻多糖+H2O2組、H2O2+海藻多糖組均較H2O2組升高，組間比較P均<0.05。與空白組及海藻多糖組比較，H2O2組、海藻多糖+H2O2組、H2O2+海藻多糖組Keap1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，NQO1、CGLC、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低；與H2O2組比較，海藻多糖+H2O2組、H2O2+海藻多糖組Keap1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，NQO1、CGLC、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高；組間比較P均<0.05。結(jié)論海藻多糖可抑制H2O2誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5的氧化應(yīng)激損傷，上調(diào) Nrf2表達(dá)、激活Nrf2/Keap1/抗氧化反應(yīng)序列元件信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制。

肺纖維化；人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5；海藻多糖；過(guò)氧化氫；氧化損傷；核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of seaweed polysaccharides on H2O2-induced oxidative damage of human embryonic lung fibroblasts MRC-5 and its mechanism.MethodsMRC-5 cells cultured in vitro were randomly divided into the blank group, H2O2group, seaweed polysaccharide group, seaweed polysaccharide+H2O2group, and H2O2+seaweed polysaccharide group. Cells in the blank group were cultured normally, cells in the H2O2group were treated with H2O2, cells in the seaweed polysaccharide group were treated with seaweed polysaccharide, cells in the seaweed polysaccharide+H2O2group were treated with seaweed polysaccharide for 1 h, then followed by H2O2, and cells in the H2O2+seaweed polysaccharide group were treated with H2O2for 1 h, then followed by H2O2. The concentration of H2O2in each group was 600 umol/L, and the concentration of seaweed polysaccharide was 0.3125 mg/mL. At 0, 24, 48 and 72 h after treatment, the cell proliferation inhibitory rate in each group was determined by MTT assay. The levels of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), and reactive oxygen species (ROS) were measured at 24 h. NF-E2-related factor 2 (Nrf2) protein was detected by immunofluorescence assay. The expression levels of Nrf2, Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), NADP (H) quinone oxidoreductase 1 (NQO1), heme oxygenase 1 (HO-1), and CGLC mRNA were detected by RT-PCR.ResultsThe cell inhibition rates of the H2O2group, seaweed polysaccharide +H2O2group, and H2O2+ seaweed polysaccharide group were higher than those of the blank group and seaweed polysaccharide group at 24, 48 and 72 h, and those of the seaweed polysaccharide+H2O2group and H2O2+seaweed polysaccharide group were lower than that of the H2O2group (allP<0.05). Compared with the blank group and the seaweed polysaccharide group, the levels of MDA and ROS in the H2O2group, the seaweed polysaccharide+H2O2group, and the H2O2+seaweed polysaccharide group increased, and the SOD level decreased. Compared with the H2O2group, the MDA and ROS levels decreased and the SOD level increased in the seaweed polysaccharide+H2O2group and the H2O2+seaweed polysaccharide group (allP<0.05). Compared with the blank group and the seaweed polysaccharide group, the expression of Nrf2 mRNA and protein in the H2O2group, the seaweed polysaccharide+H2O2group, and the H2O2+seaweed polysaccharide group decreased, and the seaweed polysaccharide+H2O2group and H2O2+seaweed polysaccharide group were higher than the H2O2group (allP<0.05). Compared with the blank group and the seaweed polysaccharide group, the relative expression of Keap1 mRNA in the H2O2group, the seaweed polysaccharide+H2O2group, and the H2O2+seaweed polysaccharide group increased, and the relative expression of NQO1, CGLC, and HO-1 mRNA decreased. Compared with the H2O2group, the relative expression of Keap1 mRNA in the polysaccharide+H2O2group and H2O2+seaweed polysaccharide group decreased, and the relative expression of NQO1, CGLC, and HO-1 mRNA increased (allP<0.05).ConclusionSeaweed polysaccharide could inhibit the oxidative stress injury of MRC-5 induced by H2O2through up-regulating the expression of Nrf2 and activating Nrf2-Keap1-ARE signaling pathway.

Keywords: pulmonary fibrosis; human embryonic lung fibroblasts MRC-5; seaweed polysaccharide; H2O2； oxidative damage; nuclear transcription factor E2-related factor 2

肺纖維化是肺間質(zhì)性疾病的最終結(jié)局，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化/抗氧化失衡是其形成及進(jìn)展的主要原因之一。肺纖維化主要表現(xiàn)為肺功能進(jìn)行性下降。目前尚無(wú)確切有效的治療藥物。中藥海藻味咸性寒，歸脾、肝、腎經(jīng)，具有消痰散結(jié)、利水消腫之功效，起主要作用的成分為海藻多糖。海藻多糖具有抗氧化作用，目前多被作為食品抗氧化劑，其作為藥物用于疾病抗氧化的研究較少。2014年10月～2015年6月，本研究探討了海藻多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5氧化損傷的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5購(gòu)自南京凱基生物工程有限公司。主要試劑：海藻多糖(含量>99%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，MEM培養(yǎng)基、DMSO均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，F(xiàn)BS購(gòu)自美國(guó) ExCell公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、總蛋白提取試劑盒及核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)一抗均購(gòu)自南京凱基生物工程有限公司。Nrf2、Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(Keap1)、NADP(H)醌氧化還原酶1(NQO1)、血紅素氧合酶1(HO-1)、CGLC、GAPDH引物均由南京凱基生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將MRC-5細(xì)胞置于含10% FBS、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞覆蓋面積達(dá)80%～90%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶，按1∶3傳代培養(yǎng)。取第4代細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、H2O2組、海藻多糖組、海藻多糖+H2O2組、H2O2+海藻多糖組。空白組正常培養(yǎng)，H2O2組給予終濃度為600 μmol/L H2O2處理，海藻多糖組給予終濃度為0.312 5 mg/mL海藻多糖處理，海藻多糖+H2O2組給予0.312 5 mg/mL海藻多糖干預(yù)1 h后再給予600 μmol/L H2O2處理，H2O2+海藻多糖組給予600 μmol/L H2O2干預(yù)1 h后再給予0.312 5 mg/mL海藻多糖處理。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 采用MTT法。取1.2中處理24 h的各組細(xì)胞，以密度為5×104個(gè)/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別在孵育0、24、48、72 h時(shí)每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去所有液體，每孔加入DMSO 150 μL，置于搖床上輕輕搖勻10 min；酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)490 nm處各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(A空白組-A觀察組)/A空白組×100%。

1.4 MDA、SOD、ROS表達(dá)檢測(cè) 取1.2中處理24 h的各組細(xì)胞，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA表達(dá)，采用氯化硝基氮藍(lán)四唑光還原法檢測(cè)SOD表達(dá)，采用DCFH-DA探針檢測(cè)ROS表達(dá)(以A值表示)。具體步驟均嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè) ①Nrf2 mRNA：采用RT-PCR法。取1.2中處理24 h的各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后置于PCR儀中，42 ℃、1 h，70 ℃、10 min，冰浴5 min；將樣本稀釋10倍，依次向0.2 mL PCR管加入2×Master Mix(SYBR Green) 10 μL、模板(進(jìn)行10倍稀釋后的cDNA)1 μL、引物混合物2 μL(含正、反向引物各10 μmol/L)、無(wú)RNase的雙蒸水7 μL，總量20 μL。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。Nrf2引物：F：TCCGGGTGTGTTTGTTCCAA，R：CGCCCGCGAGATAAAGAGTT；產(chǎn)物長(zhǎng)度88 bp。GAPDH引物：F：TCCTGGCTCAGCCTCAAATG，R：CGTTAAACACCTCCCTCCCC；產(chǎn)物長(zhǎng)度108 bp。②Nrf2蛋白：采用免疫熒光法。將MRC-5細(xì)胞置于預(yù)先放有載玻片的24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，分組及處理同1.2。處理24 h時(shí)取出細(xì)胞爬片室溫下自然晾干，浸入4%多聚甲醛中，室溫固定30 min或4 ℃過(guò)夜，PBS洗滌3 min×3次；血清封閉，滴加Nrf2一抗，37 ℃恒溫箱中濕盒孵育2 h，PBS洗滌3 min×3次；滴加FITC二抗，37 ℃恒溫箱中濕盒避光孵育1 h，PBS洗滌3 min×3次；滴加DAPI染液，封片，熒光顯微鏡觀察。取3個(gè)高表達(dá)視野拍照留存，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Keap1、NQO1、CGLC、HO-1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法，具體步驟參照1.5①。 Keap1引物：F：GTCCCCTACAGCCAAGGTCC，R：ACTCAGTGGAGGCGTACATC；產(chǎn)物長(zhǎng)度175 bp。NQO1引物：F：GGTTTGGAGTCCCTGCCATT，R：ACCAGTGGTGATGGAAAGCA；產(chǎn)物長(zhǎng)度134 bp。CGLC引物：F：GAGGTCAAACCCAACCCAGT，R：AAGGTACTGAAGCGAG-

GGTG；產(chǎn)物長(zhǎng)度92 bp。HO-1引物：F：TCCTGGCTCAGCCTCAAATG，R：CGTTAAACACCTCCCTCCCC；產(chǎn)物長(zhǎng)度108 bp。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算Keap1、NQO1、CGLC、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與空白組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與H2O2組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與海藻多糖組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

2.2 各組MDA、SOD、ROS表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 各組MDA、SOD、ROS表達(dá)比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，△P<0.05；與海藻多糖組比較，#P<0.05。

2.3 各組Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3。

表3 各組Nrf2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，△P<0.05；與海藻多糖組比較，#P<0.05。

2.4 各組Keap1、NQO1、CGLC、HO-1 mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表4。

表4 各組Keap1、NQO1、CGLC、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，△P<0.05；與海藻多糖組比較，#P<0.05。

3 討論

Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，在氧化應(yīng)激應(yīng)答中發(fā)揮核心調(diào)控作用。Nrf2可與抗氧化反應(yīng)序列元件(ARE)結(jié)合，發(fā)揮內(nèi)源性抗氧化作用；誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶，增強(qiáng)對(duì)ROS的清除能力，減輕細(xì)胞氧化損傷，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞被親電子物質(zhì)或氧化劑等攻擊處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)后跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入核，激活Nrf2/Keap1/ARE信號(hào)通路。Nrf2/Keap1/ARE信號(hào)通路是目前機(jī)體最主要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路，在機(jī)體抗氧化損傷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11]。本研究免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，空白組Nrf2主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)熒光反應(yīng)明顯增強(qiáng)；當(dāng)細(xì)胞受到H2O2刺激時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nrf2向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，細(xì)胞核內(nèi)Nrf2熒光反應(yīng)增強(qiáng)，用海藻多糖對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激后再進(jìn)行H2O2誘導(dǎo)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nrf2較正常細(xì)胞內(nèi)明顯增多。與單用H2O2刺激組相比，海藻多糖+H2O2組、海藻多糖組、H2O2+海藻多糖組各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)CGLC、HO-1、NQO1、Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯增高，海藻多糖組高于海藻多糖+H2O2組和H2O2+海藻多糖組；海藻多糖+H2O2組、海藻多糖組、H2O2+海藻多糖組Keap1 mRNA表達(dá)量下降，H2O2+海藻多糖組和海藻多糖+H2O2組高于海藻多糖組，提示海藻多糖抗氧化作用機(jī)制可能與Nrf2/Keap1/ARE信號(hào)通路激活有關(guān)。

綜上所述，海藻多糖可抑制人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5的氧化應(yīng)激損傷，上調(diào) Nrf2表達(dá)、激活Nrf2/Keap1/ARE信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制。

[1] Katzanstein AL, Myers JL. Idiopathic pulmonary fibrosis: clinical relevance of pathologic classification[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1998,157(4):1301-1315.

[2] 余晶,鮑中英,徐玉敏,等.花青素抗氧化損傷及細(xì)胞凋亡的作用研究[J]中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2009,19(1):24-26,31.

[3] 胡婷婷.海藻多糖的生物活性研究進(jìn)展[J].科技視窗,2012(36):17.

[4] Liu D, Sheng J, Li Z, et al. Antioxidant activity of polysaccharide fractions extracted from Athyrium multidentatum (Doll.) Ching[J]. Int J Biol Macromol, 2013(56):1-5.

[5] 秦華.海藻多糖對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺間質(zhì)纖維化模型的干預(yù)作用研究[J].齊魯藥事,2008,27(9):554-557.

[6] Ananthi S, Raghavendran HR, Sunil AG, et al. In vitroantioxidant and in vivo anti-inflammatory potential of crudepolysaccharide from Turbinaria ornate(Marine Brown Alga)[J]. Food Chem Toxicol, 2010,48(1):187-192.

[7] 馮珍鴿,王力,吳永沛,等.褐藻中巖藻聚糖的化學(xué)成分及其對(duì)超氧離子的抑制作用[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2010,31(3):66-68.

[8] Wang J, Zhang QB, Zhang ZS, et al. Antioxidant activity of sulfated polysacchari defractions extracted from Laminaria japonica[J]. Int J Biol Macromol, 2008,42(2):127-132.

[9] Deshmukh P, Unni S, Krishnappa G, et al. The Keap1-Nrf2 pathway: promising therapeutic target to counteract ROS-mediated damage in cancers and neurodegenerative diseases[J]. Biophys Rev, 2017,9(1):41-56.

[10] 李研,叢建波,田曉華,等.海藻多糖抑制白細(xì)胞呼吸暴發(fā)作用研究[J].生物化學(xué)與生物理進(jìn)展,1996,26(2):162-164.

[11] Yu X, Kensler T. Nrf2 as a target for cancer chemoprevention[J]. Mutat Res, 2005,591(1-2):93-102.

Antioxidation of seaweed polysaccharides on H2O2-induced oxidative damage of human embryonic lung fibroblasts MRC-5

LIUHuaman1,LIUXue,JIAXinhua,ZHANGXinyue,ZHANGWei

(1ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250014,China)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273704)；“泰山學(xué)者”建設(shè)工程(ts20110819)。

劉驊漫(1986-)，女，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楹粑到y(tǒng)疾病的中西醫(yī)結(jié)合診斷及治療。E-mail： liuhuaman@126.com

張偉(1963-)，男，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)楹粑到y(tǒng)疾病的中西醫(yī)結(jié)合診斷及治療。E-mail： huxizhijia@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.005

R56

A

1002-266X(2017)32-0017-04

2017-04-14)