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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

橙皮素對(duì)異丙基腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心衰的保護(hù)作用

曹靜1，呂吉元1，張明升2，師銳贊2，馮巧愛3

目的觀察橙皮素對(duì)大劑量異丙基腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)大鼠心衰的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。方法將SD大鼠隨機(jī)分為正常(C)組、橙皮素對(duì)照(H)組、異丙基腎上腺素(I)組和橙皮素治療+I(T)組，I組和T組接受皮下注射大劑量ISO(150 mg/kg)，2周后行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。確定造模成功后，H組及T組給予橙皮素(100 mg/kg)灌胃，I組給予等量的溶劑乙醇，連續(xù)給藥10 d后測(cè)定各組大鼠心臟功能包括左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室縮短分?jǐn)?shù)(FS)變化及血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(TAOC)的變化，觀察各組大鼠心肌的病理變化。結(jié)果與C組比較，I組LVEDD變化不大，LVESD值增大、EF、FS降低，氧化應(yīng)激指標(biāo)中MDA值升高，SOD、TAOC降低，各指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與I組比較，T組大鼠LVEDD無明顯變化，LVESD降低，EF、FS升高，血清MDA值降低，SOD、TAOC升高，各指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H組各指標(biāo)較C組無明顯變化。結(jié)論橙皮素可能通過減輕氧化應(yīng)激，降低MDA，升高SOD、TAOC，從而改善心衰大鼠的心臟功能。

心衰；橙皮素；異丙基腎上腺素；氧化應(yīng)激；大鼠

Abstract:ObjectiveTo explore the protective effects and possible mechanisms of hesperetin against isoproterenol (ISO)-induced heart failure (HF) in rats.MethodsForty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups：control group(group C)， hesperetin group (group H)， isoproterenol group (group I)and H+I group (group T). Rats in group I and group T were subcutaneously injected with ISO (150 mg/kg) once a day for 2 consecutive days.The model was successfully established in heart failure was determined by echocardiography after 2 weeks. Hesperetin was administered at the dosage of 100 mg/kg， po by gavage for a period of 10 days in group H and group T. Cardiac function of all rats including left ventricular end-diastolic diameter (LVEDD)， left ventricular end-systolic dimension (LVESD)， left ventricular ejection fractions (EF)， left ventricular fractional shortening (FS) was assessed by echocardiography. Collecting serum of all rats， malondialdehyde (MDA)，superoxide dismutase (SOD)， total antioxidant capacity (TAOC) were detected by thiobarbiturieacid colorimetry， WST-1 method and colorimetry method respectively.ResultsThere was not obvious changes of cardiac function in group C and group H. ISO inhibited the cardiac function of rats significantly including LVESD， EF， as well as FS， compared to group C(P<0.05). LVESD was increased while EF and FS were decreased. The level of MDA in group I was significantly higher (P<0.05) while the levels of SOD and TAOC were significantly lower than group C (P<0.05). Hesperetin attenuated the effect of heart failure induced by ISO. Cardiac function of rats including LVESD， EF，as well as FS was improved in group T compared to group I (P<0.05).LVESD was declined， EF and FS were ascended. The level of MDA was significantly lower，the levels of SOD，TAOC in group T were significantly higher than that in group I (P<0.05).ConclusionHesperetin can attenuate ISO-induced heart failure in rats. Its possible mechanisms may be associated with regulating oxidative stress.

Keywords：heart failure；hesperetin；isoproterenol；oxidative stress；rat

目前我國(guó)心臟疾病發(fā)病率和死亡率仍呈增高趨勢(shì)，發(fā)病人群趨于年輕化，增加了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，降低了人群平均壽命。各種心血管疾病的終末階段即進(jìn)展成為心衰，治療效果差，死亡率高[1]。盡管目前癥狀性心衰的治療有大量重要的進(jìn)展，心衰死亡以及心衰相關(guān)的花費(fèi)仍然在持續(xù)增加[2]。由于我國(guó)人口老齡化加速和包括糖尿病以及高血壓等疾病患病率的增加，未來十年，心衰發(fā)病率仍會(huì)增加?；钚匝跣盘?hào)在維持細(xì)胞生存和功能過程中發(fā)揮正常生理信號(hào)分子的作用，調(diào)節(jié)心血管信號(hào)的正常傳導(dǎo)[3]，多項(xiàng)證據(jù)表明，氧化應(yīng)激參與了心臟疾病的發(fā)生發(fā)展，過度的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)多種心血管疾病和狀態(tài)，最終引發(fā)心衰。橙皮素(5，7，3-三羥基-4 甲氧雙氫黃酮)是普遍存在于柑橘類水果的生物黃酮素[4- 5]。

橙皮素具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、抗癌、抗高血壓和抗致動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)[6- 7]。在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中，橙皮素通過抗氧化作用，降低DNA損失，減輕凋亡保護(hù)心臟[8]。橙皮素通過抑制心肌肥厚及纖維化，減輕氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡改善壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心室重構(gòu)，可能為心室重構(gòu)和心衰的治療提供新思路[9]。異丙基腎上腺素是一種合成的兒茶酚胺，屬于非選擇性的β腎上腺素受體激動(dòng)劑。研究發(fā)現(xiàn)異丙基腎上腺素以劑量依賴的方式迅速引起左室功能的下降[10]，皮下注射大劑量異丙基腎上腺素可誘導(dǎo)在體動(dòng)物心衰[11- 12]。本研究采用大劑量異丙基腎上腺素皮下注射模擬大鼠心衰模型，探索橙皮素對(duì)異丙基腎上腺素誘導(dǎo)致心衰的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Sprague-Dawler(SD)大鼠(3～4)月齡，體重(200～220) g 40只，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK晉2009-0001)。常規(guī)飼料喂食，自由飲水。所有用于研究的動(dòng)物遵照國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物健康管理與使用指南；所有動(dòng)物操作都經(jīng)過校級(jí)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 試劑與儀器 橙皮素、異丙基腎上腺素粉末購(gòu)自Sigma公司；微量丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化物能力(TAOC)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。主要設(shè)備為超聲心動(dòng)儀，型號(hào)為VEVO高分辨率小動(dòng)物超聲儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。正常(C組)、橙皮素對(duì)照(H組)、異丙基腎上腺素(I組)、橙皮素治療(T組)。依照文獻(xiàn)方法建立由異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心衰模型[11]，異丙基腎上腺素150 mg/kg，皮下注射，24 h后重復(fù)注射一次。心衰診斷標(biāo)準(zhǔn)為超聲心動(dòng)圖檢查示左室短軸縮短率(FS)≤30%[13]。給藥兩周后行超聲心動(dòng)圖檢查，20只大鼠中除2只外，均達(dá)到心衰標(biāo)準(zhǔn)，提示造模成功。18只大鼠進(jìn)一步隨機(jī)安排接受橙皮素治療(T)或服用等量溶劑乙醇(I)組；橙皮素治療組根據(jù)文獻(xiàn)以乙醇溶解，采用100 mg/kg劑量灌胃，連續(xù)10 d[14]。

1.3.2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組存活大鼠行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉SD大鼠，麻妥，固定大鼠后左前胸備皮，應(yīng)用超聲心動(dòng)儀及頻率為8 MHz的線陣探頭行超聲檢測(cè)，測(cè)量左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)及左室短軸縮短率(FS)。測(cè)定值為三個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.3.3 各組大鼠血清中MDA，SOD，TAOC的檢測(cè) 超聲檢測(cè)結(jié)束后，于大鼠腹主動(dòng)脈取血，經(jīng)4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清，采用硫代巴比妥酸TBA法測(cè)定丙二醛、水溶性四唑鹽WST-1法測(cè)定超氧化物歧化酶、比色法測(cè)定總抗氧化能力。所有檢測(cè)重復(fù)3次，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.3.4 各組心臟組織病理學(xué)改變 取左心室心肌組織用10%甲醛固定，酒精梯度脫水，石蠟包埋。各組石蠟包埋的心臟組織切成5 μm切片，放置于清蛋白覆蓋的玻璃載片上，干燥過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇再水化，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察心肌病理結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較 異丙基腎上腺素組大鼠LVEDD變化不明顯，LVESD較正常組增大(P<0.05)；EF、FS較正常組降低(P<0.05)。橙皮素治療組大鼠LVESD較模型組降低(P<0.05)；EF、FS較異丙基腎上腺素組增高(P<0.05)。橙皮素對(duì)照組各指標(biāo)與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖1、2。

C H I T

注：C為正常組，H為橙皮素對(duì)照組，I為異丙基腎上腺素組，T為橙皮素治療組。與C組相比，*P<0.05；與I組相比，#P<0.05。

2.2 各組大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)比較 與正常組相比，異丙基腎上腺素組大鼠血清MDA明顯高于正常組，SOD、TAOC顯著低于正常組(P<0.05)。詳見表1。異丙基腎上腺素誘導(dǎo)大鼠處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，抗氧化系統(tǒng)受損，抗氧化能力明顯下降。橙皮素治療組MDA明顯低于異丙基腎上腺素組(P<0.05)，SOD、TAOC顯著高于異丙基腎上腺素組(P<0.05)，提示橙皮素具有抗氧化作用，減輕了異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。橙皮素對(duì)照組各氧化應(yīng)激指標(biāo)與正常組比較無明顯差異。詳見表1。

2.3 各組心臟標(biāo)本病理學(xué)改變 肉眼可見正常組及橙皮素對(duì)照組大鼠心臟顏色紅潤(rùn)，異丙基腎上腺素組大鼠心臟顏色發(fā)暗，局灶發(fā)白；光鏡下正常組及橙皮素對(duì)照組大鼠心臟可見心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，異丙基腎上腺素組見局部心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞變性，灶性壞死，組織間隙不規(guī)則增寬，間質(zhì)水腫，橙皮素治療組上述病理改變較異丙基腎上腺素組減輕。詳見圖3。

表1 各組大鼠血清MDA、SOD、TAOC的比較(±s)

注：C為正常組，H為橙皮素對(duì)照組，I為異丙基腎上腺素組，T為橙皮素治療組。

3 討 論

目前，心衰已經(jīng)成為全球主要的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，盡管現(xiàn)代的藥物治療和植入裝置治療，心衰仍有很高的死亡率[15]。心衰是一個(gè)復(fù)雜的臨床綜合征，產(chǎn)生的機(jī)制復(fù)雜，探討其發(fā)病機(jī)制，探索具有心肌保護(hù)作用的藥物是目前研究的熱點(diǎn)。橙皮素在對(duì)抗各種應(yīng)激引起的細(xì)胞及機(jī)體損傷中發(fā)揮多種不同的生物活性[6-7]。研究表明，橙皮素對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及心臟損傷有保護(hù)作用[16- 17]，但確切的機(jī)制仍不清楚。

心肌收縮性減弱是心衰發(fā)生的基礎(chǔ)，引起心肌收縮性減弱的發(fā)生機(jī)制之一是心肌細(xì)胞數(shù)量減少，心肌細(xì)胞數(shù)量減少主要見于兩種形式即：心肌細(xì)胞壞死和心肌細(xì)胞凋亡。異丙基腎上腺素可引起心肌缺血甚至心肌梗死，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死；同時(shí)異丙腎上腺素可引起氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[18]，最終導(dǎo)致心衰的發(fā)生。大劑量異丙基腎上腺素皮下注射后，引起大鼠心臟左室收縮功能下降，收縮末內(nèi)徑增加，射血分?jǐn)?shù)下降，心臟功能受損，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。

心肌氧化應(yīng)激引起心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、功能障礙，促進(jìn)心衰的發(fā)生[19]。β腎上腺素受體激動(dòng)劑通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體死亡通路的活化，刺激心肌細(xì)胞凋亡[20- 21]。本研究結(jié)果顯示，異丙基腎上腺素作用后大鼠血清MDA上升，提示機(jī)體促氧化水平上升，而SOD、TAOC降低，提示抗氧化水平下降，機(jī)體存在氧化應(yīng)激；橙皮素治療組大鼠血清MDA下降，SOD、TAOC上升，提示橙皮素減輕異丙基腎上腺素引起的氧化應(yīng)激，改善異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟功能障礙，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]。

橙皮素對(duì)異丙基腎上腺素引起的大鼠心臟功能受損有明顯的改善作用，降低左室收縮末期內(nèi)徑，提高了射血分?jǐn)?shù)及縮短分?jǐn)?shù)，減輕心衰；其可能的原因是橙皮素減輕氧化應(yīng)激，減輕心肌細(xì)胞凋亡，最終減輕了異丙基腎上腺素對(duì)心臟功能的損害。本研究結(jié)果為心衰治療及心衰藥物研發(fā)提供了新思路和作用靶點(diǎn)。該結(jié)果初步探討了橙皮素治療心衰中的臨床療效，由于樣本量較小，需擴(kuò)大樣本量及增加檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)一步探討其保護(hù)作用及具體的機(jī)制。

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Cardioprotective Effects of Hesperetin Against ISO-induced Heart Failure in Rats

Cao Jing， Lv Jiyuan， Zhang Mingsheng， Shi Ruizan， Feng Qiaoai

The First Hospital， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， Shanxi， China Corresponding Author： Lü Jiyuan

R285.5 R289.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.18.006

1672-1349(2017)18-2241-04

2017-05-21)

(本文編輯 王雅潔)

山西省國(guó)際科技合作基金(No.2012081046)

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(太原 030001)；2.山西醫(yī)科大學(xué)；3.山西博愛醫(yī)院

呂吉元，E-mail：13834691242@163.com

信息：曹靜，呂吉元，張明升，等.橙皮素對(duì)異丙基腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心衰的保護(hù)作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(18)：2241-2244.