魏海龍，程俊文，胡傳久，賀 亮，錢 華，李海波，王衍彬，鄒景泉，蔣云鶴

（浙江省林業(yè)科學(xué)研究院 浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點(diǎn)實驗室，浙江 杭州 310023）

牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾工藝研究

魏海龍，程俊文，胡傳久，賀 亮，錢 華，李海波，王衍彬，鄒景泉，蔣云鶴

（浙江省林業(yè)科學(xué)研究院 浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點(diǎn)實驗室，浙江 杭州 310023）

對牛樟芝Antrodia cinnamomea固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)安卓奎諾爾的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。先通過單因素試驗，篩選出小麥Triticum aestivum質(zhì)量、相對濕度、培養(yǎng)溫度3個主要影響參數(shù)，再應(yīng)用響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化。結(jié)果表明，牛樟芝產(chǎn)安卓奎諾爾固態(tài)發(fā)酵最佳條件為：小麥80.82 g，相對濕度58.01%，培養(yǎng)溫度28.48℃，安卓奎諾爾的平均產(chǎn)量可達(dá)259.79 mg·kg-1。

牛樟芝；安卓奎諾爾；固體發(fā)酵；響應(yīng)面

Abstract：Experiments were conducted on optimizing technology for preparation of antroquinonol from solid-state fermented mycelium of Antrodia cinnamomea. Single factor experiment selected important factors such as mass of Triticum aestivum, relative humidity and culture temperature, and technology was optimized by response factor analysis. The result demonstrated that the average yield of antroquinonol reached 259.79 mg/kg with wheat of 80.82 g, relative humidity of 58.01%, culture temperature of 28.48℃.

Key words:Antrodia cinnamomea; antroquinonol; solid-state fermentation; response surface methodology

牛樟芝Antrodia camphorate為我國臺灣道地藥材，屬擔(dān)子菌門Basidiomycete多孔菌科Polyporaceae薄孔菌屬Antrodia[1]，僅寄生于我國臺灣特有的牛樟樹Cinnamomum kanehirai上，一般形成子實體的時間較長[2]。牛樟芝在民間應(yīng)用久，具有保肝、解酒、增強(qiáng)免疫力等活性[3]。

野生牛樟芝子實體由于資源貧乏，價格不菲。為此，研究人員采取人工培養(yǎng)的方式獲得牛樟芝產(chǎn)品。目前人工培養(yǎng)牛樟芝的主要方法包括液態(tài)培養(yǎng)法、椴木栽培法和固態(tài)培養(yǎng)法。由于固態(tài)培養(yǎng)法得到的產(chǎn)物中活性成分與野生牛樟芝子實體活性成分的近似程度較高，且生產(chǎn)原料不受限制等優(yōu)勢得到大范圍推廣。

2007年，Lee等[4]用正己烷萃取牛樟芝產(chǎn)物，得到一個新化合物安卓奎諾爾（antroquinonol），屬于泛醌類化合物，發(fā)現(xiàn)具有良好的生理活性。Yu[5]等人研究顯示，安卓奎諾爾對胰腺癌細(xì)胞具有抑制作用。Kumar[6]等人研究表明安卓奎諾爾可以通過改變信號蛋白活性和mRNA的表達(dá)，顯著抑制三種肺癌細(xì)胞的增殖。

響應(yīng)曲面法（RSM）是建立一個包括各因素的一次項、平方項和任何兩個因素之間的一級交互作用項的數(shù)學(xué)模型。該方法廣泛應(yīng)用于固、液態(tài)生物發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化等生化反應(yīng)優(yōu)化及模型建立中[7]。本實驗以安卓奎諾爾為目標(biāo)產(chǎn)物，利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件來提高牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中安卓奎諾爾的產(chǎn)量，以期為工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

牛樟芝菌株來源于臺灣自然科學(xué)博物館，在浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點(diǎn)實驗室保藏。將保藏的菌種轉(zhuǎn)接至PDA試管斜面上，26℃恒溫培養(yǎng)14 d，待菌絲體長滿斜面，菌絲體顏色泛微紅，4℃立式透明冷藏箱低溫保藏。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 斜面PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂20 g·L-1。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)基 馬鈴薯100 g·L-1，葡萄糖15 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，磷酸二氫鉀（KH2PO4）1 g·L-1，無水硫酸鎂（MgSO4）0.5 g·L-1。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基 葡萄糖15 g·L-1，玉米粒100 g·L-1，麩皮300 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1。

1.2.4 實驗原料與試劑 見表1。

1.2.5 實驗儀器 見表2。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng) 將實驗室保存的菌株活化后轉(zhuǎn)接到斜面PDA試管中，切出2 cm2大小的菌絲塊接種于斜面的中部，在SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng)7 d。

1.3.2 液體種子培養(yǎng) 將活化的斜面菌種切割成2 cm2大小的菌絲塊，接種于液體培養(yǎng)基中，500 mL三角瓶裝培養(yǎng)基150 mL于ZHWY-211B恒溫培養(yǎng)搖床中，26℃，150 r·min-1培養(yǎng)6 d。

1.3.3 固體發(fā)酵培養(yǎng) 將10 mL液體種子液在超凈工作臺內(nèi)接入500 mL固體培養(yǎng)瓶中，拌勻，26℃培養(yǎng)40 d。培養(yǎng)后所得到的產(chǎn)物為牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌質(zhì)。

以上所有培養(yǎng)基均進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，溫度121℃，時間30 min。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 響應(yīng)面法分析實驗 綜合單因素試驗結(jié)果，選擇小麥Triticum aestivum粒質(zhì)量（下文中簡稱為小麥質(zhì)量）、相對濕度、培養(yǎng)溫度3個因素所確定的水平范圍，運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計，用Design Expert 8.05對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。自變量的試驗水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼，試驗因素及水平設(shè)計見表3。

1.5 分析方法

表1 實驗原料與試劑Table 1 Raw material and reagent

表2 實驗儀器Table 2 Experimental apparatus

表3 響應(yīng)面分析因子及水平Table 3 Factors and levels of RSM analysis

1.5.1 生物量的測定 將培養(yǎng)好的牛樟芝菌絲體真空冷凍干燥至恒重，電子天平稱重。

1.5.2 安卓奎諾爾的分析檢測方法 采用高效液相色譜（HPLC）法測定牛樟芝產(chǎn)品中安卓奎諾爾的產(chǎn)量。取干燥后的牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌質(zhì)5 g，加入無水乙醇90 mL，在30℃的HH-2K4型電熱恒溫水浴提取45 min，靜置后0.22μm微膜過濾，進(jìn)行HPLC分析，具體分析條件如文獻(xiàn)[8]所示。

1.5.3 實驗數(shù)據(jù)分析軟件 用Design Expert 8.05進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.2 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，共有17個試驗點(diǎn)，其中12個為析因點(diǎn)，5個零點(diǎn)試驗用以估計試驗誤差。以安卓奎諾爾產(chǎn)量為響應(yīng)值，試驗方案及結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 4 Experiment design and results of RSM

2.2.2 回歸模型建立及方差分析 用Design Expert 8.05對表4實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[9]，獲得安卓奎諾爾產(chǎn)量對小麥、相對濕度和培養(yǎng)溫度的多元二次回歸方程：

表5 回歸模型方差分析Table 5 ANOVA of regression model

由表5可知，以安卓奎諾爾產(chǎn)量為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程的回歸效果達(dá)到極顯著水平，P值均＜0.000 1；模型的決定系數(shù)R2=0.988 1，說明模型與實際實驗擬合較好；校正決定系數(shù)AdjR2=0.972 8，說明該模型能解釋97.28%響應(yīng)值的變化；模型的失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，表5中模型失擬項的P值為0.126 3，大于0.05，表明模型的失擬項不顯著；根據(jù)表5的顯著性分析結(jié)果，各因素的一次項、二次項以及X1X3，X2X3的交互項對安卓奎諾爾的合成均顯著（P＜0.05）影響；分析表明這個模型建立的回歸方程能運(yùn)用于牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾條件優(yōu)化的理論預(yù)測。

2.2.3 響應(yīng)面圖形分析 分別將模型中的小麥、相對濕度及培養(yǎng)溫度的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖1，圖2，圖3所示，各個因素及其相互間的交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處。

圖1 小麥質(zhì)量和相對濕度交互影響安卓奎諾爾產(chǎn)量的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 1 Surface diagram and contour of antroquinonol yield under interaction of wheat and relative humidity

圖2 小麥質(zhì)量和培養(yǎng)溫度交互影響安卓奎諾爾產(chǎn)量的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 2 Surface diagram and contour of antroquinonol yield under interaction of wheat and culture temperature

圖3 相對濕度和培養(yǎng)溫度交互影響安卓奎諾爾產(chǎn)量的曲面圖（A）和等高線（B）Figure 3 Surface diagram and contour of antroquinonol yield under interaction of relative humidity and culture temperature

從圖中可以看出，影響牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾最顯著的因素為培養(yǎng)溫度X3，表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大。小麥質(zhì)量X1和相對濕度X2響應(yīng)面弧度變化平緩，說明對響應(yīng)值影響相對較小。此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[7]。從圖1 ～ 圖3可以看出，X1與X3、X2與X3交互作用顯著。

2.2.4 驗證實驗 根據(jù) Box-Behnken 試驗所得的結(jié)果和二次多項回歸方程，用Design Expert 8.05分析，得到最佳培養(yǎng)條件為：小麥80.82 g，相對濕度58.01%，培養(yǎng)溫度28.48℃，安卓奎諾爾產(chǎn)量理論值可達(dá)267.28 mg·kg-1。

為檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測值與實際值之間的相關(guān)性，即檢驗響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，對牛樟芝在預(yù)測的最優(yōu)發(fā)酵條件下安卓奎諾爾產(chǎn)量進(jìn)行實驗驗證。實驗中小麥質(zhì)量、相對濕度和培養(yǎng)溫度的優(yōu)化值分別為80.82 g，58.01%，28.48℃，三次平行實驗，測得安卓奎諾爾產(chǎn)量分別為259.89 mg·kg-1，262.17 mg·kg-1，257.32 mg·kg-1，安卓奎諾爾平均產(chǎn)量259.79 mg·kg-1，達(dá)到了回歸模型預(yù)測理論值的96.8%，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測牛樟芝安卓奎諾爾產(chǎn)量。

3 結(jié)論

本實驗對牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)安卓奎諾爾的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合生產(chǎn)實踐，選擇小麥質(zhì)量、相對濕度、培養(yǎng)溫度為三個主要參數(shù)，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計及三因素三水平的響應(yīng)面分析，通過二次多項回歸模型進(jìn)行方差分析和回歸擬合，預(yù)測了牛樟芝產(chǎn)安卓奎諾爾最佳固態(tài)發(fā)酵條件為：小麥粉質(zhì)量80.82 g，相對濕度58.01%，培養(yǎng)溫度28.48℃，安卓奎諾爾產(chǎn)量理論值可達(dá)267.28 mg·kg-1。驗證實驗中安卓奎諾爾平均產(chǎn)量可達(dá)259.79 mg·kg-1，與預(yù)測值十分接近，證明了該實驗方法的穩(wěn)定性。

[1] 蔡為民，金群力，蔡青松，等. 牛樟芝人工培養(yǎng)及活性成分與藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 食藥用菌，2015，23（1）：17－23.

[2] Lu M，El-Shazly M，Wu T，et al. Recent research and development of Antrodia cinnamomea [J]. Pharmacol Therap，2013，139（2）：124－156.

[3] 賴敏男. 臺灣牛樟芝發(fā)展史及人工栽培現(xiàn)況[J]. 食藥用菌，2017，（25）2：84－89.

[4] Lee T H，Lee C K，Tsou W L. A new cytotoxic agent from solid-state fermented mycelium of Antrodia camphorata[J]. Plant Medic，2007，73（13）：1412－1415.

[5] Yu C C，Chiang P C，Lu P H，et al. Antroquinonol，a natural ubiquinone derivative, induces a cross talk between apoptosis, autophagy and senescence in human pancreatic carcinoma cells [J]. J Nutr Biochem，2012，23（8）：900－907

[6] Kumar V B，Yuan T C，Liou J W，et al. Antroquinonol inhibits NSCLC proliferation by altering PI3K/mTOR proteins and miRNA expression profiles [J]. Mutat Res，2011，707（1－2）：42－52.

[7] Jin Q L，Zhang Z F，Lu G Y，et al. Antioxidant and DNA damage protecting potentials of polysaccharideextracted from Phellinus baumii using a delignification method[J]. Carbohydr Polym，2016，152，575－582.

[8] 夏永軍，李煒疆，許贛榮. 樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品活性代謝產(chǎn)物分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（8）：86－90.

[9] 張成軍. 實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

Optimizing of Technology for Preparation of Antroquinonol from Antrodia cinnamomea by Response Surface Methodology

WEI Hai-long，CHENG Jun-wen， HU Chuan-jiu，HE Liang，QIAN Hua，LI Hai-bo，WANG Yan-bin，ZOU Jing-quan，JIANG Yun-he
（Key Laboratory of Biological and Chemical Utilization of Forest Resources of Zhejiang, Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou 310023, China）

R282.71

A

1001-3776（2017）04-0039-06

10.3969/j.issn.1001-3776.2017.04.007

2017-01-27 ；

2017-05-24

浙江省科技廳公益技術(shù)研究項目（2013C32095），浙江省農(nóng)業(yè)（食用菌）新品種選育重大科技專項（2016C02057-8）

魏海龍，碩士，副研究員，從事食用藥用菌培育與加工研究；E-mail：whlwlp@163.com。通信作者：程俊文，副研究員，從事食用藥用菌活性成分加工研究；E-mail：jwchengzj@163.com。