陳 樸，于燕波，沈起兵，張淑靜，陳 斌

(中國航天員科研與訓練中心，北京 100094)

超高效液相色譜-串聯(lián)Orbitrap質譜(Q-Exactive)對濕熱質人群代謝表型的分析

陳 樸，于燕波，沈起兵，張淑靜，陳 斌

(中國航天員科研與訓練中心，北京 100094)

采用超高效液相色譜-串聯(lián)Orbitrap質譜(UHPLC-Q/Exactive)技術分析濕熱質(n=8)和平和質(n=13)志愿者尿液，運用質譜數(shù)據(jù)建立無監(jiān)督的火山模型和有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析模型(OPLS-DA)篩選濕熱質的特征代謝物，并分析濕熱質與平和質志愿者間代謝表型的差異，通過特征代謝物的代謝通路分析，研究濕熱質形成的分子作用機理。結果表明，濕熱質和平和質的代謝表型存在顯著差異，通過火山模型可篩選出22個差異顯著的代謝物，通過OPLS-DA模型可篩選出29個特征代謝物。代謝通路分析結果表明，濕熱質志愿者精氨酸和脯氨酸代謝，組氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等通路發(fā)生了紊亂，這為針對濕熱質人群實施精準營養(yǎng)提供了新的思路。

濕熱質；超高效液相色譜-串聯(lián)Orbitrap質譜(UHPLC-Q/Exactive)；代謝表型；代謝通路

Abstract: To reveal the underlining molecular mechanism for the formation of damp and hot constitution, and also promote personalized nutrition for people with that constitution, a dozens of volunteers were recruited to conduct a metabolic research. The volunteers were diagnosed by Chinese physician, and people who were mild constitution as well as damp and hot constitution were screened. Afterwards, the first morning urine was collected and analyzed using ultra high performance liquid chromatography coupled with high revolution orbitrap mass spectrometry (UHPLC-Q/Exactive). Mass spectra were then digitalized into high demission data matrix. Meanwhile, a volcano model and an orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) were performed to screen the most relevant metabolites which could discriminate damp and hot constitution. Furthermore, the pathway analysis was conducted to reveal the molecular mechanism for the formation of damp and hot constitution. Result show that there was a significant difference between damp and mild constitution, and 22 metabolites were proven to be significantly different by volcano model. However, 29 metabolites screened by OPLS-DA model were the most relevant with damp and hot constitution. Pathway analysis base on the screened metabolites showed that dysregulation in arginine and proline metabolism, histidine metabolism, glycine, serine and threonine metabolism might account for the formation of damp and hot constitution.

Keywords： damp and hot constitution; ultra high performance liquid chromatography-Q/Exactive mass spectrometry (UHPLC-Q/Exactive); metabotype; metabolic pathway

體質是一種客觀存在的生命現(xiàn)象，是個體生命過程中在先天遺傳和后天獲得的基礎上，表現(xiàn)出形態(tài)結構、生理機能以及心理狀態(tài)等方面綜合、相對穩(wěn)定的特質。濕熱質是偏頗體質的一種，以濕熱內蘊、面垢油光、口苦、苔黃膩等濕熱表現(xiàn)為主要特征[1]，研究表明，濕熱質與原發(fā)性高血壓[2]及冠心病[3]的形成具有內在的相關性。目前對濕熱質人群的診斷主要靠中醫(yī)專家豐富的經驗和專業(yè)背景，因此多數(shù)人很難發(fā)現(xiàn)自己是濕熱體質。

在自身及環(huán)境因素的作用下，機體生理狀態(tài)受基因、酶和相關蛋白調節(jié)的整體結果為代謝表型，體現(xiàn)在代謝物種類和濃度水平的差別[4]。內源性代謝物是代謝通路產生的中間或終產物[5]，為分子質量低于1 500 u的有機物[6]。代謝表型和體質都是遺傳背景和環(huán)境因素雙重作用的結果，對濕熱質人群代謝表型進行分析可為濕熱質初發(fā)跡象的診斷尋找生物標志物，同時結合代謝通路分析可尋找濕熱質形成的機理。

核磁波譜技術(NMR)[7]和質譜技術(MS)[8]是代謝表型研究中最常用的兩種方法。NMR技術重現(xiàn)性好，譜圖中包含了豐富的化合物結構信息，但其靈敏度有限(1 μg/L)，可分析的尿液中代謝物的數(shù)量在100以下。而MS靈敏度高(1 ng/L)，在尿液中可檢測到的代謝物達幾千個[9]。許多由人體器官產生的內源性代謝物濃度都是ng/L級，因此本研究選用高分辨軌道阱(Orbitrap)質譜研究濕熱質人群的代謝表型，希望提供一種通過監(jiān)測內源性代謝通路的變化預測濕熱質發(fā)生的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

DIONEX UltiMate 3000超高效液相色譜-Orbitrap質譜聯(lián)用儀(UHPLC-Q/Exactive)：美國Thermo Fisher Scientific公司產品，配有可加熱的電噴霧離子源(HESI)及Xcalibur3.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；低溫離心機、渦旋振蕩器、-80 ℃冰箱：美國Thermo Fisher Scientific公司產品；威立雅ELGA超純水機：英國Vivendi Water Systems公司產品。

1.2 主要材料與試劑

槍頭(200 μL和1 000 μL)：美國Thermo Fisher Scientific公司產品；甲酸、乙腈、甲醇：均為色譜純，美國Honeywell公司產品。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 Hypersil GOLD UHPLC色譜柱(150 mm×2.1 mm×1.9 μm)；柱溫(40±1) ℃；樣品盤溫度(4±0.5) ℃；流動相：0.1%甲酸-水溶液(A相)，0.1%甲酸-乙腈溶液(B相)；梯度洗脫；洗脫程序：0～6 min、5%～15%B，6～9 min、15%～30%B，9～12 min、30%～40%B，12～15 min、40%～90%B，15～18 min、90%～90%B，18～18.1 min、90%～5%B，18.1～20 min、5%～5%B；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL。

1.3.2質譜條件 掃描模式選用Full MS/dd-MS2(Top5)，電噴霧離子源(ESI)；載氣采用高純氮氣(純度>99.5%)，鞘氣流速 35個單位，輔氣流速15個單位，吹掃氣流速0個單位；噴霧電壓 3.5 kV；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、35%、55%；毛細管溫度320 ℃，離子透鏡電壓頻率(S-lens RF level)為 50，輔氣熱源溫度350 ℃；正/負離子掃描模式，質量掃描范圍分別為m/z50～750和m/z750～1 500；二級質譜采用動態(tài)排除TopN=5。

1.4 實驗方法

1.4.1納入標準 共招募志愿者84人。經問卷調查后排除實驗期間有明顯疾病特征，有藥物治療(在實驗前3個月內使用過抗生素類藥物)及吸煙、酗酒的志愿者，剩余志愿者經兩名中醫(yī)專家進行體質診斷，并通過問卷記錄每個人的日常飲食和睡眠、情緒等生理狀態(tài)。篩選出平和質和濕熱質志愿者共21名(年齡23～56歲，男14人，女7人)，其中有13名平和質(男性7名)和8名濕熱質(男性5名)志愿者。志愿者實驗前熟悉并簽署《志愿者受試情況知情書》，實驗內容經中國航天員中心倫理委員會審批。

1.4.2志愿者尿液采集和保存 收集志愿者的晨尿，尿液采集前2天控制飲食，即早、中、晚三餐統(tǒng)一飲食，三餐種類不必一致。單次采集每名志愿者15 mL尿液，分裝于2 mL離心管中，每份1.5 mL；分裝后的尿樣在4 ℃下以11 187 r/min離心10 min，然后轉移上清液至2 mL離心管中；每個尿樣取1 mL，渦旋混勻后等分為若干份，每份1.5 mL，作為質控樣本(QC樣本)，然后將QC樣本分配到每批樣本中(每批不少于4個QC)；所有樣本分析前均保存于-80 ℃冰箱中，尿樣收集管經滅菌處理，提前置于冰上冷凍。

1.4.3樣本的UHPLC-Q/Exactive分析 尿液提前于4 ℃冰箱中解凍，然后以10 000 r/min均質1 min；再于4 ℃下以11 187 r/min離心10 min，取200 μL上清液，加入800 μL超純水后，經UHPLC-Q/Exactive分析，然后分別進行正離子和負離子模式分析。完成所有樣本分析后，色譜柱經純水-甲醇溶液梯度洗脫，并最終保存于純甲醇中。

1.4.4圖譜預處理 將得到的原始圖譜導入到SIEVE 2.1進行基線校正、相位校正、峰對準和初步分析，設定峰強度閾值為5×106，積分間隔為m/z10，將原始質譜數(shù)據(jù)轉換成數(shù)據(jù)矩陣。

1.4.5數(shù)據(jù)分析 將得到的數(shù)據(jù)矩陣導入R3.2.4中進行火山分析，用SIMCA P+14.0建立模式識別模型，數(shù)據(jù)中心化后建立主成分模型(PCA)排除數(shù)據(jù)中可能存在的異常點；經單變量歸一化后建立OPLS-DA模型，用OPLS-DA載荷的VIP值及相關系數(shù)篩選與濕熱質人群顯著相關的特征代謝物。所篩選的特征代謝物導入MetaboAnalyst 3.0(http:∥www.metaboanalyst.ca/faces/ModuleView.xhtml)進行代謝通路分析。

2 結果與討論

2.1 志愿者尿液的總離子流圖

志愿者尿液的總離子流圖示于圖1，可以看到，m/z50～750之間的峰信號強度比m/z750～1 500之間的峰信號強度高10倍以上。通過超高效液相色譜對代謝物進行初步分離，再經過掃描范圍的切換，對濃度差別較大的代謝物進行分析，可避免低含量代謝物峰被高含量代謝物峰覆蓋。此外，分別在正、負離子模式下掃描尿液，然后對不同類代謝物進行分析，志愿者尿液的質譜圖示于圖2。可知，色譜峰中同一保留時間的代謝物通過質譜檢測的動態(tài)排除(TopN=5)得到了進一步的分離。圖2中歸屬了5個化合物，雖然這5個代謝物的相對豐度差別較大，但仍然可以被同時檢測到，代謝物的質荷比(m/z)質量偏差(質譜檢測值與理論值差的絕對值)均小于2×10-6，這使得后續(xù)代謝物的歸屬更加精確。此外MS的靈敏度很高，即便是相對豐度很低的代謝物(如m/z789.340 09的代謝物)也可獲得較高的靈敏度(R=37 600)，使代謝物信號峰的信噪比高。代謝物的充分分離和精確歸屬是代謝機制研究的先決條件，由以上結果可以看出，UHPLC-Q/Exactive對尿液代謝物的分離效果好、質量精度和靈敏度都較高，可檢測出的代謝物大于1 000個(質譜經SIEVE 2.1處理后正負模型下所歸屬的化合物個數(shù))。Bouatra等[10]采用MALDI-TOF MS法分析尿液中代謝物，檢測出127個化合物，對比可知，該方法能夠分析更多低含量的內源性代謝物，這使?jié)駸豳|代謝表型代謝輪廊的分析更加全面。

注：a.正離子模式， m/z 50～750；b.正離子模式， m/z 750～1 500；c.負離子模式，m/z 50～750；d.負離子模式，m/z 750～1 500圖1 尿液樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of a urine sample

圖2 尿液樣品的質譜圖Fig.2 Mass spectrum of urine sample

2.2 濕熱質人群的火山模型

志愿者經中醫(yī)專家診斷后，將體質分為平和質(13名)和濕熱質(8名)兩種。中醫(yī)認為，平和質屬于身心健康體質，濕熱質屬于偏頗體質。在正離子模式下，m/z50～750范圍內，志愿者尿液樣本的火山圖示于圖3a，通過火山模型篩選的代謝物列于表1?？芍?，在濕熱質和平和質間差異顯著的代謝物有22個，其中，磷脂酰肌醇(PE(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z), PE)、磷脂酰乙醇胺(PIP(18:1(9Z)/18:1(11Z)), PIP)、榛葉素B(heterophylliin B, HOB)、醛糖苷((3b,21b)-12-oleanene-3,21,28-triol 28-[arabinosyl-(1->3)-arabinosyl-(1->3) -arabinoside], OTAA)、硫代石膽酸(sulfolithocholic acid, SLA)、亞麻酸(flaxseed lignan-HMGA oligomer, HMGA)等外源性特征代謝物濕熱質志愿者的尿液排泄量比平和質高很多(FC>3，p<0.05)。甘油磷脂(PGP)、磷脂酰肌醇(PIP)、磷脂酰乙醇胺(PE)是磷脂分解后的產物，參與細胞對脂質的吸收、轉運和排泄，這3個代謝物排泄量的增加說明細胞內脂質代謝異常，可能與濕熱質面垢油光、易生痤瘡的臨床特征相關。魯明源[2]通過中醫(yī)理論評析的方法探究了濕熱質形成的內在原因，結果表明，濕熱質人群脂質代謝異常，與高脂血癥的形成有著內在的關系。榛葉素B、醛糖苷(OTAA)、硫代石膽酸、亞麻酸(HMGA)是飲食成分的特征代謝產物，濕熱質人群這些代謝物的排泄量會增加，說明濕熱質人群對食物成分的代謝能力不同?；鹕侥Ｐ退Y選的指標中存在假陽性和假陰性，圖3b是存在于數(shù)據(jù)中的假陰性指標，這類指標在濕熱質和平和質間差異顯著，但受異常點影響而成為不顯著的指標；圖3c是存在于數(shù)據(jù)中的假陽性指標，這類指標在濕熱質和平和質間差異不顯著，但受異常點影響而成為顯著的指標。人體個體差異大可能是異常點產生的主要原因。此外，火山模型沒有考慮每個代謝物與濕熱質、平和質人群的相關性，尚不能夠全面地揭示濕熱質形成的原因。

注：FC>1表示該代謝物濕熱質志愿者尿液排泄量高于平和質志愿者圖3 志愿者尿液的火山模型Fig.3 Volcano plot of urine derived from volunteers

代謝物1Metabolites加合模式2Adduct質荷比m/z質量偏差3Delta顯著性p倍性變化4FC肌肽Sarcosine2M+ACN+H220.1290.00080.0123.4601-甲基組氨酸1-MethylhistidineM+CH3OH+H202.1190.00110.0173.480肌酐Creatine2M+ACN+H304.1730.00220.0310.270單酰甘油MG(0:0/14:0/0:0)M+2Na174.1120.00020.0360.460亞酒石酸Hydroxypropanedioicacid2M+NH4258.0460.00040.0440.5005-羥基賴氨酸5-HydroxylysineM+ACN+H204.1340.00050.0482.310皂皮酸QAM+H+K833.3320.00630.0173.234磷脂酰肌醇PIP(18:1(9Z)/18:1(11Z))M+NH4960.5570.00700.0205.776磷脂酰乙醇胺M+2Na-H884.5180.00550.0312.006PE(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)醛糖苷OTAAM+2K+H931.4220.00310.0383.944千日紅紫素-II GomphreninII2M+NH41410.3940.00610.0400.337榛葉素B HeterophylliinBM+ACN+2H957.6070.00850.0403.986硫代石膽酸Sulfolithocholicacid2M+ACN+Na976.5250.00690.0413.9032-氧-咖啡酰羥基檸檬酸2-O-Caffeoylhydroxycitricacid2M+ACN+Na804.1230.00790.0422.845甘油磷脂PGP(18:1(9Z)/20:3(5Z,8Z,11Z))M+2ACN+H961.5680.00000.0483.416紫羅蘭醇α-IonolO-[arabinosyl-(1->6)-glucoside]2M+K1015.4870.00450.0492.406尿囊素-5-丙酮酸Hydantoin-5-propionicacidM—H171.0410.00040.0270.479丙基硫酸PropylsulfateM+Hac—H199.0280.00020.0302.332異丙基-3,4-二羥基苯酚-2-羥基丙酸IsopropylM—H239.0920.00060.0362.1933-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate亞麻酸Flaxseedlignan-HMGAoligomerM—2H1642.6310.01300.0033.789甘草素LicoagroneM+Br742.2780.00250.0052.886茄子素MelongosideNM+Hac—H920.4980.00710.0082.574

注：1) 代謝物中QA為Quillaic acid 3-[galactosyl-(1->2)-[xylosyl-(1->3)]-glucuronide] 28-[6-acetyl-glucosyl-(1->3)-[xylosyl- (1->4)- rhamnosyl-(1->2)]-4-acetyl-fucosyl] ester；OTAA為(3b,21b)-12-Oleanene-3,21,28-triol 28-[arabinosyl-(1->3)-arabinosyl-(1->3) -arabinoside]；

2) M指代謝物的化學式，ACN是乙腈，Hac是乙酸，CH3OH是甲醇；

3) Delta是所歸屬代謝物的分子質量理論值與測定值之間的偏差；

4)FC是指標在不同組之間的差異倍數(shù)，其中FC>1表示該代謝物濕熱質志愿者尿液排泄量高于平和質志愿者

2.3 濕熱質人群的正交偏最小二乘模型

正交偏最小二乘模型(OPLS-DA)是有監(jiān)督的模式識別模型，它將存在于數(shù)據(jù)中的變異信息分解為與組間差異相關的變量(與實驗因素相關)和與組間差異不相關的變量(與非實驗因素相關)，通過OPLS-DA模型可以篩選出不同組之間差異顯著的指標[11]。在正離子模式下，m/z50～750質量范圍內，志愿者尿液樣本的OPLS-DA空間投影示于圖4，可以看出，濕熱質和平和質之間代謝表型具有顯著差異。OPLS-DA模型衡量各指標在組間差異大小，以及相關性的指標為VIP值和皮爾遜相關系數(shù)(Pearson’s coefficient)，通過這兩個值篩選出濕熱質人群的特征代謝物列于表2。在篩選出的29個特征代謝物中，包含與營養(yǎng)成分、腸道菌群相關的外源性代謝產物以及代謝通路所產生的內源性代謝產物。

在特征代謝物中，多肽氨(endomorphin-1)是下丘腦孤束的代謝產物，該代謝物與下丘腦調節(jié)人體沖動、鎮(zhèn)定、生物節(jié)律等行為有關，濕熱質人群尿液中多肽氨排泄的增加可能與其容易心煩氣躁的癥候有關。陳遠源等[12]研究發(fā)現(xiàn)，濕熱質人群自主神經調節(jié)功能紊亂，這可能也與多肽氨排泄的增加有關。5-甲硫基-2,3-二氧戊基磷酸(5-(methylthio)-2,3-dioxopentyl phosphate, MDP)是合成氨基酸的中間體，同時也是蛋氨酸和半胱氨酸的代謝產物；烯丙基甲醇(3-buten-1-ol, But)是脂肪酸和油脂的代謝產物；3-羥基二氫大豆苷元(3′-hydroxy-dihydrodaidzein, HDD)是多酚的代謝產物；吲哚乙酸(indoleacetic acid, IAA)、亞?；撬?hypotaurine, Hyp)和N,N-二甲苯胺(N,N-dimethylaniline, DMA)是腸道菌群-人體共代謝產物；肌酐(greatine, Cre)是尿素循環(huán)的代謝中間產物；鞘氨醇-1-磷酸(sphinganine 1-phosphate, SP)是鞘糖脂和鞘脂類的代謝產物；膽酸(nutriacholic acid, NCA)能夠促進脂肪、甾醇和維生素在肝臟和腸道中的轉運；豆甾醇葡萄糖苷(stigmasteryl glucoside, SG)、羥基二氫香茅醇(hydroxycitronellol, HCL)、甲硫酰丁酸鹽(methionyl butyrate, MBA)是與飲食相關的外源性代謝產物。濕熱質與平和質志愿者尿液特征代謝物排泄量的顯著差異表明：濕熱質志愿者氨基酸代謝、脂質代謝、腸道菌群結構及對飲食成分的代謝能力可能發(fā)生了紊亂，也間接地說明了濕熱質人群對營養(yǎng)素的吸收、利用功能減弱。楊柳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，濕熱質人群多喜好油炸、肥膩的食物，且形體多偏肥胖；祁麗麗等[14]研究也表明，人血脂異常與濕熱質相關，同時脂質代謝和腸道菌群紊亂也是形成肥胖的主要因素[15]。這些研究成果進一步驗證了濕熱質人群脂質代謝異常的結果。

注：a.ESI+，m/z 50～750；b.ESI+，m/z 750～1 500；c.ESI-，m/z 50～750；d.ESI-，m/z 750～1 500圖4 志愿者尿液數(shù)據(jù)的OPLS-DA投影圖Fig.4 Scatter plot of urinary OPLS-DA model derived from volunteers

特征代謝物1Metabolites加合模式Adduct化學式Chemicalformula質荷比m/z質量偏差Delta載荷VIP相關系數(shù)2Correlationcoefficient內嗎啡肽-1Endomorphin-1M+2HC34H38N6O5306.1520.00032.3290.7035-甲硫基-2,3-二氧戊基-磷酸M+NH4C6H11O6PS260.0350.00022.2870.6785-(Methylthio)-2,3-dioxopentylphosphate3-丁烯-1-醇3-Buten-1-olM+KC4H8O111.0200.00012.2720.6343-羥基-二氫大豆苷元M+HC15H12O5273.0760.00092.2580.6743-Hydroxy-dihydrodaidzein吲哚乙酸IndoleaceticacidM+ACN+HC10H9NO2217.0970.00112.1880.668反式-3-羥基可替寧葡萄糖苷酸M+HC16H20N2O8369.1290.00032.1340.639trans-3-Hydroxycotinineglucuronide'亞?；撬酘ypotaurine2M+HC2H7NO2S219.0470.00082.133-0.647碘酸鹽IodateM+ACN+HIO3216.9230.00072.1220.624N,N-二甲基苯胺M+NH4C8H11N139.1230.00002.1210.630N,N-Dimethylaniline肌酐Creatine2M+ACN+HC4H9N3O2304.1730.00222.0760.604豆甾醇葡萄糖甙M+2NaC35H58O6310.2010.00052.0750.629Stigmasterylglucoside羥基香茅醇M+3HC10H22O259.0610.00032.058-0.624(±)-Hydroxycitronellol1-磷酸鞘氨醇M+CH3OH+HC18H40NO5P414.2980.00222.0490.607Sphinganine1-phosphate膽汁酸NutriacholicacidM+ACN+HC24H38O4432.3110.00012.0410.602甲硫氨?；∷猁}M+ACN+HC8H16O2S218.1210.00012.0160.607Methionylbutyrate2-吡咯烷酮2-PyrrolidinoneM+2ACN+HC4H7NO168.1130.00012.0030.608萜烯AnnuiononeCM-HC13H20O3223.1340.00002.3420.647精氨琥珀酸ArgininosuccinicacidM+K-2HC10H18N4O6327.0710.00182.2750.6342-己基噻吩2-Hexylthiophene2M-HC10H16S335.1870.00032.2960.6303-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酮CMPFM-HC12H16O5239.0920.00052.1820.6163-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酮M+ClC13H12N2O3279.0540.00082.1590.607Indolylacryloylglycine荊芥素NepetasideM-HC16H26O8345.1550.00052.2100.607L-3-氨基丁酰-輔酶AM+HC25H43N8O17P3S853.1750.00222.4000.651L-3-Aminobutyryl-CoA扁桃腈蕓香糖苷2M+ACN+NaC20H27NO10946.3430.00282.2350.610Mandelonitrilerutinoside甘草素LicoagroneM+BrC45H42O10821.1970.00232.4140.653谷氨酰-谷氨酸3M-HC10H18N4O5821.3760.00192.4450.650Glutaminyl-glutamine辛?；?輔酶AOctanoyl-CoAM-HC29H50N7O17P3S892.2120.03262.4200.643葫蘆巴素TrigofoenosideBM+Hac-HC45H76O19979.5120.00712.3090.628肉豆蔻酰五肽APGPREnterostatin2M-HC21H36N8O6991.5440.00532.2880.615

注：1.代謝物中CMPF為3-Carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropionic acid； 2.相關系數(shù)為正表示濕熱質志愿者尿液中該代謝物的排泄水平高于平和質，相關系數(shù)的絕對值大于0.6時表示該代謝物在不同體質間的差異達到顯著水平

2.4 代謝通路分析

體質的形成是人體遺傳背景和環(huán)境因素雙重作用的結果。人的各臟腑、器官長期受不利環(huán)境、飲食等因素的影響，其功能會發(fā)生改變，最終引起代謝通路的改變，產生相應的內源性特征代謝物。從濕熱質內源性代謝物的尿液排泄水平可知，它與平和質之間存在顯著差別，說明濕熱質人群代謝通路可能發(fā)生了紊亂。通過對內源性代謝物進行代謝通路分析，可以發(fā)現(xiàn)濕熱質形成的內在原因。

特征代謝物的代謝通路分析結果示于圖5和表3?？梢钥闯觯瑵駸豳|與平和質相比，存在顯著差別的代謝通路有精氨酸、脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism)，組氨酸代謝(histidine metabolism)和甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝(glycine, serine and threonine metabolism)。

圖5 代謝通路分析結果Fig.5 Result of pathway analysis

代謝通路名稱Pathwayname顯著性p影響因子Impact代謝物Metabolites精氨酸、脯氨酸代謝0.0180.054精氨琥珀酸、肌酐、肌肽組氨酸代謝0.0420.0141-甲基組氨酸、尿囊素-5-丙酮酸甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝0.0490.050肌酐、肌肽

精氨酸和脯氨酸代謝通路連接了人體精氨酸、鳥氨酸、脯氨酸、瓜氨酸和谷氨酸的共代謝反應。在該代謝通路中，精氨酸是非常關鍵的一種成分，是合成鳥氨酸的前體物質。鳥氨酸在肝臟中作為尿素循環(huán)中關鍵的中間代謝產物，在外周組中用于合成谷氨酸和谷氨酰胺，在小腸上皮細胞中用于合成精氨酸和脯氨酸[16]。該代謝通路對維持人體小腸、肝臟和腎臟的正常功能發(fā)揮了重要作用。所篩選的琥珀酸、肌酐、肌肽3個特征代謝物均為精氨酸在腎臟代謝的中間體，且其在濕熱質人群尿液中的排泄量高，說明這些中間體在人體內的利用率下降，該代謝通路功能減弱。濕熱質人群普遍存在早期慢性腎臟病[18]，這可能與濕熱質人群精氨酸和脯氨酸代謝通路的紊亂有關；組氨酸代謝對核酸、嘌呤、嘧啶及ATP(Adenosine Triphosphate)的合成發(fā)揮著重要作用，其合成與腸道菌群結構密切相關，腸道菌群也可將組氨酸降解產生組胺，進而調節(jié)血管的收縮和擴張。在該代謝通路中，代謝中間體1-甲基組氨酸的排泄量濕熱質高于平和質，而尿囊素-5-丙酮酸的排泄量低于平和質，組氨酸合成1-甲基組氨酸的通路主要用于組氨酸的循環(huán)；而尿囊素-5-丙酮酸主要用于谷氨酸的合成，該代謝物排泄量的減少說明代謝通路減弱，而該代謝通路主要在肝臟中進行，說明濕熱質人群肝臟的功能可能發(fā)生了紊亂。甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸是氨基酸合成、分解的代謝通路，該代謝通路實現(xiàn)了氨基酸之間的相互轉化(如甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸)，可利用非必需氨基酸合成必需氨基酸，從而維持人體的正常生理功能[17]?！吨兴幋筠o典》中記載了濕熱體質調節(jié)的中藥，其中包括43味降脂功效藥、10味活血化瘀藥、3味健脾藥、3味補肝腎藥[19]，這間接地說明了濕熱質人群肝臟、腎臟、脾等器官代謝功能異常，同時說明了通過代謝通路的分析動態(tài)監(jiān)測濕熱質跡象的出現(xiàn)具有一定的可行性。

3 結論

通過對濕熱質人群的代謝表型研究發(fā)現(xiàn)，濕熱質人群脂質代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，組氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路發(fā)生了紊亂，這是濕熱質跡象的開端，代謝通路的長期紊亂導致了濕熱質偏頗體質的形成。未來有望通過監(jiān)測這些內源性代謝通路的變化預測濕熱質的發(fā)生，這為濕熱質人群實施精準營養(yǎng)提供了新的思路。

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陳 樸(1990—)，男(漢族)，陜西柞水人，碩士研究生，航天營養(yǎng)與食品工程專業(yè)。E-mail: chenpucpo@163.com

陳 斌(1962—)，男(漢族)，湖南人，研究員，從事航天營養(yǎng)與食品工程研究。E-mail: metabolomics_acc@163.com

時間：2016-12-28；網絡出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20161228.0935.018.html