曾皓月， 王之， 方美娟， 王立強(qiáng)

(1. 華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 福建 泉州 362021；2. 蘭州軍區(qū)總醫(yī)院 臨床藥學(xué)科， 甘肅 蘭州 730000；3. 廈門大學(xué) 藥學(xué)院， 福建 廈門 361000)

pDNA-巰基殼聚糖納米粒的制備及Box-Behnken效應(yīng)面法工藝優(yōu)化

曾皓月1， 王之2， 方美娟3， 王立強(qiáng)1

(1. 華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 福建 泉州 362021；2. 蘭州軍區(qū)總醫(yī)院 臨床藥學(xué)科， 甘肅 蘭州 730000；3. 廈門大學(xué) 藥學(xué)院， 福建 廈門 361000)

以巰基殼聚糖(TCS)為基因載體，采用離子交聯(lián)法制備能用于基因口服研究的質(zhì)粒DNA-巰基殼聚糖納米粒(pDNA-TCS-NPs).分別以TCS質(zhì)量濃度、三聚磷酸鈉(TPP)質(zhì)量濃度、pH值和轉(zhuǎn)速為考察對(duì)象，以pDNA-TCS-NPs粒徑和Zeta電位為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用4因素3水平Box-Behnken 效應(yīng)面法篩選最佳制備工藝，并對(duì)其外觀形態(tài)，包封率等體外性質(zhì)進(jìn)行考察.結(jié)果表明：TCS質(zhì)量濃度為0.80 mg·mL-1，TPP質(zhì)量濃度為0.65 mg·mL-1，pH=5.3，轉(zhuǎn)速為2 000 r·min-1是最優(yōu)制備工藝，可制得粒徑為(134.21±1.34) nm，Zeta電位為(24.36±0.29) mV，包封率在(80.26±0.56)%，形狀規(guī)則且分散良好的pDNA-巰基殼聚糖納米粒；Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可用于預(yù)測(cè)和優(yōu)化pDNA-TCS-NP制備工藝優(yōu)化篩選.

巰基殼聚糖； 質(zhì)粒DNA； 納米粒； Box-Behnken效應(yīng)面法； 離子交聯(lián)法； 工藝優(yōu)化

Abstract： Preliminary exploration to prepare plasmid DNA-loaded thiolated chitosan nanoparticles (pDNA-TCS-NPs) which can be used for gene oral administration was investigated. Using TCS as gene carriers, the pDNA-TCS-NPs were prepared by the ionic cross-linking method. The effects of the concentrations of TCS and TPP, pH value and stirring speed were investigated on the particle diameter and zeta potential of the pDNA-TCS-NPs. In addition, the formula was optimized by Box-Behnken design and response surface method with four factors and three levels, and the physic-chemical properties such as the shape and encapsulation efficiency were also studied. The results showed that the optimal formula was as follows: TCS concentration 0.80 mg·mL-1, TPP concentration 0.65 mg·mL-1, pH 5.3, and stirring speed 2 000 r·min-1. Particle diameter was (134.21±1.34) nm, zeta potential was (24.36±0.29) mV, and efficiency was (80.26±0.56)%.under the optimal conditions. The pDNA-TCS-NPs showed uniform spherical solid particles with regular shape and ideal uniformly dispersion. It′s also confirmed that the Box-Behnken experimental design and response surface method could be used to predict and optimize the pDNA-loaded TCS nanoparticles.

Keywords： thiolated chitosan； plasmid DNA； nanoparticle； Box-Behnken design and response surface method； ionic cross-linking method； formula optimization

如何用藥學(xué)技術(shù)手段提高口服基因藥物在體內(nèi)外的穩(wěn)定性，從而提高口服基因轉(zhuǎn)染效率，是當(dāng)前口服基因治療的首要問(wèn)題[1-2].通過(guò)采用高分子材料制備出直徑1 000 nm以內(nèi)的納米粒.以此構(gòu)建出非病毒口服基因藥物遞送系統(tǒng)，因其具有提高基因藥物穩(wěn)定性，促進(jìn)生物膜的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，且靶向性、順應(yīng)性好等諸多優(yōu)點(diǎn)已成為一大研究熱點(diǎn)[3].與使用其他非病毒納米粒制備的載體相比，以巰基殼聚糖為基礎(chǔ)的口服納米遞送系統(tǒng)，具有以下3個(gè)主要特點(diǎn)：1) 巰基殼聚糖中游離的巰基經(jīng)氧化可形成二硫鍵，其結(jié)合力遠(yuǎn)強(qiáng)于靜電效應(yīng)可提高載體的胞外穩(wěn)定性[4]；2) 巰基殼聚糖上的巰基通過(guò)與腸黏膜和腸上皮細(xì)胞表面富含半胱氨酸殘基的粘蛋白形成二硫鍵，發(fā)揮黏附作用延長(zhǎng)所載藥物滯留時(shí)間，促進(jìn)藥物吸收；3) 當(dāng)其入胞后，在細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的參與下，破壞其二硫鍵，將基因藥物與載體解離令目的基因得以釋放[5-6].響應(yīng)曲面法(RSM)是通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素進(jìn)行考察，對(duì)其相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析，從而確定出最佳實(shí)驗(yàn)方案，并利用計(jì)算機(jī)技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的優(yōu)化方法.目前，最常用有星點(diǎn)設(shè)計(jì)法(CCD)，Box-Behnken Design(BBD)法等[7].本文通過(guò)采用 Box-Behnken效應(yīng)面法，對(duì)質(zhì)粒DNA-巰基殼聚糖納米粒(pDNA-TCS-NPs)的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；集熱式磁力攪拌器(河南省鞏義市華儀儀器有限公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；Malvern ZEN-3600型粒徑測(cè)試儀(英國(guó)馬爾文公司)；LGJ-18S型冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技有限公司)；透射電鏡(日本Nikon公司).

巰基殼聚糖(華僑大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)；三聚磷酸鈉(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)?；?pDNA，5.3 kb，華僑大學(xué)實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增和提純)；其余常規(guī)試劑(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

1.2pDNA-TCS-NPs的制備

采用離子交聯(lián)法制備質(zhì)粒DNA-巰基殼聚糖納米粒(pDNA-TCS-NPs).取適量巰基殼聚糖，緩慢加入0.1 mol·L-1的醋酸溶液，在37 ℃下攪拌溶解，并調(diào)節(jié)其pH值，制備出巰基殼聚糖溶液；然后，向溶液中緩慢加入1 μg的pDNA，另取適量的TPP溶于去離子水中，將TPP溶液以15 滴·min-1的速度緩慢加入到巰基殼聚糖溶液中，攪拌30 min，于超純水中透析36 h(截留相對(duì)分子質(zhì)量為3.5 u)，凍干可得pDNA-TCS-NPs.

1.3pDNA-TCS-NPs體外性質(zhì)初步評(píng)價(jià)

1.3.1 形態(tài)測(cè)定 采用復(fù)染法對(duì)其形態(tài)進(jìn)行測(cè)定，吸取適量濃縮pDNA-TCS-NPs溶液置于銅網(wǎng)中，使用磷鉬酸銨溶液進(jìn)行負(fù)染，待其風(fēng)干后，采用透射電鏡拍攝納米粒的形態(tài).

1.3.2 粒徑與Zeta電位的測(cè)定 使用去離子水對(duì)經(jīng)過(guò)透析濃縮的pDNA-TCS-NPs懸液進(jìn)行稀釋，采用馬爾文粒徑測(cè)試儀測(cè)量其粒徑(d)和Zeta電位(E).

1.4Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化

選取對(duì)pDNA-TCS-NPs粒徑和電位影響較為顯著的4個(gè)因素，即TCS質(zhì)量濃度(A)，TPP質(zhì)量濃度(B)，pH值(C)，轉(zhuǎn)速(D)，在3個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化研究.效應(yīng)面因素水平，如表1所示.

表1 效應(yīng)面因素水平表Tab.1 Factors and levels of response surface method

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1Box-Behnken效應(yīng)面法設(shè)計(jì)結(jié)果

2.1.1 擬合方程 以Y1(粒徑，d)和Y2(電位，E)為相應(yīng)指標(biāo)，進(jìn)行29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示.

表2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Tab.2 Box-Behnken experimental design and response values

利用Design-Expert 8.0軟件，對(duì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)進(jìn)行分析.以粒徑Y(jié)1作為因變量，通過(guò)擬合，得出的方程為

以電位Y2作為因變量，通過(guò)擬合，得出的方程為

2.1.2 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 根據(jù)擬合方程的相關(guān)系數(shù)可知，該模型擬合度良好，可以用來(lái)作為TCS-NP的分析和預(yù)測(cè)，結(jié)果如表3所示.

表3 檢測(cè)回歸方程中系數(shù)的顯著性Tab.3 Significance test of coefficient in regressionequation

根據(jù)擬合方程(1),(2)，運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件，繪制因素A(ρ(TCS))，B(ρ(TPP))，C(pH)，D(n)對(duì)Y1(d)，Y2(E)的響應(yīng)面圖[7]，如圖1所示.

(a) A-B-Y1 (b) A-B-Y2

(c) A-C-Y1 (d) A-C-Y2

(e) A-D-Y1 (f) A-D-Y2

(g) B-C-Y1 (h) B-C-Y2

(i) B-D-Y1 (j) B-D-Y2

(k) C-D-Y1 (l) C-D-Y2圖1 各因素與響應(yīng)值的三維圖Fig.1 Three-dimensional plot of independent factors and response values

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定適當(dāng)?shù)脑u(píng)價(jià)指標(biāo)范圍，可以得到最優(yōu)制備工藝，即TCS質(zhì)量濃度為0.82 mg·mL-1，TPP質(zhì)量濃度為0.67 mg·mL-1，pH值為5.27，轉(zhuǎn)速為1 992.23 r·min-1，則由此可預(yù)測(cè)粒徑為130.215 nm，電位為25 mV.

圖2 pDNA-TCS-NPs納米粒透射電鏡照片F(xiàn)ig.2 SEM photograph of plasmid DNA-loaded thiolated chitosan nanoparticles

2.1.3 優(yōu)化工藝驗(yàn)證 為驗(yàn)證最優(yōu)制備工藝及模型的準(zhǔn)確性，并考慮實(shí)際操作的可行性，將各個(gè)處方因素進(jìn)行細(xì)微調(diào)整，即TCS質(zhì)量濃度為0.80 mg·mL-1，TPP質(zhì)量濃度為0.65 mg·mL-1，pH值為5.3，轉(zhuǎn)速為2 000 r·min-1.按照上述工藝制備出3批pDNA-TCS-NPs，并對(duì)其粒徑、電位、包封率進(jìn)行測(cè)試，可得粒徑為(134.21±1.34) nm，電位為(24.36±0.29) mV，包封率為(80.26±0.56)%.通過(guò)透射電鏡觀察pDNA-TCS-NPs，發(fā)現(xiàn)其外觀為較規(guī)則的圓形，如圖2所示.

3 討論

對(duì)殼聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾，能夠進(jìn)一步改善殼聚糖基因藥物運(yùn)輸載體的穩(wěn)定性、運(yùn)輸效率及轉(zhuǎn)染效率等性能.Jiang等[8]通過(guò)對(duì)聚乙二醇?xì)ぞ厶墙又垡蚁﹣啺罚苽涑隹捎糜诟渭?xì)胞的基因藥物運(yùn)輸載體.Kwon等[9]采用葉酸修飾殼聚糖，制備出能夠在葉酸陽(yáng)性受體細(xì)胞表達(dá)的基因藥物載體.研究采用經(jīng)巰基修飾的殼聚糖，制備出可用于口服的納米藥物運(yùn)輸載體.

在進(jìn)行多變量多水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，采用Box-Behnken 效應(yīng)面法，可以考察各變量間交互作用.該方法與中心復(fù)合設(shè)計(jì)法相比，具有試驗(yàn)次數(shù)少、節(jié)約成本的特點(diǎn)，還避免了由于正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)所引起的無(wú)法精確得到最佳點(diǎn)的問(wèn)題[10].

選擇pDNA-TCS-NPs粒徑和Zeta電位作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其制備工藝進(jìn)行改善.結(jié)果表明：在一定范圍內(nèi)，pDNA-TCS-NPs粒粒徑大小與巰基殼聚糖質(zhì)量濃度關(guān)系呈正相關(guān)，TCS質(zhì)量濃度高，高分子數(shù)目增多，增強(qiáng)了分子間凝聚作用，所以pDNA-TCS-NPs粒粒徑變大.在低質(zhì)量濃度TCS下，TPP質(zhì)量濃度變化對(duì)粒徑的影響不大；但在高質(zhì)量濃度下，納米粒粒徑隨著TPP質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系.因?yàn)樵诤线m的質(zhì)量濃度下，微粒間的接觸增加利于發(fā)生交聯(lián)，從而可通過(guò)調(diào)節(jié)TCS與TPP的質(zhì)量濃度來(lái)改變納米粒的粒徑.

TCS納米粒的電位則主要與溶液pH值有關(guān).納米粒電位隨著pH值的降低而增大，pH值較低時(shí)，聚合物電離程度高，便于其與TPP反應(yīng)，形成小粒徑納米粒.文中所制備的納米粒呈較為規(guī)則的球形，包封率良好，用于細(xì)胞和動(dòng)物模型均得到理想的實(shí)驗(yàn)預(yù)期，保證了體內(nèi)外的穩(wěn)定性.說(shuō)明該納米粒在口服基因領(lǐng)域的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，后期可研究其胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)機(jī)制.

[1] MENZEL C，BONENGEL S，De SOUSA I P，etal.Preactivated thiolated nanoparticles: A novel mucoadhesive dosage form[J].International Journal of Pharmaceutics，2015，497(1/2):123-128.DOI:10.1016/j.ijpharm.2015.11.037.

[2] HE Chunbai,YIN Lichen,TANG Cui，etal.Multifunctional polymeric nanoparticles for oral delivery of TNF-α siRNA to macrophages[J].Biomaterials，2013，34(11):2843-2854.DOI:10.1016/j.biomaterials.2013.01.033.

[3] HAMIDI M，AZADI A，RAFIEI P.Hydrogel nanoparticles in drug delivery[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2008，60(15):1638-1649.DOI:10.1016/j.addr.2008.08.002.

[4] Jr DUBENSK T W，LIU M A，ULMER J B.Delivery systems for gene-based vaccines[J].Molecular Medicine，2000，6(9):723-732.

[5] BERNKOP-SCHNüRCH A，GUGGI D，PINTER Y.Thiolated chitosans: Development andinvitroevaluation of a mucoadhesive， permeation enhancing oral drug delivery system[J].Journal of Controlled Release，2004，94(1):177-186.DOI:10.1016/j.jconrel.2003.10.005.

[6] F?GER F，SCHMITZ T，BERNKOPSCHNüRCH A.Invivoevaluation of an oral delivery system for P-gp substrates based on thiolated chitosan[J].Biomaterials，2006，27(23):4250-4255.DOI:10.1016/j.biomaterials.2006.03.033.

[7] 張南生，孫衛(wèi)軍，郭虹，等.Box-Behnken Design效應(yīng)面法在制劑處方優(yōu)化中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015,12(23):34-37.

[8] JIANG H L，KWON J T，KIM E M，etal.Galactosylated poly (ethylene glycol)-chitosan-graft-polyethylenimine as a gene carrier for hepatocyte-targeting[J].Journal of the Controlled Release Society，2008，131(2):150-157.DOI:10.1016/j.jconrel.2008.07.029.

[9] KWON O J,KANG E,CHOI J W,etal.Therapeutic targeting of chitosan-PEG-folate-complexed oncolytic adenovirus for active and systemic cancer gene therapy[J]. Journal of the Controlled Release Society，2013，169(3):257-265.DOI:10.1016/j.jconrel.2013.03.030.

[10] 王芳，翟文婷，李艷麗，等.Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化穿心蓮內(nèi)酯-PLGA微球處方研究[J].中草藥，2013，44(13):1743-1747.DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2013.13.009.

(責(zé)任編輯： 陳志賢英文審校： 劉源崗)

PreparationofpDNA-LoadedThiolatedChitosanNanoparticlesandOptimizationbyUsingBox-BehnkenDesignandResponseSurfaceMethod

ZENG Haoyue1， WANG Zhi2， FANG Meijuan3， WANG Liqiang1

(1. School of Biomedical Sciences， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China； 2. Department of Clinical Pharmacy， General Hospital of Lanzhou Military Command， Lanzhou 730000， China；3. School of Pharmaceutical Sciences， Xiamen University， Xianmen 361000， China)

10.11830/ISSN.1000-5013.201703054

2017-03-17

王立強(qiáng)(1970-)，男，教授，博士，主要從事藥劑學(xué)和藥物開發(fā)的研究.E-mail:wlq1599@163.com.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302652)； 福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015J01342)

R 944

A

1000-5013(2017)05-0676-06