錢鑫磊 周珊珊 張冬樂 梅 侶 劉 普*

（1合肥一六八中學(xué) 安徽合肥 230601 2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 安徽合肥 230601）

梨炭疽病是嚴重危害梨樹的一種真菌病害，主要危害果實，較少危害葉片、枝條，嚴重時可導(dǎo)致枝干枯死、早期落葉和果實腐爛[1］。近幾年，江西、浙江、安徽、江蘇、福建等南方砂梨產(chǎn)區(qū)因炭疽病造成的早期落葉也非常嚴重，部分產(chǎn)區(qū)因早期落葉造成的二次開花等致使梨園完全失去產(chǎn)量。目前生產(chǎn)上應(yīng)對炭疽病的防治策略主要側(cè)重于化學(xué)藥劑防治。常用的化學(xué)藥劑為波爾多液、代森錳鋅、三唑類殺菌劑及甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑等[2］。但化學(xué)殺菌劑危害人類健康，農(nóng)藥的使用量的增大，呈現(xiàn)出用藥量與病蟲害不斷遞加的惡性循環(huán)[3］。因此，探求一種新型、安全的手段替代現(xiàn)有的化學(xué)殺菌劑尤為重要。生防菌對人畜安全、環(huán)境兼容性好，使病原菌不易產(chǎn)生抗藥性，可有效減少果品中農(nóng)藥殘留量，正逐漸成為生產(chǎn)上抗病的新興力量[4］。

目前，國內(nèi)、外科研人員已經(jīng)分離篩選一些表型較好的生防芽孢桿菌，Arima等[5］首次發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可表現(xiàn)出抗病毒、抗支原體和一定程度的抗細菌活性，Liang等[6］發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌對葡萄孢菌有較好的抑制作用，其發(fā)酵液對該菌株的抑制率為 75.8%。但目前尚未發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在梨膠孢炭疽病上的相關(guān)報道，本文就梨生防菌的分離純化、篩選及16S r DNA菌種鑒定進行初步研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試梨品種 碭山酥梨，取自安徽省合肥市高新技術(shù)農(nóng)業(yè)園果樹實習(xí)基地。

1.2 供試菌株 膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹重點實驗室提供。

1.3 培養(yǎng)基 真菌選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、細菌選用LB培養(yǎng)基、放線菌選用改良高氏1號培養(yǎng)基。

1.4 菌株分離、純化和培養(yǎng)

1）一年生枝條及葉片內(nèi)生真菌的分離。

表面消毒：將實驗材料用流水沖洗后，轉(zhuǎn)至無菌工作臺，表面依次用75%酒精消毒1次（20 s）、無菌水漂洗1次。

病健分離：用滅菌手術(shù)刀切取病健交界處，枝條選擇木質(zhì)部，長約7～8 mm，寬約2～3 mm；葉片選擇病健交界處約邊長為5 mm的正方形小塊，小心貼置在PDA培養(yǎng)基上，封口后于25℃恒溫培養(yǎng)。

2）一年生枝條及葉片細菌的分離。將切取的組織依次用75%酒精、無菌水、次氯酸鈉、無菌水、無菌水浸泡3～5 s后，在無菌條件下，加入適量無菌水對組織進行無菌研磨后涂布于LB平板培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后挑取單菌落，接種于4 m LLB液體培養(yǎng)基中，160 r/min、28℃振搖 24 h 備用[7］。

3）土壤中微生物的分離。將取回的土壤稱取2.0 g溶解于100 mL無菌水中，依次將濃度稀釋度調(diào)至 10-1、10-2、10-3、10-4，各取 0.1 mL 用涂布棒均勻涂布于LB平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)[8］。

4）內(nèi)生真菌和細菌的純化。將分離微生物時接種的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)4～7 d，待組織周圍長出菌落后，真菌根據(jù)菌落長出時間的先后、形態(tài)和顏色，采用菌絲尖端挑取法及時挑取材料邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于新培養(yǎng)基上培養(yǎng)，不斷純化后置于4℃保存?zhèn)溆茫患毦?、放線菌純化用平板劃線法。

5）生防菌篩選。采用對峙生長法檢測分離得到的所有微生物對梨膠孢炭疽菌的抑制效果。病原菌膠孢炭疽病菌在PDA培養(yǎng)基、25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，沿菌落邊緣以6 mm滅菌打孔器打出菌餅置于空白PDA平板中心，在距平板邊緣25 mm處呈十字交叉形位置接相同直徑的菌餅，設(shè)空白對照，對照菌餅用直徑為6 mm的PDA培養(yǎng)基，每處理重復(fù)3次。待對照平板菌落將要長至平板邊緣時測各處理菌落直徑，計算抑制率。抑制率（%）＝（對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/（對照病原菌菌落直徑-6）×100。

6）拮抗放線菌發(fā)酵液的制備。拮抗放線菌接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基，25℃ 200 r/min培養(yǎng)48 h，將放線菌培養(yǎng)液于5 000 r/min離心10 min后，取上清為拮抗放線菌發(fā)酵液，用放線菌過濾器過濾后得到拮抗放線菌無菌發(fā)酵液。

7）常用殺菌劑和生防菌對病原菌抑菌活性的測定。在無菌工作臺配置PDA培養(yǎng)基并滅菌，待溫度降至50°C左右時按各藥劑推薦使用濃度（80%波爾多液可濕性粉劑400倍液、50%福美雙水分散粒劑700倍液、75%百菌清可濕性粉劑400倍液、3%噻霉酮400倍液）加入相應(yīng)數(shù)量藥劑混勻倒板，加入的生防菌發(fā)酵液濃度為1×109CFU/mL，每個PDA平板最終培養(yǎng)基體積約10 mL。待培養(yǎng)基冷凝后，采用內(nèi)徑為6 mm的打孔器取相同大小的梨膠孢炭疽菌菌餅，轉(zhuǎn)接到各處理的PDA培養(yǎng)基中心，重復(fù)3次，于25℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，以加入相同體積的無菌水為對照。每隔24 h觀察記錄一次、測量各處理菌落直徑，待對照板長滿時測量并計算各處理對菌絲生長的抑制率。吸取分生孢子濃度約為1.0×106個/mL的懸浮液20 μL滴于干凈的凹玻片上，再分別加入殺菌劑推薦使用濃度的2倍液、濃度為1×109CFU/mL的生防菌發(fā)酵液各20 μL，混勻，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對照以無菌水代替殺菌劑。培養(yǎng)12 h后，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計各處理下分生孢子萌發(fā)率[9］。

8）生防菌種屬鑒定。以提取的菌株基因組DNA為模板，采用16S區(qū)通用引物27F/1492R對獲得的菌株16S片段進行PCR擴增。引物27-F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3′；1492-R：5′－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′。 PCR 反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 90 s，34個循環(huán)；72℃ 7 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測得的rDNA-16S基因序列在NCBI網(wǎng)站上進行同源性Blast比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的分離與篩選 從采集的樣本中共分離到313株，分布比例為病葉、健葉、病枝、健枝、土壤，微生物在土壤、病葉、病枝分布較多。平板對峙實驗統(tǒng)計顯示微生物中拮抗能力較強的有3個，占0.96%；有拮抗能力的有15個，占4.79%；無拮抗能力的有295個，占94.25%。拮抗效果最好的為RT-30，因此選擇RT-30做了進一步的離體和活體抑菌效果研究（圖1）。

圖1 RT-30對梨膠孢炭疽病菌的拮抗作用

2.2 生防菌RT-30對梨炭膠孢疽病菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的抑制效果 同時培養(yǎng)6 d后發(fā)現(xiàn)，RT-30對炭疽病菌菌絲的抑制效果明顯高于80%波爾多液可濕性粉劑400倍液，接近于400倍液的75%百菌清可濕性粉劑，在前3 d對炭疽病菌菌絲的抑制效果趨于一致，菌絲在第4～6天幾乎停止生長，在加入RT-30的培養(yǎng)基中，盡管菌落直徑擴大，但菌絲生長力極弱（圖2）。

圖2 RT-30對梨膠孢炭疽病菌菌落生長的抑制作用

RT-30和不同殺菌劑對膠孢炭疽病菌菌絲的生長抑制作用有顯著差異，RT-30的抑制率達到65.50%，明顯高于抑制率為21.86%的80%波爾多液可濕性粉劑400倍液；通過對膠孢炭疽病菌分生孢子各處理發(fā)現(xiàn)，3%噻霉酮300倍液處理下的孢子萌發(fā)率為0%，說明該藥劑對膠孢炭疽菌分生孢子的萌發(fā)起著極為明顯的抑制作用，50%福美雙可濕性粉劑700倍液、75%百菌靈可濕性粉劑400倍液和RT-30對炭疽病孢子的萌發(fā)一定的抑制效果，均與清水對照差異顯著（表1）。

表1 殺菌劑與生防菌RT-30對膠孢炭疽病菌菌絲生長的抑制作用

2.3 拮抗細菌的種屬鑒定 序列比對結(jié)果顯示，拮抗菌 RT-30的 16S rDNA序列與Bacillus methylotrophicusMo-Bm HQ325853同屬一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)比較可以得出RT-30為Bacillus methylotrophicus。

3 討論

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus是Madhaiyan等[10］自水稻根系土壤中分離得到的芽孢桿菌屬新成員；呂倩等[11］首次從海洋中分離得到，并證實此菌具備較強抑制黃瓜炭疽病菌等病原真菌活性的能力，有防治作物真菌病害的利用潛質(zhì)；采俊香等[12］在抱莖苦荬菜中分離出了甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，其抗菌蛋白對番茄早疫病、梨黑斑病和番茄灰霉病具有較好抑制效果，抑菌率分別為 88.3%、90.5%和 95.4%；莊春等[13］在進行該菌可濕性粉劑防治水稻細菌性條斑病的田間藥效試驗中發(fā)現(xiàn)，在濃度為1 800 g/hm2時，對此病的病指防效為61.8%，防效極顯著高于50%氯溴異氰脲酸可溶性粉劑。目前，以甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌為主要活性成分的生防制劑（甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌9912，華北制藥集團愛諾有限公司）已被開發(fā)成產(chǎn)品防治黃瓜灰霉病，并于2015年12月獲得了登記。

本研究離體抑菌結(jié)果表明RT-30具有明顯抑制菌落生長的活性，通過與普通藥劑比較實驗，顯示RT-30可以抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)，因此，具有潛在商業(yè)使用價值。前人研究顯示甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌具有分泌抗菌性活性物質(zhì)酯肽的能力。酯肽已被證實具有抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)的能力，相比于化學(xué)合成農(nóng)藥，酯肽具有易降解、環(huán)境友好等特點[11－12］。 目前，還未見甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在防治梨樹病害的相關(guān)報道，本研究明確了甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對梨樹炭疽病的防治作用并與常用藥劑比較了可能的作用機理，為下一步的抗菌機制、定殖部位和能力、田間藥效、發(fā)酵和劑型開發(fā)等提供了基礎(chǔ)，也為炭疽病的防治提供了新的思路。