羅玉娥 黎杰強 何風華 高 峰

（華南師范大學生命科學學院 廣東廣州 510631）

0 前言

唾腺染色體（salivary gland chromosome）是一種具多線性的巨大染色體，因最早在雙翅目昆蟲的唾腺細胞中發(fā)現(xiàn)而得名，又稱多線染色體（polytene chromosome）。雙翅目昆蟲的唾腺細胞分化并發(fā)育到一定階段后就不再分裂，而染色體不斷復制，且復制后得到的新染色線與原來的染色體平行排列，最終形成約1 000拷貝的巨型染色體。其長度是有絲分裂中期染色體的150多倍[1］，在顯微鏡下清晰可見。雙翅目幼蟲體細胞含4對染色體，但在其唾腺細胞中只觀察到4條染色體，這是因為唾腺細胞發(fā)生了體細胞同源染色體聯(lián)會現(xiàn)象，1對同源染色體緊密配對形成1條染色體。經(jīng)染色后，多線染色體呈一系列明、暗帶相間的橫紋。每條染色體上橫紋的寬窄、數(shù)目、排列順序及疏密程度都因物種不同而異[2］。多線染色體上的疏松區(qū)域稱為“蓬突”或“泡”，與基因表達緊密相關。除了唾腺，多線染色體也存在于雙翅目昆蟲的馬氏管、腸、脂肪體等組織中；纖毛蟲類的大核原基、被子植物的胚乳以及彈尾目、鱗翅目和直翅目的某些特定細胞中也曾發(fā)現(xiàn)巨大染色體[3］。由于巨大的形態(tài)結(jié)構(gòu)，多線染色體已被廣泛應用于生物的細胞遺傳、系統(tǒng)分類、基因的定位和克隆及基因結(jié)構(gòu)的研究[4］。

本實驗采用雙翅目的黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）幼蟲為實驗材料。黑腹果蠅具有體型小、易飼養(yǎng)、繁殖快、性狀表現(xiàn)極豐富等特點，使其成為奠定經(jīng)典遺傳學基礎的重要模型生物之一[5］。多線染色體的研究實驗常以果蠅幼蟲為材料，除了上述原因外，還因為果蠅幼蟲的唾腺易獲取、唾腺染色體巨大、數(shù)量少（2n=8）、橫紋清晰等優(yōu)點。

在我國，自1983年劉凌云[6］發(fā)表多線染色體制片方法的報道以來，陸續(xù)有不少研究者探討制備方法的改進，試圖獲得更清晰的染色效果、更舒展的染色體臂等。但鮮有報道果蠅唾腺染色體臂的識別、基因突變對染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響等內(nèi)容。有鑒于此，本文描述了果蠅唾腺染色體臂的識別、3種品系果蠅唾腺染色體的比較等，主要目的是：確認有效的唾腺染色體辨認方法；研究基因突變對唾腺染色體橫紋的寬窄、數(shù)目、排列順序及疏密程度的影響；為實驗教學提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗所用的3種黑腹果蠅為野生型果蠅（18號）、黑檀體果蠅（e號）和三隱性果蠅（6號），果蠅的表現(xiàn)性狀見表1，果蠅突變性狀見表2。

表1 3種品系果蠅的表現(xiàn)性狀

表2 3種品系果蠅的突變性狀

1.2 方法

1.2.1 玉米-瓊脂培養(yǎng)基的配制[7］

1）A 液：取糖 62g，瓊脂 6.2 g，水 380 mL，煮沸溶解。

2）B 液：取玉米粉 82.5 g，水 380 mL，攪拌溶解。

3）A、B液混合加熱，煮沸成糊狀，加 0.5 mL丙酸，稍冷卻后加入20片研磨成粉狀的酵母。

4）分裝至 50 mL錐形瓶，高度約 1.5～2 cm，覆兩層紗布，用橡皮筋綁緊。

5）冷卻后放入5℃冰箱低溫保存。

1.2.2 果蠅的培養(yǎng)

1）取裝有培養(yǎng)基的錐形瓶6個置于烘箱中，打開通風口和開關，當溫度升至60℃關閉開關和通風口。

2）5 h后，取出錐形瓶，進行果蠅接種。

3）18號、e號和6號各接種2個錐形瓶，每個錐形瓶約15只果蠅，貼上注明品系號、接種日期的標簽。

4）放入恒溫箱中培養(yǎng)，溫度設置為23～25℃。

5）3～4 d后，移出錐形瓶中的果蠅。

6）7～9 d后，陸續(xù)有乳白色幼蟲爬上瓶壁，挑選肥大的幼蟲進行實驗。

1.2.3 果蠅幼蟲唾腺染色體標本的制備[7］

1）腺體剖?。哼x取蟲體肥大的3齡幼蟲，置于載玻片上，加幾滴0.7%生理鹽水，在雙目解剖鏡下左手持解剖針壓住蟲體中后部，右手持解剖針按住頭部，輕輕向前拉動，使頭部扯離蟲體，從而拉出唾腺。腺體呈透明囊狀結(jié)構(gòu)，位于食管兩側(cè)；腺體側(cè)常有乳白色脂肪體，應盡量剔除。

2）解離：載破片上僅留腺體，用吸水紙小心吸去生理鹽水，加1滴1 mol/L HCl，解離2～3 min。

3）染色：用吸水紙吸去鹽酸，加1滴蒸餾水輕輕沖洗后吸干。加2滴醋酸洋紅或改良品紅染液，染色10～20 min。

4）壓片：換上新鮮染液，蓋上蓋玻片，用吸水紙輕輕覆蓋玻片。左手固定蓋玻片，右手先用手指垂直輕壓蓋玻片，再用鉛筆的橡皮頭或解剖針垂直輕敲，或進一步用拇指在蓋玻片上適當用力壓片，注意勿使蓋玻片移動。

5）鏡檢：在低倍鏡下找到分散良好的標本，移至視野中央，轉(zhuǎn)到高倍鏡下觀察。對染色體分散、橫紋清晰的片子進行拍照。

1.2.4 不同果蠅幼蟲唾腺染色體的比較 挑選橫紋清晰、不變形、染色體臂較為完整的圖片，與Lefevre繪制的果蠅唾腺染色體臂的照片圖譜（網(wǎng)址：http://flybase.org/maps/chromosomes/maps.html）進行對照，辨認不同染色體臂，并對3種品系果蠅的唾腺染色體進行比較，重點比較突變基因所在區(qū)域的橫紋的寬窄、數(shù)目、疏密和排列順序。利用Adobe Photoshop的標尺工具，在同一放大倍數(shù)下，測量突變基因所在橫紋的寬度及突變基因所在區(qū)域的長度，并計算相對寬度。比較突變基因所在區(qū)域的橫紋的疏密程度時，利用Adobe Photoshop在同一放大倍數(shù)下測量突變基因所在橫紋與左、右最近2條橫紋的距離，求相對距離。突變基因所在橫紋距離靠近端粒端（即游離端）的最近一條橫紋的距離，簡稱為距端距離；突變基因所在橫紋距離靠近染色中心的最近一條橫紋的距離，簡稱為距心距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 果蠅幼蟲唾腺染色體臂的辨認 辨認果蠅幼蟲唾腺染色體臂的最常用方法，是根據(jù)染色體臂端粒端的形態(tài)特征進行辨認，染色體臂幾種常見形態(tài)見圖1（本文附圖見插頁1）。在6條臂中，第Ⅳ染色體臂（圖 1-o，1-p，1-q）最短，橫紋難以看清，形態(tài)似乎也在變化，臂充分伸展時可在染色中心附近觀察到。5條長臂中，第Ⅰ染色體（X染色體）1條臂，第Ⅱ、第Ⅲ染色體各自2條臂，分別記為 2L、2R 和 3L、3R。

X 染色體臂（圖 1-a，1-b，1-c）頭部像一個彈頭，彈頭下方有一個永久性蓬突（圖中箭頭所指），是辨認X染色體的最突出特征。2L（圖1-d，1-e）頭部散開呈扇狀，端粒端有6條深染橫紋，其中如圖標示的2、3、4位置上的橫紋較寬。對于2R、3L和3R端粒端，筆者均發(fā)現(xiàn)有2種形態(tài)。2R第1種形態(tài)（圖1-f，1-g）頭部呈圓弧形，末端可清晰看到1條深染的較寬橫紋；第2種形態(tài)（圖1-h）頭部呈截斷狀，末端有1條深染的較細橫紋。但2R 2種形態(tài)的端粒端均有5條深染橫紋（圖標1-5橫紋），其后有2條淺染橫紋（圖標6、7橫紋）。3L第 1種形態(tài)（圖 1-i，1-j）頭部像一頂僧帽，在帽頂（圖標A）有1條細橫紋和1條較粗橫紋，帽檐（圖標B）有1條細橫紋，在圖標1-6位上固定有6條深染橫紋；第2種形態(tài)（圖1-k）頭部呈扇形，在圖標1、3、5及6位上為深染橫紋，在圖標2、4位上為淺染橫紋。3R第1種形態(tài)（圖1-l，1-m）頭部呈扇形，第2種形態(tài)（圖1-n）頭部呈截斷狀，且末端有1條深染橫紋。3R 2種形態(tài)在圖標1處均有1條虛線狀的橫紋，其后有4條深染橫紋，圖標2、3和4、5位的橫紋分別排列得較緊密。

2R第2種形態(tài)與3R第2種形態(tài)在光學顯微鏡下觀察十分相似，兩者區(qū)別：1）3R頭部有一虛線狀橫紋，2R在相應位置上沒有。2）2R在圖標1、2、3、4位上的橫紋排列勻稱，橫紋之間距離接近，圖標5處橫紋與圖標4處的橫紋排列緊湊，而3R在圖標2、3及4、5處的橫紋形成2對排列緊湊的橫紋。

2.2 3種品系果蠅幼蟲唾腺染色體臂橫紋的比較 18號（圖 2-a）、e號（圖 2-b）和 6號（圖 2-c，2-d）果蠅唾腺染色體都具有染色中心，都由染色中心延伸出6條臂，其中5條長臂和1條短臂。

參照Lefevre繪制的果蠅唾腺染色體臂照片圖譜的分區(qū)方法[8］，e號果蠅的突變基因 e位于93C7-93D1（圖3-a）。比較e號與 18號果蠅93區(qū)的橫紋數(shù)和排列順序，兩者從左到右依次為3條深染帶、4條淺染帶、2條深染帶。由表3～表5可知，e號果蠅突變基因所在橫紋的寬度及相對距端、相對距心距離與18號果蠅不存在顯著性差異。

6號果蠅的突變基因w、Sn3及m分別位于3B6（圖 3-b）、7D1-7D2（圖 3-c）、10E1-10E2（圖 3-d）。6號與18號果蠅的3區(qū)從左至右依次有1條深染帶、1條淺染帶、1條粗深染帶、2條深染帶、3條淺染帶；7區(qū)從左至右依次有4條深染帶、2條淺染帶、2條深染帶；10區(qū)從左到右依次有2條深染帶、5條淺染帶。由表3～表5可知，6號果蠅3個突變基因各自所在橫紋的寬度及相對距端、相對距心距離與18號果蠅均無顯著差異。

表3 3種品系果蠅突變基因所在橫紋的相對寬度的平均值（x±s，*P<0.05）

表4 3種品系果蠅突變基因的相對距端距離的平均值（x±s，*P<0.05）

表5 3種品系果蠅突變基因的相對距心距離的平均值（x±s，*P<0.05）

3 討論

3.1 果蠅幼蟲唾腺染色體臂的辨認 多線染色體橫紋的寬窄、數(shù)目、排列順序及疏密程度都具有物種特異性，果蠅不同染色體臂的橫紋也各有特色，且染色體臂末端易壓散，故通過辨認染色體臂的端粒端確認各染色體是最常用也最便捷的方法?？焖僬莆沾朔ǖ募记墒窍却挚丛偌毧?，先粗略觀察端粒端的整體形態(tài)，確定可能與之對應的染色體臂，再與照片圖譜進行橫紋的一一對應，最終確定染色體臂名稱。結(jié)合照片圖譜多練習幾次后便能熟練掌握，快速辨認各染色體臂。

果蠅5條長臂的端粒端一般各自有幾種不同的形態(tài)，但端粒端的橫紋特征基本是恒定的，這與楊大翔[9］的結(jié)論相同。同一染色體臂末端出現(xiàn)不同形態(tài)，可能是受幼蟲齡期和壓片角度、力度等影響。

在末端模糊不可辨認時，也可從近染色中心處，或選取染色體臂上橫紋清晰的具突出特征的2～3個區(qū)域，與照片圖譜比對，進而確認染色體臂名稱。染色體上的蓬突和縊縮是幫助確認的重要特征，可由此2處出發(fā)向左或向右選取幾個區(qū)域進行比對。

3.2 3種品系果蠅幼蟲唾腺染色體臂橫紋的比較 3種品系黑腹果蠅，體細胞染色體數(shù)目為2n=8，18號為野生型果蠅，性狀表現(xiàn)為灰體、紅眼、長翅、直剛毛；e號為黑檀體果蠅，位于第3對染色體右臂（3R）一對等位基因發(fā)生隱性突變，體色性狀表現(xiàn)為烏木色、黑亮；6號為三隱性果蠅，即位于X染色體上控制眼色、翅長、剛毛的3對基因發(fā)生隱性突變，性狀表現(xiàn)為白眼、短小翅、焦剛毛。

實驗結(jié)果表明，3種品系果蠅幼蟲在唾腺染色體橫紋的寬窄、數(shù)目、排列順序及疏密程度上不存在明顯的差異（圖 3、表 3～表 5）。原因：1）少數(shù)幾個基因的突變不足以引起染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。基因是具有遺傳效應的DNA片段，DNA分子與蛋白質(zhì)纏繞形成染色質(zhì)絲，染色質(zhì)絲上不同區(qū)域發(fā)生不同程度的螺旋，聚合成染色粒，上千拷貝的染色粒隨著上千染色質(zhì)絲平行排列而整齊排列，故經(jīng)染色后呈現(xiàn)出寬窄不一的橫紋?；蛲蛔兪怯蓧A基對的替換、增添和缺失而形成的基因結(jié)構(gòu)的改變。少數(shù)幾個堿基對的改變可能并不影響染色粒的形成及染色質(zhì)絲的排列，故3種品系果蠅幼蟲的唾腺染色體在形態(tài)上無明顯差別。2）3種品系果蠅幼蟲唾腺染色體的橫紋、疏松區(qū)可能在不同齡期幼蟲中存在差異，但3齡幼蟲時這種差異不存在，是否如此有待進一步研究。3）3種品系果蠅在3齡幼蟲的唾腺染色體中可能存在微細差異，但僅通過形態(tài)、結(jié)構(gòu)的觀察并不能發(fā)現(xiàn)，可結(jié)合分子生物學技術(shù)等進行更深入研究。

4 結(jié)論

本文結(jié)論主要有以下2點。

1）果蠅唾腺染色體臂端粒端的橫紋特征基本恒定，是辨認各染色體臂的最便捷方法。此外，蓬突和縊縮也是辨認多線染色體的重要特征。

2）18號與e號、6號果蠅幼蟲，在唾腺染色體橫紋的寬窄、數(shù)目、排列順序及疏密程度上不存在明顯的差異，在不同變種之間無法區(qū)分。