李志強 張建平△ 路文革 李玉林 楊 碩 賀顯君 馬 瑜 徐忠海 代全德 趙 明

1)商丘市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 商丘 476100 2)河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450000 3)商丘市第一人民醫(yī)院血液內(nèi)科，河南 商丘 476100

·論著科研之窗·

氯吡格雷對不同CYP2C19基因分型腦梗死患者的影響

李志強1)張建平1)△路文革1)李玉林2)楊 碩3)賀顯君1)馬 瑜1)徐忠海1)代全德1)趙 明1)

1)商丘市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 商丘 476100 2)河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450000 3)商丘市第一人民醫(yī)院血液內(nèi)科，河南 商丘 476100

氯吡格雷；CYP2C19；腦梗死；CD62P；PAC-1

氯吡格雷是血小板二磷酸腺苷(ADP)受體拮抗劑，可作為阿司匹林不耐受缺血性卒中急性期的初始用藥，且是缺血性腦卒中二級預(yù)防的一線用藥[1]，但其對缺血性腦卒中患者的療效存在差異，大多數(shù)患者應(yīng)用氯吡格雷后缺血性腦卒中可得到有效治療和預(yù)防，而仍有部分急性期缺血性腦卒中患者應(yīng)用氯吡格雷病情仍會加重，確切機制尚不清楚，但已經(jīng)有研究表明，CYP2C19基因多態(tài)性是其發(fā)生的一個重要機制。急性腦梗死的一個重要病理為血小板活化，因此抗血小板治療是目前臨床治療腦梗死的重要方法。血小板活化依賴性顆粒膜蛋白PAC-1 和CD62P 是目前檢測血小板活化程度和功能狀態(tài)的特異性指標。本研究探討氯吡格雷對不同CYP2C19基因分型腦梗死患者血小板CD62P、PAC-1表達和NIHSS評分的影響，探討CYP2C19基因形態(tài)對氯吡格雷治療腦梗死療效的影響。

1 材料與方法

1．1研究對象選取2016-12—2017-03 商丘市第一人民醫(yī)院收治的急性腦梗死患者56例，入選標準：(1)符合以2014年《中國急性缺血性腦卒中診治指南》之急性腦梗死診斷標準；(2)存在阿司匹林禁忌或服用阿司匹林不能有效預(yù)防腦梗死；(3)漢族，年齡40～80 歲；(4)無氯吡格雷應(yīng)用禁忌證；(5)簽定知情同意書。排除標準：(1)合并腦實質(zhì)出血、梗死后滲血或蛛網(wǎng)膜下腔出血者；(2)伴有心房顫動、凝血功能異常、血管畸形、嚴重心肝腎疾病史；(3)14 d內(nèi)應(yīng)用抗血小板藥物者；(4)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)評分>15 分的病情危重患者。

1．2主要儀器和試劑梯度PCR儀(PCYL200，Thermo公司)、核酸蛋白分析儀(Pharmacia-Amersham公司)、凝膠成像分析系統(tǒng)(AlphaMaster公司)、EPICS-XL 型流式細胞儀 (美國Beckman coulter公司)、PAC-1 阻斷劑(RGDS)，(美國 BD 公司)、Ig G1PE 熒光抗體 (美國 BD 公司)、PAC-1-FITC 抗體(抗纖維蛋白原受體的單克隆抗體，以異硫氰熒光標記)、CD62P-PE 抗體(小鼠抗人 CD62P 單克隆抗體，以藻紅蛋白標記、CD61-Per CP抗體(抗血小板 GPIIIa 單克隆抗體，以多甲藻素葉綠素蛋白標記) (美國 BD 公司)；2×Taq PCR Master Mix購自上海萊楓生物科技有限公司，DNA Marker、瓊脂糖、SmaⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶均購買自大連寶生物工程有限公司，飽和酚、氯甲烷、無水乙醇等均購自北京鼎國生物科技有限公司。

1．3研究方法

1．3．1 治療方法：所有患者均于第1天給予氯吡格雷300 mg，以后每日給予75 mg，連續(xù)14 d。允許的伴隨用藥：腦血管病危險因素的干預(yù)治療都是允許的。禁忌的伴隨治療：包括阿司匹林在內(nèi)的其他抗血小板聚集藥物；非甾體抗炎藥；所有肝素類藥物；口服抗凝藥物；質(zhì)子泵抑制劑等。

1．3．2 CYP2C19基因分型和患者分組和治療方法：于氯吡格雷用藥前應(yīng)用枸櫞酸抗凝管采取肘靜脈血3 mL用于基因分型，CYP2C19基因分型采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性( PCR-RFLP) 進行基因分型，具體方法見文獻[3]

根據(jù)CYP2C19基因形態(tài)擬分為快代謝組(即CYP2C19*1/*1，EM組)，中代謝組(包括CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3，IM組)，慢代謝組(包括CYP2C19 2*2，CYP2C19 2*3和CYP2C19 3*3，PM組)。

1．3．3 流式細胞檢測PAC-1、CD62P的表達水平：分別于氯吡格雷用藥前、用藥后7 d和14 d同一時間點取肘靜脈血3 mL備用，進行樣本固定處理后應(yīng)用流式細胞儀檢測血小板表面PAC-1、CD62P的表達水平，結(jié)果通過軟件獲取，以陽性血小板的百分比表示。

1．3．4 NIHSS評分：所有患者均于氯吡格雷治療前、治療后7 d、14 d后進行標本采集和采用NIHSS 對患者的神經(jīng)功能缺損程度進行評分。

2 結(jié)果

56例患者根據(jù)CYP2C19基因分型結(jié)果被分成為EM組21例(CYP2C19*1/*1，21例，占37.5%)，IM組27例( 包 括 CYP2C19*1/*2 19例、 CYP2C19*1/*3 8例，共占48.2%)，PM組8例(包括CYP2C19 2*2 6例，CYP2C19 2*3 1例和CYP2C19 3*3 1例，共占14.3%)。

2．1 3組腦梗死患者基線資料比較3組患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病史等一般資料均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2．2 3組腦梗死患者氯吡格雷應(yīng)用前、應(yīng)用后第7天和第14天血小板CD62P表達的比較3組患者治療前CD62P表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療7 d后，EM組，IM組的CD62P均顯著低于同組療前(P<0.05)；PM組的CD62P低于同組療前，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療14 d后，EM和IM組的CD62P均顯著低于同組療前和治療后7 d(P<0.05)；PM組的CD62P低于同組治療前(P<0.05)，也低于治療后7 d，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，第7天時，PM組的CD62P高于EM組CD62P表達水平(P<0.05)，IM組的CD62P高于EM組CD62P表達水平，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，第14天時，PM組和IM組的CD62P均高于EM組CD62P表達水平(P<0.05)。見表2。

表1 3組腦梗死患者基線資料比較

表2 3組腦梗死患者氯吡格雷應(yīng)用前、應(yīng)用后第7天、14天血小板CD62P的比較

注：與用藥前比較，*P<0.05；與用藥前比較，#P>0.05；與用藥后7 d比較，*P<0.05；與用藥后7 d比較，▽P>0.05；與EM組比較，◆P<0.05

2．3 3組腦梗死患者氯吡格雷應(yīng)用前、應(yīng)用后第7天和第14天血小板PAC-1表達的比較3組患者治療前PAC-1表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療7 d后，EM組，和IM組的PAC-1均顯著低于同組治療前(P<0.05)；PM組的PAC-1低于同組療前，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療14 d后，EM組和IM組的PAC-1均顯著低于同組療前和治療后7 d(P<0.05)；PM組的PAC-1低于同組療之前(P<0.05)，也低于治療后7 d，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，第7天時和第14天時，與EM組相比，IM組和PM組的PAC-1均高于EM組PAC-1表達水平(P<0.05)。見表3。

2．4 3組腦梗死患者氯吡格雷應(yīng)用前、應(yīng)用后第7天和第14天血小板NIHSS評分比較3組患者治療前NIHSS評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療7 d后，EM組和IM組NIHSS評分均顯著低于同組療前(P<0.05)；治療14 d后，EM組、IM組和PM組的NIHSS評分均顯著低于同組治療前(P<0.05)，EM組、和IM組的NIHSS評分均顯著低于同組治療后7 d(P<0.05)；第7天和第14天時，PM組的NIHSS評分均高于EM組NIHSS評分(P<0.05)。見表3。

表3 3組腦梗死患者氯吡格雷應(yīng)用前、應(yīng)用后第7天、14天血小板PAC-1與NIHSS評分比較

注：與用藥前比較，*P<0.05；與用藥前比較，#P>0.05；與用藥后7 d比較，*P<0.05；與用藥后7 d比較，▽P>0.05；與EM組比較，◆P<0.05

3 討論

國內(nèi)外的多項研究顯示CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抗血小板聚集反應(yīng)具有相關(guān)性[4-6]，與中國漢族人群基因相近的日本和韓國人群的研究也有類似的結(jié)果[8-9]。PAC-1和CD62P作為血小板早期和晚期活化的標志性指標。不僅能反映腦梗死早期血小板活化狀態(tài)，還能反映腦梗死患者病情的嚴重性[10]。有研究顯示急性腦梗死血小板活化標志物 PAC-1和CD62P等表達增加，臨床可以把血小板活化指標PAC-1 、CD62P作為急性腦梗死嚴重程度的監(jiān)測、療效觀察及預(yù)后判斷的重要參考指標[14]。全血流式細胞術(shù)已廣泛用于血小板激活物檢測[15]，由于其快速和經(jīng)濟，因此適于臨床應(yīng)用。本研究采用流式細胞術(shù)檢測腦梗死患者血小板PAC-1 、CD62P表達，該技術(shù)能靈敏、特異地檢測血液中活化血小板，并評價其功能。

本實驗中CYP2C19 基因快代謝、中等代謝和慢代謝在中國腦梗死患者中的分布頻率分別為 37.5%、48.2%和14.3%，與Zhu等[16]報道的CYP2C19 基因快代謝、中等代謝和慢代謝在中國腦梗死患者中的分布頻率(分別為：38.79%，51.51%和9.70%)大致相符。本研究還顯示：氯吡格雷對不同CYP2C19基因代謝型的腦梗死的患者血小板CD62P、PAC-1表達的影響程度不同，這提示檢測CYP2C19基因形態(tài)有助于判定氯吡格雷對腦梗死患者的療效。然而也有相反的研究報道[12]，這提示CYP2C19 功能缺失基因是否引起氯吡格雷抵抗還需要進一步研究確認。

綜上所述，本研究認為氯吡格雷對于腦梗死患者的療效可能與CYP2C19基因形態(tài)相關(guān)，臨床上對于攜帶CYP2C19 功能缺失基因(即CYP2C19*2和*3 等位基因)的患者，可以考慮使用其他抗血小板的藥物是加大氯吡格雷的使用劑量。同時本實驗具有一定局限性，需要大樣本、多中心、 長時間隨訪的隨機對照試驗研究進一步確認。

[1] Kernan WN，Ovbiagele B，Black HR，et al．Guidelines for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack：a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association[J]．Stroke，2014，45(7)：2 160-2 236．

[2] 中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會，中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組，劉鳴，蒲傳強．中國急性缺血性腦卒中診治指南2014[J]．中華神經(jīng)科雜志，2015，(4)：246-257．

[3] 申明惠，王曉飛，劉敏，等．河南漢族CYP2C19基因多態(tài)性對氯吡格雷藥物代謝動力學(xué)的影響[J]．鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2016，51(1)：95-99．

[4] Howell LA，Stouffer GA，Polasek M，et al．Review of clopidogrel dose escalation in the current era of potent P2Y12 inhibitors[J]．Expert Rev Clin Pharmacol，2015，8(4)：411-421．

[5] Liu R，Zhou ZY，Chen YB，et al．Associations of CYP3A4，NR1I2，CYP2C19 and P2RY12 polymorphisms with clopidogrel resistance in Chinese patients with ischemic stroke[J]．Acta Pharmacol Sin，2016，37(7)：882-888．

[6] Liu X，Luo Y，Lai Y，et al．Effect of genetic and coexisting polymorphisms on platelet response to clopidogrel in Chinese Han patients with acute coronary syndrome[J]．J Genet，2016，95(2)：231-237．

[7] Wang Y，Zhao X，Lin J，et al．Association Between CYP2C19 Loss-of-Function Allele Status and Efficacy of Clopidogrel for Risk Reduction Among Patients With Minor Stroke or Transient Ischemic Attack[J]．JAMA，2016，316(1)：70-78．

[8] Silva FB，Almeida JGL，Neno A，et al．Resistance to clopidogrel：prevalence and associate variables[J]．Arq Bras Cardiol，2012，99(6)：1 135-1 141．

[9] Kaikita K，Ono T，Iwashita S，et al．Impact of CYP2C19 polymorphism on platelet function tests and coagula-tion and inflammatory biomarkers in patients undergo-ing percutaneous coronary intervention[J]．J Atheros-cler Thromb，2014，21(1)：64-76．

[10] 蒙緒卿，廖小平，龍志剛．PAC-1和CD62P在腦梗死急性期的表達[J]．國外醫(yī)學(xué)(腦血管疾病分冊)，2005，13(11)：860-863．

[11] Zhu WY，Zhao T，Xiong XY，et al．Association of CYP2C19 Polymorphisms with the Clinical Efficacy of Clopidogrel Therapy in Patients Undergoing Carotid Artery Stenting in Asia[J]．Sci Rep，2016，6：25478．

[12] Choi IJ，Koh YS，Park MW，et al．CYP2C19 loss-of-function alleles are not associated with clinical outcome of clopidogrel therapy in patients treated with newer-generation drug-eluting stents[J]．Medicine (Baltimore)，2016，95(26)：e4 049．

(收稿2017-05-03)

責(zé)任編輯：王喜梅

EffectofclopidogrelonplateletCD62P，PAC-1expressionandNIHSSscoreinpatientswithischemicstrokeofdifferentCYP2C19genotypes

LiZhiqiang*，ZhangJianping，LuWenge，LiYulin，YangShuo，HeXianjun，MaYu，XuZhonghai，DaiQuande，ZhaoMing

*DepartmentofNeurology，theFirstPeople'sHospitalofShangqiu，Shangqiu476100，China

ObjectiveTo observe the effect of clopidogrel on platelet CD62P，PAC-1 expression and NIHSS score in patients with cerebral infarction of different CYP2C19 genotypes．Methods56 patients with cerebral infarction were divided into 3 groups according to CYP2C19 genotype；The therapeutic course for all were 2 weeks． The expression of platelet CD62P，PAC-1 and NIHSS score were detected or examined in 5 groups before and after treatment．ResultsThere was no significant difference in CD62P，PAC-1 expression and NIHSS score between the 3 groups before treatment．The levels of CD62P，PAC-1 and NIHSS on 7 days in EM group and IM group after clopidogrel treatment were significantly lower than those before treatment (P<0.05)．The levels of CD62P，PAC-1 and NIHSS on 7 days in PM group were lower than those before treatment，but there was no statistical difference (P>0.05)；The levels of CD62P，PAC-1 and NIHSS on 14 days in EM group and IM group were significantly lower than those before treatment (P<0.05)，and also lower than those on 7 days after clopidogrel treatment (P<0.05)；The levels of CD62P，PAC-1 and NIHSS on 14 days in PM group were significantly lower than those before treatment (P<0.05)，and also lower than those on 7 days after clopidogrel treatment，but there was no significant difference (P>0.05)；The levels of CD62P，PAC-1 and NIHSS in PM group were higher than those in EM group (P<0.05)．ConclusionCYP2C19 genetypes may be an important factor that can afect the clinical therapeutic effects of clopidogrel in patients with ischemic stroke．

Clopidogrel；CYP2C19；ischemic stroke；CD62P；PAC-1

R743.33

A

1673-5110(2017)18-0026-04

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.18.008

河南省科技廳科技攻關(guān)項目(NO：152102310029)

△通信作者：張建平(1960—)，本科，主任醫(yī)師。研究方向：神經(jīng)內(nèi)科疾病。Email：sq621021@163.com